汪洋[1]2016年在《防龋DNA疫苗pVAX1-SG在小鼠体内分布和表达规律的实验研究》文中指出目的:观察口服型防龋DNA疫苗pVAX1-SG经灌胃途径免疫BALB/c小鼠后目的基因在各组织器官的分布和表达,为评价防龋效果提供理论依据。方法:66只BALB/c小鼠,6-8周龄健康雌性,体重18-22g,随机分为实验组30只,空载体对照组和空白对照组各18只。重组质粒pVAX1-SG和空载体质粒pVAX1的鉴定和大量抽提。经温敏型水凝胶包裹重组质粒pVAX1-SG制备免疫用口服型防龋DNA疫苗。实验组经灌胃途径接种包裹温敏型水凝胶的重组质粒pVAX1-SG,空载体对照组经灌胃途径接种包裹温敏型水凝胶的空载体质粒pVAX1,空白对照组不做任何处理。共免疫2次,每次间隔2周,免疫剂量为每次100μg。于小鼠第2次免疫后的第1,2,7,15,30,60天,分别称重,后处死小鼠,取小鼠的心、肝、脾、肺、肾、脑、胃、颌下腺、小肠、生殖器官,利用实时荧光定量PCR检测各组织器官中pVAX1-SG的分布及表达情况。取小鼠第2次免疫后第60天的心、肝、脾、肺、肾、和小肠进行组织病理学检查。取小鼠第2次免疫后第7天小肠与颌下腺组织,免疫组织化学二步法检测免疫部位小肠组织和颌下腺组织的目的蛋白表达情况。结果:1:经实时荧光定量PCR检测,给药后第1-60天在小鼠体内均可检测到pVAX1-SG的DNA,但各个组织器官间的DNA拷贝数分布存在差异,免疫后第1天pVAX1-SG分布最多的器官是生殖器官,为(3.08E+08)±(0.92E+08)拷贝数/ml,第2天是肝脏,为(2.31E+09)±(0.18E+09)拷贝数/ml,第7天和第15天是心脏,分别为(3.49E+07)±(0.27E+07)拷贝数/ml和(7.96E+07)±(0.54E+07)拷贝数/ml,第30天是颌下腺,为(9.32E+08)±(0.27E+08)拷贝数/ml,第60天则是脾脏,为(3.49E+07)±(0.27E+07)拷贝数/ml。2:给药后pVAX1-SG在小鼠体内各器官组织间都有表达,随时间推移,各器官组织间的mRNA相对表达量发生改变和下降,免疫后第1天pVAX1-SG的表达主要集中在脾脏和小肠(P<0.05),第2天富集在肝脏,小肠和生殖器官(P<0.05),第7天集中在肝脏和颌下腺(P<0.05),第15天集中在小肠(P<0.05),第30,60天小鼠体内各器官组织mRNA相对表达量全面降低。3:在免疫动物的小肠和颌下腺相关细胞中观察到重组蛋白的表达。4:与对照组比较,动物体重无明显差异,各组实验动物的重要器官组织病理切片观察,未发现明显病理改变。结论:1:口服型防龋DNA疫苗pVAX1-SG经灌胃途径免疫BALB/c小鼠后各组织器官中均能检测到重组质粒pVAX1-SG的分布与表达,但温敏型水凝胶包裹重组质粒pVAX1-SG的分布与表达不以同步的形式出现,提示该重组质粒pVAX1-SG基因表达有其时空性。2:口服型防龋DNA疫苗pVAX1-SG经灌胃途径免疫后免疫部位小肠和效应部位颌下腺都可以检测到目的蛋白的表达,心、肝、脾、肺、肾和免疫部位小肠未出现明显病理改变,提示重组质粒pVAX1-SG能够在小鼠体内表达,口服型防龋DNA疫苗pVAX1-SG免疫小鼠后未发现明显的毒性作用。
薛萌[2]2015年在《HepG2.2.15细胞来源的自噬小体疫苗(HBV~+DRibbles)防治HBV感染及其免疫机制的实验研究》文中认为抗原的交叉递呈对于诱导肿瘤或病毒特异性免疫应答至关重要。我们前期研究证实：来源于肿瘤细胞的自噬小体(DRibbles)是肿瘤抗原的有效载体,能充分激活树突状细胞(DC)并显著提高其交叉递呈肿瘤抗原的能力,进而诱导具有治疗效果的抗肿瘤免疫应答。肿瘤细胞的DRibbles目前已进入临床应用研究。HBV主要感染肝细胞,由于肝细胞缺乏共刺激分子,直接提呈HBV抗原途径不能有效诱导CD8+T细胞的活化；因此,专职抗原递呈细胞的交叉提呈被普遍认为是诱导HBV特异性CD8+T细胞应答的重要途径。在慢性HBV感染过程中,机体存在HBV特异性免疫应答能力的受损状态,而感染机体针对HBV抗原缺乏有效的交叉递呈可能是引起HBV感染慢性化的原因之一。本研究拟提取转染HBV全长基因组的HepG2.2.15细胞的自噬小体(HBV+ DRibbles),探讨HBV+ DRibbles疫苗对HBV感染的预防和治疗效果及其免疫机制。目的以HepG2.2.15细胞来源的自噬小体作为HBV疫苗,以高压尾静脉注射pAAV/HBV1.2质粒的C57BL/6小鼠作为HBV感染的动物模型,探讨HBV+ DRibbles疫苗对HBV感染的预防和治疗作用及其免疫机制。方法1.HBV+ DRibbles的制备和鉴定1.1不同药物(Rapamycin, Bortezomib, NH4CI)处理对数生长期HepG2.2.15细胞,差速离心法提取自噬小体(HBV+ DRibbles);1.2 Western blot法检测不同药物处理组的HepG2.2.15细胞裂解液中HBsAg、LC3的水平以及HBV+ DRibbles中LC3的水平；1.3透射电子显微镜观察HBV+ DRibbles的形态；1.4 ELISA法检测HBV+ DRibbles中HBV抗原的相对含量。2.HBV+ DRibbles诱导DC细胞交叉递呈HBV抗原的实验研究重组HBsAg蛋白疫苗免疫野生型(Wild type,WT) C57BL/6小鼠,以表面抗体(anti-HBs)阳性小鼠的淋巴细胞作为HBsAg特异性细胞,体外用HBV+ DRibbles和HBsAg再刺激,ELISA法检测培养上清中IFN-y的含量；进一步分选出HBsAg特异性的CD4+和CD8+T细胞,体外分别用HBV+ DRibbles、HBsAg负载的DC细胞再刺激,ELISA法检测培养上清中IFN-y的含量。3. HBV+ DRibbles疫苗诱导HBV特异性细胞免疫应答的实验研究以不同剂量的HBV+ DRibbles疫苗淋巴结免疫WT C57BL/6小鼠,并设HBV-DRibbles疫苗对照组。于免疫第8天,体外HBV抗原及抗原肽再刺激小鼠淋巴细胞,ELISPOT法检测分泌IFN-γ细胞的数量。4.HBV感染小鼠模型的建立以文献中报道的方法将pAAV/HBV1.2质粒高压尾静脉注射WT C57BL/6小鼠,于质粒注射后不同时间点,ELISA法检测小鼠血清HBV抗原的相对含量,荧光定量PCR法检测血清HBVDNA的拷贝数,全自动生化仪酶法检测血清ALT、AST的水平,免疫组织化学技术检测肝细胞内HBcAg的表达,HE染色法观察肝组织的病理变化。5. HBV+ DRibbles疫苗预防HBV感染的实验研究以不同剂量的HBV+ DRibbles疫苗淋巴结免疫WT C57BL/6小鼠,第8天高压尾静脉注射pAAV/HBV1.2质粒。于免疫14天后ELISA法检测血清HBeAg水平,荧光定量PCR法检测血清HBV DNA拷贝数,免疫组织化学技术检测肝细胞内HBcAg的表达并计数HBcAg+肝细胞比例。6. HBV+ DRibbles疫苗预防HBV感染的机制研究6.1以30μg的HBV+ DRibbles疫苗淋巴结免疫WT C57BL/6小鼠,第8天高压尾静脉注射pAAV/HBV1.2质粒,同时设未免疫PBS对照组。在质粒注射同一天,疫苗免疫小鼠腹腔分别注射单克隆抗体,分组如下：注射PBS组、注射αCD4单克隆抗体组、注射αCD8单克隆抗体组、注射αCD4+αCD8单克隆抗体组。于免疫后第14天,ELISA法检测血清HBeAg水平,荧光定量PCR法检测血清HBV DNA拷贝数,免疫组织化学技术检测肝细胞内HBcAg的表达并计数HBcAg+肝细胞比例；6.2以HBV+DRibbles疫苗免疫WT C57BL/6小鼠的效应淋巴细胞与质粒注射小鼠的肝细胞共孵育,同时设正常小鼠的肝细胞作为对照。分别于培养不同时间点采用全自动生化仪酶法检测培养上清中ALT、AST的水平,ELISA法检测培养上清中IFN-γ的含量。7. HBV+ DRibbles疫苗治疗急性HBV感染的实验研究pAAV/HBV1.2质粒高压尾静脉注射WTC57BL/6小鼠,以小鼠感染HBV的初期模拟急性HBV感染阶段。7.1于质粒注射第3、5、7天,HBV+ DRibbles疫苗免疫HBV急性感染小鼠,并设PBS及重组HBsAg蛋白疫苗免疫对照组。于首次免疫第8天,HBV抗原及抗原肽体外再刺激淋巴细胞,ELISPOT法检测分泌IFN-γ细胞的数量；7.2相同分组与免疫,于免疫后不同时间点,ELISA法检测小鼠血清HBeAg、HBsAg、抗HBs抗体水平,荧光定量PCR法检测血清HBV DNA拷贝数,全自动生化仪酶法检测血清ALT、AST水平,免疫组织化学技术检测肝细胞内HBcAg的表达并计数HBcAg+肝细胞比例、HE染色观察肝组织的病理变化。8. HBV+ DRibbles疫苗治疗慢性HBV感染的实验研究pAAV/HBV1.2质粒高压尾静脉注射WT C57BL/6小鼠,以持续感染HBV达60天后的HBsAg耐受小鼠作为HBV慢性感染模型。8.1 HBsAg耐受小鼠的判定WT C57BL/6小鼠分为两组,一组按照前述方法建立模型,于质粒注射后第61、63、65天,重组HBsAg蛋白疫苗免疫HBsAg阳性小鼠；另一组小鼠按相同方案免疫。两组小鼠于免疫后第14天,ELISA法检测血清抗HBs抗体水平；8.2耐受小鼠以血清HBsAg水平分组,设HBV+ DRibbles疫苗免疫组、PBS及重组HBsAg蛋白疫苗免疫对照组。于质粒注射第61、63、65天免疫治疗。于首次免疫第8天,HBV抗原及抗原肽体外再刺激淋巴细胞,ELISPOT法检测分泌IFN-γ细胞的数量；8.3相同分组与免疫,于首次免疫第8天,收获淋巴细胞,分别尾静脉过继转移到新一批慢性HBV感染小鼠及对照组小鼠体内。于过继转移后的不同时间点,ELISA法检测小鼠血清HBsAg、anti-HBs抗体水平,荧光定量PCR法检测HBV DNA拷贝数,全自动生化仪酶法检测血清ALT、AST水平,免疫组织化学技术检测肝细胞内HBcAg的表达并计数HBcAg+肝细胞比例、HE染色观察肝组织的病理变化。结果1. HBV+ DRibbles的制备和鉴定1.1差速离心法提取不同药物处理组的HBV+ DRibbles,分装,-20℃保存；1.2各组细胞裂解液中均检测到分子量26KD的HBsAg的表达,3种药物联合处理组含量最高；加入Bortizomib组均出现分子量<26KD的HBsAg小片段,3种药物联合处理组的小片段更为明显。各组细胞裂解液中均检测到自噬特异性标记物LC3分子,以胞浆型LC3-Ⅰ为主,3种药物联合处理组中LC3-Ⅰ及LC3-Ⅱ含量最高；各组HBV+ DRibbles中均检测到自噬特异性标记物LC3分子,且以膜结合型LC3-Ⅱ为主,3种药物联合处理组LC3-Ⅱ含量最高；1.3 3种药物联合处理组的HepG2.2.15细胞自噬小体(HBV+DRibbles),具有双层膜结构,直径100-1000nm；1.4与培养液对照组相比,3种药物联合处理组的HBV+ DRibbles中HBsAg和HBeAg含量明显升高。2. HBV+ DRibbles诱导DC细胞交叉递呈HBV抗原的实验研究HBV+ DRibbles作为富集HBV抗原的载体,体外再刺激HBsAg特异性淋巴细胞,与HBsAg蛋白刺激组相比,培养上清中能够产生更高水平的IFN-γ,差别具有统计学意义。进一步用HBV+ DRibbles、HBsAg负载的DC细胞再刺激HBsAg特异性CD4+、CD8+T细胞,与未负载抗原的对照组及负载HBsAg的DC细胞刺激组相比,负载HBV+ DRibbles的DC细胞刺激组均产生了更高水平的IFN-γ,差别具有统计学意义。3. HBV+DRibbles疫苗诱导HBV特异性细胞免疫应答的实验研究不同剂量的HBV+ DRibbles及HBV- DRibbles免疫WT C57BL/6小鼠,效应淋巴细胞经HBV抗原及抗原肽再刺激,与其他剂量组相比,30μg HBV+ DRibbles免疫诱导产生的分泌针对HBsAg及HBcAg特异性IFN-γ的细胞数量最高,差别具有统计学意义；与未免疫的PBS对照组相比,10μg与100μg HBV+ DRibbles免疫诱导产生的分泌针对HBsAg及HBcAg特异性IFN-γ的细胞数量均未见明显统计学差异；30νg HBV+ DRibbles免疫诱导产生的分泌针对HBsAg、HBcAg及相关肽特异性IFN-γ的细胞数量明显高于30μg HBV- DRibbles免疫组,差别具有统计学意义。4.HBV感染小鼠模型的建立以文献报道的方式,复建HBV感染的小鼠模型,于质粒注射后不同时间点,检测小鼠HBV感染状态。与未注射对照组及PBS注射对照组相比,质粒注射组小鼠血清ALT水平均未见明显统计学差异；而AST水平只在质粒注射后第3天显著高于未注射对照组,其余时间点未见明显差异。质粒注射第3天,所有小鼠血清均可检测到较高水平的HBsAg及HBeAg含量,随着观察时间的延长,含量逐渐降低；至第63天,部分小鼠血清中HBsAg及HBeAg已经低于检测下限。质粒注射第3天,所有小鼠血清均可检测到较高的HBV DNA水平(180.9±98.61×104 copies/ml),至第63天,HBsAg阳性小鼠的血清仍可检测到HBV DNA (102×104,34.1×104 copies/ml)。质粒注射第3天,WT小鼠的肝组织结构正常,无病变；PBS注射组可见轻度的点状或小灶状坏死,局部可见少量中性粒细胞和单核-巨噬细胞的浸润；质粒注射组小鼠的肝细胞出现中度坏死,中央静脉区可见少量中性粒细胞浸润,至第7天,肝脏组织结构基本恢复正常,至第63天,亦未见明显病变。质粒注射第63天,HBsAg阳性小鼠的肝细胞中可检测到HBcAg表达,HBcAg既可分布于细胞浆,亦可分布于细胞核。5. HBV+ DRibbles疫苗预防HBV感染的实验研究不同剂量的HBV+ DRibbles及HBV- DRibbles免疫WT C57BL/6小鼠,于第8天注射质粒。质粒注射后不同时间点,与其他剂量组相比,30μgHBV+ DRibbles免疫组的小鼠血清HBeAg水平、HBV DNA拷贝数、肝细胞内HBcAg的表达及HBcAg+肝细胞比例均显著降低,具有统计学差异。与未免疫的PBS对照组相比,10μg、100μg HBV+ DRibbles疫苗及HBV- DRibbles疫苗免疫组的小鼠上述指标均未见明显变化。6. HBV+ DRibbles疫苗预防HBV感染的机制研究6.130μg HBV+ DRibbles免疫WT C57BL/6小鼠,设PBS对照组；第8天注射质粒,同时免疫组小鼠腹腔注射单克隆抗体以清除相应T细胞。结果可见：与PBS对照组相比,未清除T细胞的HBV+ DRibbles免疫组小鼠血清HBeAg水平、HBV DNA拷贝数及肝细胞HBcAg的表达及HBcAg+肝细胞比例均显著下降；只清除CD8+T细胞的免疫组小鼠上述指标与PBS对照组相比,未见明显统计学差异；同时清除CD4+和CD8+T细胞的免疫组小鼠上述指标相对于只清除CD8+T细胞的免疫组,差异无统计学意义；6.2 HBV+ DRibbles疫苗免疫小鼠的效应淋巴细胞与质粒注射小鼠的肝细胞共孵育,结果可见：与正常肝细胞共孵育组相比,免疫小鼠淋巴细胞与HBV感染的肝细胞共孵育组培养上清中ALT、AST水平均升高,ALT水平未见统计学差异,而AST水平具有明显统计学差异；同时培养上清中产生了更高水平的IFN-γ,差异具有统计学意义。7. HBV+ DRibbles疫苗治疗急性HBV感染的实验研究7.1以HBV+ DRibbles疫苗免疫急性HBV感染小鼠,效应淋巴细胞体外经HBV抗原及抗原肽再刺激。结果可见：与PBS对照组及重组HBsAg蛋白疫苗免疫对照组相比,HBV+ DRibbles疫苗免疫诱导分泌针对HBV抗原及抗原肽特异性IFN-γ的细胞数量明显增高,差别有统计学意义；而HBsAg免疫组未能诱导产生分泌IFN-γ的细胞；7.2 HBV+ DRibbles疫苗治疗急性HBV感染小鼠。结果可见：与PBS及重组HBsAg蛋白疫苗免疫的对照组相比,只有HBV+ DRibbles疫苗免疫能够明显降低小鼠血清HBeAg、HBsAg、HBVDNA水平、肝细胞内HBcAg的表达及HBcAg+肝细胞比例；而小鼠血清HBsAg的水平明显低于PBS对照组,高于HBsAg免疫组；部分小鼠血清产生抗HBs抗体,但平均水平明显低于HBsAg免疫对照组；且小鼠血清ALT、AST水平未见明显变化,肝组织结构基本正常,仅有少量炎细胞浸润。8. HBV+DRibbles疫苗治疗慢性HBV感染的实验研究8.1经重组HBsAg蛋白疫苗免疫后,WT小鼠血清产生了高水平的anti-HBs抗体,而pAAV/HBV1.2质粒注射后60天的模型小鼠血清中anti-HBs抗体阴性；8.2 HBV、DRibbles疫苗免疫HBsAg耐受小鼠,同时设PBS及HBsAg蛋白疫苗免疫对照组,体外HBV抗原及抗原肽再刺激各组小鼠效应淋巴细胞。结果可见：与PBS对照组相比,只有HBV+DRibbles疫苗免疫组小鼠的淋巴细胞在HBV抗原及抗原肽再刺激时,能够产生更高水平分泌IFN-γ的细胞数量,差异具有统计学意义；而重组HBsAg蛋白疫苗免疫组的小鼠淋巴细胞在HBV抗原及抗原肽再刺激后,分泌IFN-γ的细胞数量未见明显统计学差异；8.3 HBV、DRibbles疫苗治疗HBsAg耐受小鼠。结果可见：与PBS对照组及重组HBsAg蛋白疫苗免疫对照组相比,只有接受HBV+DRibbles免疫组淋巴细胞过继转移后,被过继转移小鼠血清中HBsAg水平、HBV DNA拷贝数、肝细胞内HBcAg的表达及HBcAg+肝细胞比例均明显降低,差异具有统计学意义,部分小鼠产生抗HBs抗体；被过继转移组小鼠血清ALT、AST水平无明显变化,肝组织结构基本正常,仅有少量小灶性坏死和炎细胞浸润。结论HBV+ DRibbles疫苗能够高效募集HBV抗原成份；作为HBV抗原的有效载体,能够有效活化DC细胞并交叉递呈HBV抗原；HBV+ DRibbles疫苗免疫能够诱导HBV特异性的细胞免疫应答,并有效预防HBV感染,其中,CD8+T细胞在抑制HBV病毒复制及清除HBV感染的肝细胞中发挥重要作用；HBV+ DRibbles疫苗免疫在HBV感染急性期能够诱导多种HBV抗原及抗原肽特异性的细胞免疫应答、抑制HBV的复制、清除HBV感染的肝细胞,对HBV急性感染具有明显的治疗效果；HBV+ DRibbles疫苗免疫在HBV感染慢性期能够打破免疫耐受、诱导HBV多特异性的细胞免疫应答,抑制HBV的复制、清除HBV感染的肝细胞,对HBV慢性感染具有明显的治疗作用；HBV+ DRibbles疫苗免疫对HBV急性和慢性感染的治疗未造成小鼠肝细胞明显的免疫病理损伤。提示HBV+ DRibbles疫苗在治疗HBV感染方面具有潜在的应用前景。
王庆勇[3]2007年在《HPV16型mE7/CD40L DNA疫苗的实验研究》文中认为在全球范围内，宫颈癌是妇女因恶性肿瘤而死亡的第二位死因。世界范围内宫颈癌每年的新增病例50万，死亡病例23万，其中三分之二的病例是在发展中国家。现在已经明确持续性高危型HPV的感染是宫颈癌发生的重要原因，其中HPV16感染是宫颈癌最主要致病因子，由HPV16感染发展引起的宫颈癌占宫颈癌总数的54％，而我国HPV16阳性的宫颈癌占宫颈癌总数的79.6％。2006年MERCK公司生产由病毒主要外壳蛋白组成病毒样颗粒疫苗已经问世，该疫苗免疫后可有效诱发机体产生高滴度的针对病毒颗粒表面L1表位的中和抗体，因此可预防HPV16、18、6及11型病毒感染及感染相关疾病。由于病毒的外壳蛋白在宫颈癌细胞中表达量极低或不表达，因此目前尚未发现该疫苗对HPV感染及感染相关疾病的治疗具有肯定作用。我国是宫颈癌的高发区，因此研制研发针对HPV16的免疫效果好而成本低的治疗性疫苗意义重大。由于DNA疫苗具有安全性好、成本低、易于大量制备并可以反复应用等优势，因此是适合我国国情的宫颈癌治疗性疫苗的理想选择。HPV16 E7是病毒的主要转化基因，E7蛋白的持续高水平表达是肿瘤细胞恶性表型维持所必需的。E7蛋白是异源的病毒蛋白，属于肿瘤特异性抗原，因此是宫颈癌免疫治疗的理想靶抗原。为了消除E7蛋白的转化活性并增强其免疫原性，本课题组对HPV16疫苗进行了长期的探索研究，在前期工作中，我们通过联合多种策略，包括基因切割重排、密码子优化、转化活性位点的点突变等优化改造了HPV16 E7基因。全基因合成法获得了优化改造后的E7基因，命名为mE7，并构建了VR1012-mE7重组质粒，Western blot证明该优化基因在体外可正确表达。鉴于DNA疫苗的体内转染效率低，免疫原性相对较差，因此mE7 DNA疫苗的免疫原性需要进一步增强。研究发现CD40配体(CD40 ligand，CD40L)与APC细胞特别是DC细胞表面的CD40相互作用，可促进APC细胞的活化，增强APC细胞对抗原的加工呈递，同时促进DC细胞分泌IL-12、TNF-α、IL-8等细胞因子，并能促进Th1类细胞活化。因此本研究将mE7与CD40L胞外区融合获得mE7／CD40L融合基因，构建该融合基因的真核表达质粒pVR1012-HPV16 mE7／CD40L用于DNA疫苗研究。脂质体法瞬时转染NIH 3T3细胞，Western blot法对此重组基因的表达水平进行分析。表达确定后，碱裂解-PGE法大量提取纯化上述质粒，肌肉免疫C57BL／6小鼠进行E7特异性的细胞免疫、体液免疫及体内抗瘤活性的检测，结果具体如下：1．mE7／CD40L融合蛋白的体外表达质粒pVR1012-mE7／CD40L瞬时转染NIH 3T3细胞，通过Western blot方法鉴定了mE7／CD40L在细胞中的表达水平，实验结果显示mE7／CD40L相对分子量大小约为51 kDa，与理论分子量基本一致。2．ELISPOT检测不同DNA疫苗组小鼠脾细胞中分泌IFN-γ的E7特异性CD8~+ T细胞的数目分别于6-8周龄雌性C57BL／6小鼠双侧股四头肌内注射pVR1012-mE7和pVR1012-mE7／CD40L重组质粒，同时设野生型E7基因(wE7)表达质粒pVR1012-wE7、CD40L表达质粒pVR1012-CD40L及空载组作为对照组。免疫剂量100ug／鼠，免疫2次，间隔一周，最后一次免疫7天时，取小鼠脾细胞，体外经E7_(49-57) CTL表位肽刺激后，用ELISPOT检测分析免疫小鼠脾细胞E7特异性CD8~+ T细胞的活化情况。结果显示，mE7免疫组小鼠脾细胞中E7特异性分泌IFN-γ的CD8~+ T细胞数目明显高于wE7免疫组，mE7／CD40L基因免疫组所诱发产生的E7特异的分泌IFN-γ的CD8~+ T细胞显著高于mE7免疫组。表明本课题组优化改造的mE7基因免疫，与野生型E7基因免疫相比，可显著提高E7特异的CD8~+ T细胞的活化水平，融合CD40L后构建的mE7／CD40L融合DNA疫苗可进一步增强E7特异的CD8~+ T细胞的活化水平。3．FACS分析各DNA疫苗组中E7特异性CD4~+ T细胞介导的免疫反应小鼠免疫如上所述，于最后一次免疫后第7天时，对免疫后的小鼠的脾细胞用E7长肽(30-67氨基酸)体外过夜刺激，然后用流式细胞仪来分析经CD4及IFN-γ双染后的T细胞。实验结果显示，各个实验组之间的双染T细胞(CD4~+ IFN-γ~+)数目并没有统计学差异。4．ELISA检测血清中E7特异性抗体的水平小鼠免疫如上所述，于最后一次免疫后一周时，用ELISA的方法检测免疫后小鼠E7特异性抗体的水平。结果显示，mE7及mE7／CD40L免疫组的抗体水平要明显高wE7免疫组，但是mE7及mE7／CD40L免疫组之间的抗体水平无显著性差异，表明本课题组优化改造的mE7基因免疫，与野生型E7基因免疫相比，可显著提高E7特异的抗体水平。5．疫苗体内抗瘤活性的检测分别于6-8周龄雌性C57BL／6小鼠(每组8-10只)双侧股四头肌内预防性免疫pVR1012-mE7和pVR1012-mE7／CD40L重组质粒，同时设pVR1012-wE7、pVR1012-CD40L及空载组作为对照组。免疫2次，间隔一周。最后一次免疫的第7天时，用7.5×10~4个TC-1细胞皮下接种攻击，随后每周观察记录肿瘤生长情况2-3次。结果显示，而mE7及mE7／mCD40L实验组小鼠于实验结束时(即瘤细胞接种后45天时)，100％的小鼠未见移植瘤的形成，而对照组小鼠在瘤细胞接种后10天左右全部形成移植瘤。同时，取6-8周龄的雌性C57BL／6小鼠，先皮下接种7.5×10~4个TC-1肿瘤细胞，模拟机体的荷瘤状态，三天后在小鼠双侧股四头肌内分别注射100ug的mE7、mE7／CD40L、CD40L重组质粒及VR1012空载，免疫2次，间隔一周，随后每周观察并记录肿瘤生长情况2-3次。实验结果显示对照组小鼠于瘤细胞接种后的第8天左右时小鼠全部形成移植瘤，并成渐进性生长，而mE7免疫组，有30％小鼠没有形成移植瘤，mE7／CD40L免疫组小鼠的无瘤率进一步增高达40％。另外mE7／CD40L DNA免疫治疗组小鼠移植瘤消退前取材行组织学观察分析发现，瘤组织中可见大量淋巴细胞浸润，而在对照组的小鼠移植瘤中未发现有此现象。总之，本研究结果表明通过基因切割后重排、密码子优化及基因突变改造后的mE7基因免疫与wE7基因相比，可显著提高E7特异的CD8~+ T细胞的活化水平，抗体活化水平及体内对移植瘤的免疫预防和免疫治疗作用。为了加强DNA疫苗的免疫原性，本研究构建了HPV16 mE7／CD40L DNA疫苗。研究发现mE7／CD40L基因在小鼠体内所诱发产生的E7特异分泌IFN-γ的CD8~+ T细胞数目显著高于mE7基因。mE7及mE7／CD40L DNA疫苗均具有显著的免疫预防效果，然而mE7／CD40L DNA疫苗与mE7 DNA疫苗相比在动物免疫治疗实验中显示出较好的抗瘤效果。由于对瘤细胞的免疫治疗作用的好坏主要取决于细胞免疫的活化水平，ADCC介导的细胞毒作用尽管体外可有效地杀伤瘤细胞，但体内尚未见有此活性，因此推测mE7及mE7／CD40L DNA疫苗的免疫治疗作用主要是由活化E7特异的CD8~+ T细胞所诱发的，表明该mE7／CD40L DNA疫苗对HPV16感染及感染相关肿瘤特别是宫颈癌具有免疫治疗作用，为进一步研发适合我国国情的针对HPV16 DNA治疗性疫苗打下了基础。
罗秀[4]2013年在《六月青多糖及其皂苷对鸭乙型肝炎的治疗作用及分子作用机制研究》文中研究指明目的：观察六月青多糖(LYQP)及其皂苷(LYQS)体外抗乙型肝炎病毒(HBV)及体内抗鸭乙型肝炎病毒(DHBV)的作用。方法：(1)体外抗HBV作用：采用MTT法检测LYQP及LYQS对转染HBV DNA全基因组的HepG2.2.15细胞的半数毒性浓度(TC50)及最大无毒浓度(TCo)；采用直接加药法观察在TCo条件下不同浓度的药物对HepG2.2.15细胞的作用,分别在第72h和第144h收集细胞培养上清液,采用ELISA法检测上清液中HBsAg和HBeAg的滴度,采用荧光定量PCR(FQ-PCR)法检测上清液中HBV DNA的含量。(2)体内抗DHBV作用：用1日龄广西麻鸭感染DHBV,7d后用普通PCR法筛选出DHBV感染强阳性鸭。随机分成8组：LYQP高、中、低剂量组；LYQS高、中、低剂量组；模型组和阿昔洛韦(ACV)阳性对照组。每组10只,每组雏鸭均连续灌胃14d。分别于用药前(To)、用药后7d(T7)、14d(T14)及停药3d(P3)后采血,采用ELISA法检测血清中DHBsAg和DHBeAg的滴度,用FQ-PCR法检测血清中DHBV DNA的含量。同时检测血清中丙氨酸氨基转移酶(ALT)和门冬氨酸氨基转移酶(AST)活性,HE染色观察鸭肝脏组织的病理学变化。结果：(1)体外抗HBV作用：①LYQP及LYQS对HepG2.2.15细胞的毒性较低,TC50分别为111.77mg/mL;90.46mg/L; TC0分别为11.88mg/mL;1.59mg/L。②无毒浓度下不同浓度的含药培养液在HepG2.2.15细胞的培养中可有效的抑制HBsAg及HBeAg的分泌和HBV DNA的合成,抑制作用有明显的时效及量效关系。③TI都大于2,是高效低毒的抗HBV药物。(2)体内抗DHBV作用：给药后,与模型组比较,LYQP及LYQS各剂量组鸭血清中DHBV DNA的含量显著降低(P<0.∞或P<0.01),停药3d后,中、低剂量组及ACV组血清中DHBV DNA的含量有回升现象,高剂量组DHBV DNA的回升现象不明显。与模型组比较,LYQP及LYQS各剂量组能降低鸭血清中AST及ALT的活性,给药前后血清中DHBsAg及DHBeAg的OD值变化与DNA的含量改变相似；药物的抗病毒效果与剂量大小及时间有一定关系。此外,鸭肝脏组织病理学检查发现LYQP及LYQS对DHBV引起的肝损伤有明显的保护作用。结论：LYQP及LYQS体内外均有显著的抗HBV作用,同时能减轻DHBV所致的鸭肝损伤,改善肝功能。
张巧[5]2010年在《肺炎链球菌毒力蛋白基因工程疫苗的实验研究》文中研究说明背景与目的:肺炎链球菌是社区获得性感染最常见的致病菌,全球每年有超过100万儿童死于肺炎链球菌感染性疾病。目前肺炎链球菌对抗生素多重耐药情况日趋严重,使肺炎链球菌感染的治疗面临重大挑战,WHO提出应用疫苗预防肺炎链球菌感染是减少耐药菌传播、缓解抗生素耐药压力,保护高危人群的唯一方法。国内外越来越多的临床研究发现目前应用的肺炎链球菌23价荚膜多糖疫苗和7价蛋白-多糖结合疫苗存在血清型依赖,成本昂贵,不降低肺炎链球菌鼻咽部携带等不足。研发新一代非血清型依赖的安全、便携、廉价的新型肺炎链球菌疫苗具有巨大的经济效益和深远的社会价值。肺炎链球菌作为条件致病菌,多种毒力因子独立或协同的参与了其粘附、定植、迁移、侵袭性致病的全过程。基于肺炎链球菌相关毒力蛋白的DNA疫苗具有非血清型依赖、覆盖率广、造价低廉等优势,成为第三代肺炎链球菌疫苗的研究热点。靶抗原的选择,优势载体系统的应用和理想的接种途径是新型肺炎链球菌DNA疫苗研究的关键环节。本课题组前期研究已经证实了肺炎链球菌表面蛋白A(pneumococcal surface protein A,PspA)及肺炎链球菌黏附素A(pneumococcal surface adhesion A ,PsaA)的联合是最优势的候选抗原组合形式,但是传统的DNA疫苗免疫途径并不具备激发鼻咽部特异性sIgA抗体保护的能力,而且免疫原性较弱。鉴于鼻咽部定植是肺炎链球菌感染的首要步骤,研究如何优化DNA疫苗的载体系统,选择理想的免疫途径进而增强肺炎链球菌DNA疫苗的免疫效能,尤其是增加其鼻咽部粘膜免疫保护效能具有重要意义。因此,本课题围绕“肺炎链球菌基因工程疫苗的实验研究”,进行了以下三部分研究工作:(1)第一部分:基于优势靶抗原组合(pspA+psaA基因),构建肺炎链球菌多价DNA疫苗。复制肺炎链球菌鼻咽部携带及腹腔攻击动物模型,裸质粒肌肉注射方式免疫接种,评价其免疫原性及保护效能;(2)第二部分:基于载体-宿主致死平衡原理,设计改造现有减毒沙门菌为宿主菌的沙门菌-原核质粒平衡致死系统,将其携带的原核质粒改造为非抗性基因筛选的真核质粒,构建新型减毒沙门菌为载体的多价肺炎链球菌DNA基因工程疫苗,复制肺炎链球菌鼻咽部携带及腹腔攻击动物模型,经口服途径免疫接种,评价其稳定性、免疫原性及免疫保护效能;(3)第三部分:进一步利用基因组学及分子遗传学技术针对优势靶抗原进行分子进化及比较基因组学的初步研究。旨在为肺炎链球菌新一代基因工程疫苗的研发提供理论基础和实验室依据。方法:1.分子克隆技术构建PsaA和PspA’(PspA的N端抗原表位所在区域基因片段)的重组真核表达质粒PsaA-pcDNA3.1和PspA’-pcDNA3.1。两种重组质粒DNA疫苗PsaA-pcDNA3.1和PspA’-pcDNA3.1裸质粒单独或联合肌肉注射免疫小鼠,ELISA检测免疫小鼠脾细胞分泌细胞因子及血清中特异性抗体IgG水平;复制小鼠肺炎链球菌D39株鼻咽部携带和腹腔侵袭性感染模型,观察免疫小鼠鼻咽部肺炎链球菌携带改变和腹腔攻击小鼠21天生存情况。2.新型减毒沙门菌为载体的多价肺炎链球菌DNA疫苗构建及其稳定性、免疫效能检测。(1)肺炎链球菌DNA疫苗的新型减毒沙门菌载体系统构建:基于pcDNA3.1(+),应用BspHI、XmnⅠ双酶切获得片段SV40ori-Neor-SV40Pa-pUCori和Pcmv-MCS-BGHpA-f1ori,再用SalⅠ酶切SV40ori-Neor-SV40pA-pUCori获得片段pUCori;将酶切获得的pUCori、Pcmv-MCS-BGHpA-f1ori两个片段及变形链球菌asd基因PCR扩增产物进行连接,构建新互补质粒pcDNA3.1000,并最终转化入宿主菌沙门菌χ4550中(pcDNA3.1000x)。(2)分子克隆技术构建新型减毒沙门菌为载体的肺炎链球菌DNA疫苗pcDNA3.1001x(编码pspA’基因)和pcDNA3.1002x(编码psaA基因),并检测重组质粒在哺乳动物细胞BHK-21中的表达(RT-PCR及Western-blot)及质粒稳定性。新型减毒沙门菌为载体的肺炎链球菌DNA疫苗pcDNA3.1001x和pcDNA3.1002x单独或联合口服免疫小鼠,ELISA检测免疫小鼠脾细胞分泌的细胞因子、血清中特异性抗体IgG及鼻咽部灌洗液中sIgG水平。复制小鼠肺炎链球菌D39株鼻咽部携带模型和腹腔侵袭性感染模型,观察免疫小鼠鼻咽部肺炎链球菌D39菌落计数改变和腹腔攻击小鼠21天生存情况,以评价新型减毒沙门菌为载体的多价肺炎链球菌DNA疫苗的免疫原性及保护作用优势。3.采用分子遗传学技术进一步分析肺炎链球菌基因工程疫苗优势抗原蛋白的分子进化特点及抗原多样性。(1)采集上呼吸道共栖环境中的临床收集轻链球菌家族菌株(包含肺炎链球菌、轻链球菌、口腔链球菌、血链球菌、婴儿链球菌),PCR技术探查psaA基因分布情况。基于扩增的psaA基因进行氨基酸序列比对及系统发生树构建,分析psaA的序列特点及在轻链球菌家族中可能的遗传机制。(2)采集本地区临床致病肺炎链球菌感染菌株,应用PspA蛋白家族分型特异性引物PCR及生物信息学技术鉴定本地区临床自然感染肺炎链球菌株PspA家族分布特点;进一步应用分子遗传学技术构建pspA基因多家族的系统发生树,分析肺炎链球菌PspA作为新一代肺炎链球菌基因工程疫苗优势候选抗原应包含的优势家族成分。结果:1.肺炎链球菌多价DNA疫苗的构建:成功扩增pspA基因包含抗原表位的N端片段及psaA基因目标片段,分别克隆入真核载体pcDNA3.1(+),构建了PspA’-pcDNA3.1和PsaA-pcDNA3.1两种肺炎链球菌毒力蛋白重组真核质粒,并从转录水平和翻译水平检测了这两种重组质粒编码的psaA及pspA’基因在哺乳动物细胞的成功表达。2.肺炎链球菌多价DNA疫苗的免疫原性及保护效能(1)免疫原性评价①细胞免疫评价:单独及联合免疫组小鼠脾细胞分泌的抗原特异性细胞因子IFN-γ的水平较对照组显著升高;联合免疫组较单独免疫组小鼠IFN-γ的水平升高更显著;单独、联合免疫组及对照空白质粒组小鼠在免疫前后脾细胞分泌抗原特异性细胞因子IL-4的水平无明显改变。②体液免疫评价:单独及联合免疫组小鼠血清抗原特异性IgG抗体水平较对照空白质粒组显著升高;联合免疫组较单独免疫组小鼠IgG抗体水平升高更显著。(2)免疫保护效能评价①肺炎链球菌鼻咽部定植的保护:单独及联合免疫组小鼠鼻咽部肺炎链球菌数量与对照空白质粒及PBS组比较有所减少;联合免疫组较单独免疫组小鼠鼻咽部肺炎链球菌数量减少更显著。②肺炎链球菌侵袭性腹腔攻击的保护:单独及联合免疫组小鼠中位生存时间与空白质粒及PBS对照组比较明显延长;联合免疫组较单独免疫组小鼠中位生存时间延长更显著。2.新型减毒沙门菌为载体的肺炎链球菌多价DNA疫苗免疫原性及保护效能(1)新型减毒沙门菌为载体的肺炎链球菌多价DNA疫苗的构建:成功构建真核互补质粒pcDNA3.1000,引进了穿梭质粒载体的必要元件真核启动子Pcmv ,多克隆位点MCS ,多聚腺苷酸尾BGHpA及原核复制子pUCori,同时去除了与病毒复制有关的SV40ori及SV40pA ,并以营养选择标志基因asd代替了原质粒载体上的氨苄抗性基因Amp及新霉素抗性基因Neo。进一步分子克隆技术成功构建新型减毒沙门菌为载体的肺炎链球菌多价DNA疫苗pcDNA3.1001x(编码psaA基因),pcDNA3.1002x(编码pspA’基因),转录水平和翻译水平成功检测到pspA’及psaA基因在哺乳动物BHK-21细胞的表达,新系统经传代培养25代,重组真核质粒pcDNA3.1001及pcDNA3.1002稳定性高达100%。(2)免疫原性评价①细胞免疫评价:新型减毒沙门菌为载体的DNA疫苗各免疫组小鼠脾细胞分泌LPS特异性细胞因子IFN-γ的水平升高,各组间无显著性差异;新型减毒沙门菌为载体的DNA疫苗组脾细胞分泌PspA及PsaA抗原特异性细胞因子IFN-γ的水平与裸质粒DNA疫苗组比较显著升高;单独、联合免疫组及对照空白质粒组小鼠免疫前后脾细胞分泌LPS、PspA及PsaA抗原特异性细胞因子IL-4的水平无明显改变,各组间亦无显著差异。②体液免疫评价:新型减毒沙门菌为载体的DNA疫苗联合免疫组小鼠血清抗PsaA及PspA抗原特异性IgG抗体水平与裸质粒DNA疫苗组比较显著升高;所有单独及联合免疫组小鼠血清PsaA及PspA抗原特异性IgG抗体水平均显著高于对照空白质粒组;所有联合免疫组小鼠血清PsaA及PspA抗原特异性IgG抗体水平均较单独免疫组显著升高。③黏膜免疫评价:新型减毒沙门菌为载体的DNA疫苗免疫组小鼠鼻咽部灌洗液中sIgG水平教空白质粒对照组显著升高,联合免疫组小鼠鼻咽部灌洗液中抗PsaA及PspA抗原特异性sIgG抗体水平较单独免疫组显著升高。(3)免疫保护效能评价①肺炎链球菌鼻咽部定植的保护:新型减毒沙门菌为载体的DNA疫苗免疫组与裸质粒DNA疫苗组比较小鼠鼻咽部肺炎链球菌数量减少更为显著;并且联合免疫组较单独免疫组具有更好的保护效能。②肺炎链球菌侵袭性腹腔攻击的保护:新型减毒沙门菌为载体的DNA疫苗免疫组与裸质粒DNA疫苗组比较小鼠中位生存时间显著延长;并且联合免疫组较单独免疫组具有更好的保护效能。3.肺炎链球菌新一代基因工程疫苗优势靶抗原PsaA、PspA在鼻咽部微环境共栖同种群细菌中的分子遗传学分析(1)肺炎链球菌psaA基因的种群基因起源进化分析提示psaA基因在临床分离的轻链球菌群菌株中广泛存在,但是仅仅在肺炎链球菌中该基因是垂直遗传的,其它的轻链球菌群菌株中psaA基因可能来源于共生环境中基因的水平转移,并且推测这些转移的psaA基因之间的差异可能与BOX元件的参与及转移后发生的频繁的基因内重组现象相关。(2)肺炎链球菌pspA基因N端抗原多样性区域基因组学分析提示本地区PspA蛋白家族分布趋势:PspA-Fam1-Clade2(31.0%)和PspA-Fam2-Clade3(47.6%)的菌株作为优势分布,与国外报道存在差异。结论:新型减毒沙门菌载体系统在保障重组质粒的稳定性同时避免了抗性基因及减毒株毒力回复的安全问题,将其应用于携带肺炎链球菌多价DNA疫苗,激发了机体更全面的全身性免疫应答,在肺炎链球菌的定植及侵袭性感染的动物模型中表现出了增强的保护效能,是一种具备良好应用前景的肺炎链球菌基因工程疫苗优化策略。肺炎链球菌基因工程疫苗的优势靶抗原psaA和pspA基因的抗原遗传背景分析证实了这两种抗原在肺炎链球菌的抗原特异性。但pspA基因在本地区肺炎链球菌株中的抗原多样性现象提示:在进一步的肺炎链球菌基因工程疫苗靶抗原优化策略中应包含PspA优势家族抗原表位才能更全面的覆盖本地区的临床致病肺炎链球菌菌株感染。
孙丹凤, 陆许贞, 谢新生, 王柯尹[6]2017年在《慢性乙型肝炎及肝硬化患者乙型肝炎表面抗原及乙型肝炎病毒DNA定量检测的临床意义》文中指出目的探讨慢性乙型肝炎(CHB)及其肝硬化患者乙肝表面抗原(HBsAg)和乙肝病毒(HBV)DNA定量检测的临床意义。方法将152例诊断为CHB的患者根据肝脏病变严重程度分为慢性乙型活动性肝炎组(A组,74例)、代偿期肝硬化组(B组,39例)及失代偿期肝硬化组(C组,39例)。对三组患者间血清HBsAg、HBV DNA定量水平进行比较,采用Pearson相关分析对HBsAg与HBV DNA定量进行检验,采用Spearman相关分析对Hbs Ag、HBV DNA定量水平分别与肝病等级进行分析。结果 A、B、C组患者间HBsAg定量[(3.9±0.5)、(3.2±0.3)、(2.7±0.6)lg IU/m L]及HBV DNA[(7.3±1.2)、(6.1±1.4)、(5.3±1.4)lg IU/m L]定量水平比较,差异均有统计学意义(F=75.564、30.384,P均<0.05),进一步两两比较发现,B组与C组Hbs Ag及HBV DNA定量水平均显著低于A组,且C组更低(P均<0.05)。Pearson相关分析发现,所有患者HBsAg与HBV DNA定量水平之间呈正相关(r=0.614,P<0.001),HBsAg与HBV DNA定量水平在A组呈正相关(r=0.570,P<0.001),而在B组与C组中无相关性(r=0.267,P=0.101;r=0.232,P=0.155)。Spearman相关分析提示,Hbs Ag及HBV DNA定量水平均与肝病等级呈负相关(r=-0.741,P<0.001;r=-0.583,P<0.001)。结论肝硬化程度越重,其HBsAg、HBV DNA水平越低,HBsAg定量测定结合HBV DNA定量结果可以更好地反映肝细胞内乙型肝炎病毒的复制及疾病的进展情况。
李宇红[7]2005年在《增强靶向融合防龋DNA疫苗粘膜免疫效果的研究》文中研究指明龋病是影响人类身体健康和生存质量的发病率最高的慢性传染病,针对人类主要致龋菌——变形链球菌(Stroptococcus mutans, S. mutans)的多种防龋疫苗经证实确有防龋效果。近年来我们在国内外率先研制了针对变形链球菌的表面蛋白抗原PAc重要粘附功能和免疫原性区(A区和P区)的pCIA-P防龋DNA疫苗:同时针对变形链球菌葡糖基转移酶(glucosyltransferase GTF)的葡聚糖结合区(GLU区)和PAc蛋白A区和P区的融合防龋DNA疫苗pGLUA-P;为了进一步提高防龋DNA疫苗免疫效能,构建了以人细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA4)为引导的抗变形链球菌GTFs Ⅰ和PAc的靶向融合防龋DNA疫苗pGJA-P,经体外转染和体内接种实验证明,pCIA-P、pGLUA-P和pGJA-P均可在真核细胞中表达出正确的目的抗原,并诱导机体产生特异性血清IgG和唾液SIgA抗体,明显减少实验动物的龋齿记分。 防龋疫苗预防龋病的机制在于其可以诱导机体产生特异性免疫反应,尤其是唾液中的特异性分泌型IgA(SIgA)在抑制变链菌与牙面的粘附,减少龋病的发生中发挥主要作用。我们所研究的防龋DNA疫苗经肌肉免疫可诱导较高水平的特异性血清IgG,但所诱导的粘膜免疫反应较低。对于防龋具有重要作用分泌性IgA主要来源于共同粘膜免疫系统,直接在粘膜局部接种疫苗是诱导保护性粘膜免疫的最佳途径,可是从粘膜途径接种的裸DNA,通常不会诱导出我们所期待的粘膜免疫反应,如何更好地诱生抗变形链球菌的特异性粘膜免疫应答成为本研究的主要设计思路 在DNA疫苗的粘膜免疫中,由于粘膜上皮组织对外源DNA的低摄取性、粘膜表面粘液的保护性,以及抗原易被各种酶降解破坏,抗原很难在粘膜表面被抗原提呈细胞(APC)有效的摄取而不能激发良好的粘膜免疫反应。抗原进入粘膜表面与M细胞有关,M细胞可摄取抗原物质,经粘膜淋巴区域如派伊尔氏结(peyerps patches,PP)传递给APC,最终诱导IgA合成。将抗原包封于微粒中,一方面阻止了抗原水解失活;另一方面,因M细胞易于吸收憎水微粒而增加了抗
何晓文[8]2005年在《乙型肝炎治疗性疫苗的研究》文中研究说明乙型肝炎是一种严重危险人类健康的全球性疾病,疫苗是预防和治疗乙肝的重要手段。本研究构建了表达HBV(中国流行株)表面抗原的DNA疫苗,并在表达载体中引入了人特异的CpG免疫刺激序列,摸索了一套适合于人用DNA疫苗中试生产的工艺路线。经过两步纯化,有效地去除菌液中的蛋白质和杂质核酸,降低了内毒素含量,使得到的DNA疫苗的质量符合有关标准。从体液免疫、细胞免疫全面地考察了乙肝DNA疫苗的免疫原性,发现DNA疫苗能在免疫小鼠体内表达目的抗原,能诱导出抗原特异性的体液反应和细胞免疫,诱导的抗体的IgG亚型疫IgG_(2(?))为主。进一步考察了乙肝DNA疫苗对HBV转基因小鼠的治疗作用。DNA疫苗免疫后,转基因小鼠血清中HBsAg水平均有不同程度地下降,部分小鼠HBsAg完全转阴;DNA疫苗能诱导出特异性的抗体反应,说明DNA疫苗能打破转基因小鼠对乙肝病毒的免疫耐受。 鉴于DNA疫苗的免疫原性较低,本课题分别通过改善疫苗的免疫方案、改善疫苗的剂型,来提高乙肝DNA疫苗的免疫效果。采用DNA疫苗、蛋白质疫苗联合免疫的策略,从不同免疫组合、不同免疫次序、不同免疫次数的8种免疫方案中筛选得到的一种最佳联合方案(2次DNA疫苗初免和1次蛋白质疫苗加强免疫的组合),能明显地增强体液免疫和细胞免疫。本课题采用PLGA微球制剂的两种剂型分别包裹或吸附乙肝DNA疫苗,系统地考察了疫苗新剂型的免疫效果,并探讨了其增效的分子机制。结果表明两种微球给药系统明显地增强DNA疫苗的免疫原性,PLGA包裹的乙肝DNA口服疫苗缓慢释放质粒DNA,不仅诱导了系统的抗原特异性免疫,还能诱导高效的消化道粘膜免疫反应。增强的免疫原性与微球制剂的缓释、靶向给药的特点有关。研究发现乙肝DNA疫苗PLGA微球制剂延长目的基因的转录和表达,还能靶向性向抗原提呈细胞递送DNA疫苗。 HBx是一种多功能蛋白,为病毒基因组转录所必需。HBx与许多共刺激因子、转录因子相互作用,调控靶基因的转录,从而影响HBV感染的细胞的功能。由于HBx在乙肝以及乙肝引起的肝硬化、肝癌的肝组织上较HBV其他亚基有更高的表达率,所以本研究将其作为靶抗原,联合应用超基序法、延展基序法、量化基序法等生物信息学的表位预测方案,并结合生物学功能实验加以验证,筛选到3个来源于HBx、并能与HLA-A*0201分子高亲和性结合的抗原九肽VLHKRTLGL(92-100),
王华[9]2006年在《HSP65-HBV多表位融合蛋白乙肝治疗性疫苗的研制》文中研究指明对于乙型肝炎,目前尚无理想的治疗药物。因此,新型的HBV治疗性疫苗的研制成为国内外的热点研究课题。新近的研究表明,HSP65可引导与其形成复合物或融合蛋白的抗原肽在树突状细胞内经MHC I类途径加工递呈,从而激活抗原特异性的细胞免疫反应。此外,PADRE是一种Th表位,Th细胞在特异性CTL的产生和维持方面起重要作用。因此,本文自行设计了一种乙肝治疗性疫苗:卡介苗热休克蛋白65-PADRE-HBV多表位融合蛋白(HSP65-HBV epi)。该融合蛋白可在小鼠体内诱生HBV特异性CTLs,刺激代表Th1途径的IgG2a抗体的产生;可在体外刺激人DCs的成熟,并可通过DCs促进自体CD8+ T细胞的增生并诱导HBV特异性CTLs的产生,这些特异性CTLs具有分泌IFN-γ的能力。因此,HSP65-HBV epi融合蛋白非常有希望成为有效的乙肝治疗性疫苗。
陈小兵[10]2010年在《黄芪多糖作为佐剂对乙型肝炎疫苗免疫反应影响的研究》文中认为乙型肝炎是由乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)引起的一种影响人类健康的世界性传染病。接种乙肝疫苗是目前控制乙型肝炎感染的最有效的措施,但是传统的乙型肝炎亚单位疫苗是由乙型肝炎病毒的表面抗原和铝佐剂组成,铝佐剂疫苗仅能引起很好的体液免疫反应而不能引起有效的细胞免疫反应。佐剂可以增强细胞免疫和体液免疫,活化T细胞,上调细胞因子的表达,增强免疫记忆,并能改变免疫反应类型。因此改良佐剂可能增强传统乙型肝炎亚单位疫苗的免疫反应。黄芪多糖(Astragalus polysaccharides,APS)是中药黄芪的提取物,具有广泛的药理作用,也具有很强的免疫调节作用。APS可从多个方面发挥免疫调节作用：直接影响免疫细胞内的物质代谢,诱导产生相关的免疫调节因子；不仅能够增强机体的特异性免疫反应,还可以增强非特异性免疫反应；既可增强正常机体的免疫功能,又可调节异常机体的免疫功能。本研究将APS作为乙型肝炎亚单位疫苗的佐剂与疫苗一起免疫昆明白小鼠,研究其对乙肝疫苗免疫反应的影响,尤其是对细胞免疫反应的影响。实验选取健康雌性6-8周龄昆明白小鼠35只,体重20-24 g,随机分为5组,每组7只,分别为rHBsAg组、rHBsAg+APS组、rHBsAg+aulm组、APS组和对照组(不进行免疫)。初次免疫设为0天,第14天加强免疫一次,在第21天进行免疫学指标的检测。主要结果如下：实验使用定量ELISA法检测IgG水平,用MTT法检测T细胞增殖反应,用流式细胞仪检测体内CTL反应,结果发现APS显著增强乙肝疫苗诱导产生较高的IgG抗体水平,较强的T淋巴细胞增殖反应和体内CTL杀伤反应,表明APS能够增强乙肝疫苗的免疫反应。为进一步研究APS作为乙型肝炎亚单位疫苗的佐剂对免疫反应的影响,对有关免疫学指标作了进一步检测。用RT-PCR法检测PFP、GraB、Fas L和Fas的表达以及用流式细胞仪检测体内细胞因子的表达水平,结果表明APS能够增强乙肝疫苗上调PFP、GraB、Fas L、Fas和CD8+T细胞IFN-γ的表达水平,与体内CTL反应结果一致；APS能够增强乙肝疫苗诱导较高的CD4+T细胞IFN-γ、IL-2和IL-4的表达水平,表明APS作为乙肝疫苗的佐剂能够促进机体Thl型和Th2型免疫反应。为进一步探讨APS作为佐剂增强免疫反应的作用机理,用半定量PT-PCR法对TLR2、TLR4、TGF-β1和Foxp3的表达水平进行检测,结果表明APS能够很好地增强乙肝疫苗诱导TLR2和TLR4表达,通过上调TLR2和TLR4的表达激发协同刺激分子和相关细胞因子的表达参与适应性免疫应答；APS作为乙肝疫苗的佐剂能够明显降低机体TGF-β1和Foxp3表达水平,通过抑制TGF-β1和Foxp3的表达促进机体免疫反应。以上结果表明,APS作为乙型肝炎亚单位疫苗的佐剂能增强乙肝疫苗的免疫反应。本研究初步证实了APS是一种良好的免疫佐剂,能够显著地提高乙型肝炎亚单位疫苗的体液免疫水平和细胞免疫水平,为乙型肝炎疫苗的研发提供了有意义的基础研究数据资料。
参考文献：
[1]. 防龋DNA疫苗pVAX1-SG在小鼠体内分布和表达规律的实验研究[D]. 汪洋. 遵义医学院. 2016
[2]. HepG2.2.15细胞来源的自噬小体疫苗(HBV~+DRibbles)防治HBV感染及其免疫机制的实验研究[D]. 薛萌. 东南大学. 2015
[3]. HPV16型mE7/CD40L DNA疫苗的实验研究[D]. 王庆勇. 中国协和医科大学. 2007
[4]. 六月青多糖及其皂苷对鸭乙型肝炎的治疗作用及分子作用机制研究[D]. 罗秀. 广西医科大学. 2013
[5]. 肺炎链球菌毒力蛋白基因工程疫苗的实验研究[D]. 张巧. 第三军医大学. 2010
[6]. 慢性乙型肝炎及肝硬化患者乙型肝炎表面抗原及乙型肝炎病毒DNA定量检测的临床意义[J]. 孙丹凤, 陆许贞, 谢新生, 王柯尹. 中华危重症医学杂志(电子版). 2017
[7]. 增强靶向融合防龋DNA疫苗粘膜免疫效果的研究[D]. 李宇红. 武汉大学. 2005
[8]. 乙型肝炎治疗性疫苗的研究[D]. 何晓文. 第二军医大学. 2005
[9]. HSP65-HBV多表位融合蛋白乙肝治疗性疫苗的研制[D]. 王华. 吉林大学. 2006
[10]. 黄芪多糖作为佐剂对乙型肝炎疫苗免疫反应影响的研究[D]. 陈小兵. 四川农业大学. 2010
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