吴福泉[1]2001年在《甜菜夜蛾NPV在昆虫细胞的增殖及生物学特性研究》文中指出利用甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)幼虫虫体继代的一株野生型甜菜夜蛾核型多角体病毒(Spodoptera exigua nucleopolyhedrovirus—SeNPV)感染人工饲料无菌饲育的甜菜夜蛾3龄幼虫,3日后发现幼虫染病死亡,镜检病虫尸体发现典型的病毒多角体。取染病幼虫的体液经过滤后感染甜菜夜蛾细胞株Se301,72 h发现大部分细胞核内形成病毒多角体,说明该病毒对Se301细胞具有强烈的感染性。利用细胞培养技术,把含有野生型SeNPV粒子的培养液感染Se301细胞,通过空斑培养进行分离纯化,结果获得15个克隆株,分别把这些克隆株命名为SeNPV G1—SeNPV G15。分别对15个克隆株以及日本滋贺县分离的SeNPV1(S1)进行增殖培养,然后抽提病毒DNA,经EcoRI、Pst I、Xho I叁种限制性内切酶进行酶切电泳分析,从15个克隆株中发现了叁类DNA酶切图谱不同的变异株,和S1的酶切图谱也有差异。分别把这叁类变异株命名为SeNPV G1、SeNPV G3、SeNPV G4。推定其DNA分子量,G1为130.67kb,G3为118.6kb,G4为129.3kb,S1为119.03kb。这些变异株的DNA图谱与美国及中国等报道的DNA图谱均有差异。认为野生型病毒具有自发突变的能力,进一步证明了同种野生型病毒DNA可能是由多种不同株型组成的混合群体。检测叁个变异株G1、G3、G4和日本株S1感染Se301及另外6株非寄主昆虫细胞的增殖情况,结果发现:4个株系对Se301细胞均有强烈的感染性,能在细胞中形成大量芽生型病毒(BV)和多角体,但变异株间的感染性有差异,BV的形成量是G3>S1>G4>G1。4个株系均能感染草地贪夜蛾细胞株Sf9及桑斑灯蛾细胞株SpIm1229,并能形成病毒多角体;能在Sf9细胞中形成BV,但多角体的形成量及在Sf9细胞中BV的
朱丽娜[2]2007年在《甜菜夜蛾核型多角体病毒及其宿主抑制凋亡蛋白的功能研究》文中指出本论文共分五章。第一章为引言。主要介绍了甜菜夜蛾及其防治状况，杆状病毒的主要特征及应用情况，细胞凋亡抑制蛋白IAP以及组织蛋白酶B(CB)的研究概况。第二章主要内容为甜菜夜蛾抑制凋亡基因iap在哺乳动物细胞293 HEK中的功能研究。我们从甜菜夜蛾脂肪体中提取总RNA，反转录成cDNA做为模板，根据GenBank中公布的甜菜夜蛾iap序列设计引物，扩增出甜菜夜蛾iap基因，其大小为1134 bp。将PCR产物克隆到真核表达载体pGEFP-C1。用鉴定正确的重组质粒pEGFP-iap转染293 HEK细胞，并用治疗肿瘤的药物顺铂(cisplatin)诱导细胞凋亡。通过对比实验组及对照组细胞的存活率，表明甜菜夜蛾iap基因在哺乳动物细胞中发挥了预期的抑制凋亡功能。第叁章主要内容为甜菜夜蛾核型多角体病毒(Spodoptera exigua nucleopolyhedrovirus，SeNPV)抑制凋亡基因iap2及iap3在哺乳动物细胞293HEK中的功能研究。我们以SeNPV基因组为模板，根据已知的杆状病毒iap基因序列设计引物，采用PCR技术扩增出SeNPV的iap2、iap3基因，其大小分别为951 bp和939 bp。将PCR产物克隆到真核表达载体pGEFP-C1。用鉴定正确的重组质粒pEGFP-iap2、-iap3分别转染293 HEK细胞，并用治疗肿瘤的药物顺铂(cisplatin)诱导细胞凋亡。通过对比实验组及对照组细胞的存活率，表明甜菜夜蛾病毒iap3基因在哺乳动物细胞中发挥了预期的抑制凋亡功能。第四章主要内容为棉铃虫抑制凋亡基因iap的获得。我们从棉铃虫脂肪体中提取总RNA，反转录成cDNA做为模板，根据鳞翅目昆虫粉蚊夜蛾(Trichoplusia ni)，草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)的iap基因的同源序列，设计引物，扩增出棉铃虫iap基因的一段保守序列。再根据测序结果设计引物分别进行3’RACE和5’RACE扩增，将所得片段克隆至pMD18-T载体并测序，以获得棉铃虫iap基因的cDNA全长。第五章主要内容为甜菜夜蛾组织蛋白酶B基因cb的获得。我们从甜菜夜蛾血淋巴中提取总RNA，反转录成cDNA做为模板，根据本实验室已经获得的甜菜夜蛾cb基因中间段及3’RACE序列设计引物，进行5’RACE扩增，将所得片段克隆至pMD18-T载体并测序，以获得甜菜夜蛾cb基因的cDNA全长。
杜恩岐[3]2006年在《Ⅱ型核型多角体病毒新型P13蛋白的结构、功能及杀虫潜力研究》文中提出p13基因由我们实验室于1995年首次报道。随着大规模基因组测序的发展,越来越多的杆状病毒全基因组被测定,目前已报道的杆状病毒p13基因多达二十多个。奇怪地是这些p13基因均特异地存在于II型核型多角体病毒和部分颗粒体病毒的基因组中。而I型核型多角体病毒基因组中则不存在。对于p13基因的启动子和编码区的结构功能目前已有预测,但尚无相关研究工作报道。本研究对p13基因的启动子活性、p13基因的进化、在天然系统及异源系统中的功能及其潜在的杀虫活性进行了研究,为p13基因进一步深入研究和杀虫潜力应用的开创之举。目前已有14类不同杆状病毒的22个p13基因序列报道,我们经DNASTAR软件对已报道的14类杆状病毒(每类各选一个序列)P13氨基酸同源性比较发现,不同杆状病毒P13之间的同源性在42.1%-74.7%,其中Ls-P13与HaNPV P13同源性最高(58.7%)与PoGV P13最低(44%)。对P13的氨基酸同源性比较和进化树分析表明P13可被分为两个群,I群为GV的P13,它们之间有高度同源性。II群为II型NPV的P13,它们之间同源性差异较大。其中II群根据同源性又可分为两个亚群:I亚群为LsNPV,HaNPV和SlNPV叁种,其他II型NPVs的P13为第II亚群。p13基因5’UTR普遍存在早期启动子核心序列GTGTTATA及CAT/AT盒和晚期启动子核心序列TTAAG盒。在早晚期启动子之间有一3-30aa组成的小ORF,推测这一小顺反子可能具有重要的调控功能。在p13基因5’UTR的上游,有一个杆状病毒普遍存在的同源重复序列(Homologue repeat,简称hr),一般hr有多个,而p13基因的hr的数目因病毒种类的不同而不同。已经证明,杆状病毒的hr是DNA复制的ori和转录激活的增强子,对早期基因的表达有增强作用。因此由p13基因的5’UTR结构,我们推测p13基因为一早晚期基因,并主要在早期发挥作用。以Ha-p13为例,我们证明p13基因启动子从2h.p.i到90h.p.i均有活性。不管在天然Hz-AM1细胞还是在异源Sf9细胞中,Ha-p13基因启动子本身并不是一个强启动子,但在hr4存在时,Ha-p13基因启动子活性在Hz-AM1细胞中提高了20倍,在Sf9细胞中则提高了2000倍。携带hr4增强子的Ha-p13基因启动子活性在天然细胞和异源细胞中存在的巨大差异可能受细胞的某些因子调控。为研究P13蛋白功能,我们以Ha-P13和Ls-P13为例,分别对P13蛋白在天然和非天然宿主昆虫细胞和幼虫中的作用进行了研究。由于携带eGFP的棉铃虫杆状病毒HaSNPV-G本身带有Ha-p13基因,因此我们通过dsRNA-Hap13来沉默Ha-P13的表达。流式细胞仪检测结果发现5μg dsRNA-Hap13可以有效地抑制Ha-P13在Sf9和Hz-AM1细胞中的表达。HaSNPV-G与5μg dsRNA-Hap13共感染发现棉铃虫的死亡率明显下降,而且与dsRNA-Hap13的使用剂量成正相关性。这表明p13在天然系统中是一个杀虫相关基因。另一方面,由于I型核型多角体病毒如AcMNPV中缺少p13基因,因此我们将Ls-p13基因插入AcMNPV基因组构建重组病毒rAc-hr5/IE1-Lsp13-G来检验异源系统中P13的杀虫活性。生物测定实验进一步证明,Ls-P13能够明显提早AcMNPV的杀虫时间。通过杆状病毒Ls-P13或Ha-P13与不携带Ls-p13的AcMNPV共同注射感染幼虫发现,一旦Ls-P13的亮氨酸拉链结构发生突变,Ls-P13的杀虫活性也会随之失去,尽管我们对这种确切机理还没有完全解释清楚,但是P13提早杀虫时间的特性很可能使其成为未来新型生物杀虫剂的侯选基因。为进一步研究P13在异源系统中提早杀虫的机理,我们构建了一系列重组病毒来研究P13对病毒在细胞中增殖的影响。我们发现,P13在Sf9细胞中的表达可以明显抑制多角体的产生,其抑制效率随P13表达时相的提前而加强,即P13的早期表达有更强的抑制作用。当P13的亮氨酸拉链发生突变时,P13对多角体的抑制效率随之丧失。而P13的跨膜区发生缺失时,对多角体的效应与Leu Zipper相反,即抑制效果明显提高。另一方面,P13对出芽病毒(BV)的效应与对多角体的效应不同,我们发现,P13在Sf9细胞中的表达可以明显增加出芽病毒(BV)的产生,当亮氨酸拉链突变时,P13对BV的增殖效率随之丧失;当P13的跨膜区发生缺失时,P13对BV的增殖略有下降。以上结果充分证明P13提前杀虫效果的机制是由于P13改变了BV和多角体之间的动态平衡,主要是由于P13的LZLD(Leucine zipper like domain)减少了多角体产量,增加了BV产量。跨膜区使P13晚期定位在质膜上,与LZLD效果相反的是,当TM缺失后P13的定位向核中转移,对多角体的抑制进一步加强,而对BV增加略有下降。BV的参加则加速了AcMNPV从细胞到细胞的次级感染,所以使注射感染时间大大提早。此外,我们对Ha-P13在天然Hz-AM1细胞和Ls-P13在异源Sf9细胞中的定位进行了研究。得出了一致的结果,我们发现P13不管在天然细胞还是异源细胞中,转染48h后主要定位在细胞质膜上。Ls-P13在异源Sf9细胞中的定位为一动态过程,即早期(12h)定位于细胞核中,随后(24h)从细胞核向细胞质膜移动,最后定位于细胞质膜上。当Ls-P13的I、II跨膜区依次缺失时,Ls-P13的晚期定位逐渐从细胞质膜向细胞核移动。尤其在跨膜区II发生缺失时,绝大部分P13蛋白已脱离了细胞质膜而进入核中。由于多角体在核中装配而BV主要在细胞质膜上装配,而且Ls-P13具有抑制多角体产生和促进BV生成的作用。因此当跨膜区缺失时,Ls-P13的定位从细胞质膜而向核移动,核中的Ls-P13的增加和细胞质膜上Ls-P13的降低很好地解释了为什么在跨膜区缺失后L s-P13对多角体的产生的抑制效果进一步加强而对BV的增强效果稍有下降。另一方面,由于L s-P13早期主要在核中表达,随后从核中向细胞质膜上移动,这也很好地解释了为什么L s-P13对多角体的抑制效果随表达时相的推迟而减弱。
郭慧芳[4]2005年在《昆虫核型多角体病毒的增效途径和机理》文中提出昆虫核型多角体病毒(NPV)作为生物杀虫剂，除了具有对天敌安全、不污染环境和不易产生抗药性等生物农药普遍存在的优点外，更因其能在害虫种群中形成流行病而长期控制虫口这一明显优于其它杀虫剂的特点而受到人们的广泛关注。但NPV也存在杀虫范围窄和作用速度慢等缺点，这大大限制了其在生产上的应用。因此，研究提高其杀虫活性的途径和机理对于开发实用性病毒制剂是至关重要的。 目前对NPV的增效途径和增效机理已有不少研究报道，但斜纹夜蛾NPV(SINPV)尚很少研究。斜纹夜蛾和甜菜夜蛾食性杂，食量大，繁殖力强，是农业生产上的重要害虫，已对许多化学农药产生了抗性，SINPV是具有潜力的替代生物防治剂。因此，本文以斜纹夜蛾和甜菜夜蛾为靶标对象，研究提高SINPV毒力的增效途径和增效机理，以促进SINPV在害虫防治上的开发应用。 一、核型多角体病毒增效途径研究 本研究通过测定不同病毒种和分离株之间复合侵染的增毒作用、交替感染不同寄主对毒力的影响、以及生长调节剂类杀虫剂对病毒的增效作用，寻找提高NPV毒力效果的途径。研究结果如下： (1)不同种病毒间的联合增效作用 研究表明，八字地老虎颗粒体病毒(XcGV)可明显提高核型多角体病毒(NPV)的毒力。在以斜纹夜蛾为靶标对象时，XcGV可提高斜纹夜蛾NPV(SINPV)对3龄幼虫的杀虫速度，害虫的致死中时间(LT_(50))缩短了0.5-2.5d，还可同时提高SINPV对5龄幼虫的杀虫速度和杀虫活性，害虫的死亡率提高了33.8％；此外，联合作用于5龄幼虫时还明显抑制了斜纹夜蛾体重的增长。以甜菜夜蛾为靶标对象时，XcGV可提高XcNPV和SINPV对2龄幼虫的杀虫速度，LT_(50)缩短1.3-1.7d。 (2)SINPV不同分离株间的增效作用 研究发现，斜纹夜蛾核型多角体病毒(SINPV)日本福冈株、小笠原株和埃及株感染斜纹夜蛾，在种群中连续传代的过程中，各分离株单独及复合侵染对斜纹夜蛾的毒力均发生了明显变化。单独侵染连续传代后，各分离株毒力显着提高，但不同分离
周文科[5]2005年在《杆状病毒新型表达系统及P74基因功能和杀虫剂800亩田间释放研究》文中研究表明从大肠杆菌菌株DH10Bac中提取Bacmid,与质粒pGEM-egfp△Ac74 DNA共转染Sf-9细胞,二者在Sf-9细胞内利用Ac-p74基因的侧翼序列进行同源重组,得到重组穿梭载体Bacmid-egfp。收集有绿色荧光的Sf-9细胞上清,进行五轮空斑纯化,并经PCR检测后,得到纯化的重组Bacmid-egfp,从第5轮空斑纯化的Sf-9细胞提取总DNA,电转化E.coli DH10B感受态细胞,在含Kan~r/X-gal/IPTG的LB固体平板上挑取兰色单菌落,即得到含重组Bacmid-egfp的菌株;再将从E.coli DH10Bac中提取的助手质粒pMon7124转化其中,在含Kan~r/Tet~r/X-gal/IPTG的LB固体平板上挑取兰色单菌落,得到了E.coli DH10Bac-egfp菌株,其Bacmid经改造后带有EGFP标记。 从E.coli DH10Bac-egfp提取Bacmid-egfp DNA,转染Sf-9细胞后5天,在荧光显微镜下可以观察到大部分细胞都发出绿色荧光,表明从E.coli来源的Bacmid-egfp DNA仍然保持着对Sf-9细胞的感染性;利用该菌株转座构建的重组穿梭载体Bac-egfp-polh DNA转染Sf-9细胞后,所有产生绿色荧光的细胞都有病毒包涵体的形成,而且所有形成包涵体的细胞都有绿色荧光;我室刘鑫博士利用Bacmid-egfp穿梭载体成功地表达了麻疹病毒受体SLAM,以绿色荧光作标记发现表达的SLAM蛋白定位在Sf-9细胞表面,与人类细胞中的自然定位相同。而且Sf-9细胞表面的SLAM可以介导麻疹病毒对非受纳昆虫细胞的感染。证明该系统维持了亲本Bac to Bac系统的特性和功能,但却增加了亲本Bacmid所不具有的绿色荧光筛选标记。 将多角体蛋白基因和绿色荧光蛋白基因的融合表达盒经Bac to Bac系统转
刘龙[6]2018年在《RBSDV P7-2基因重组AcMNPV及其生物学研究》文中指出本研究将具有诱导细胞凋亡功能的水稻黑条矮缩病毒(Rice black streaked dwarf virus,RBSDV)P7-2基因重组到苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus,AcMNPV)的基因组中,以期为遗传修饰杆状病毒、提高杀虫效果提供新思路。将带有SV40终止子的AcMNPV多角体基因ph、AcMNPV ie-1启动子、在C端融合Flag标签的P7-2基因依次插入到供体质粒pFastBac-HTB的多克隆位点处,使用供体质粒pFastBac-HTB自身的启动子及ie-1启动子分别启动ph和P7-2基因的表达。通过转座的方法将ph、P7-2基因及启动子插入到bacmid bMON14272的多角体位置,获得重组bacmid Ac-P7-2,并通过Western blot检测了P7-2基因的表达。在细胞水平上观察了两种病毒的多角体形成和统计了不同时间死亡细胞数量。通过病毒生长曲线和DNA复制曲线的测定,对比研究了两种病毒的增殖和DNA复制差异。将重组病毒Ac-P7-2和野生型病毒Ac-wt分别感染3龄甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)幼虫,对比研究了P7-2基因重组AcMNPV的杀虫效果。取得的主要结果如下:1.成功构建了P7-2基因能正常表达的重组杆状病毒Ac-P7-2。2.Ac-P7-2能够包装成正常的病毒粒子。从转染后48 h到144 h,Ac-P7-2从形成多角体到细胞破裂释放多角体的速度快于野生型病毒Ac-wt。在转染sf9细胞后48 h、72 h、96 h、120 h,重组病毒Ac-P7-2转染后的细胞死亡数量显着高于Ac-wt(P<0.01),对宿主细胞有较强致死作用。3.两种病毒的病毒生长曲线表明,转染48 h后,Ac-P7-2 BVs的增殖速度显着快于Ac-wt(P<0.01)。两种病毒的DNA复制曲线表明,在转染后72 h、96 h、120 h,Ac-P7-2在sf9细胞中的DNA复制能力显着高于Ac-wt(P<0.01)。4.以3龄甜菜夜蛾幼虫为供试昆虫,测定了两种病毒的LD_(50)、LD_(90)、LT_(50)及LT_(90),结果表明,Ac-P7-2的LD_(50)值约为Ac-wt的1/6,LD_(90)值约为Ac-wt的1/5,表明Ac-P7-2比Ac-wt具有更高的毒力。Ac-P7-2比Ac-wt的LT_(50)少2.4天,Ac-P7-2比Ac-wt的LT_(90)少3.4天,Ac-P7-2具有更快的杀虫速度。
张海元[7]2004年在《甜菜夜蛾核型多角体病毒（SeNPV）的研究及宿主中相关基因的分析》文中研究指明甜菜夜蛾核型多角体病毒(Spotoptera exigua Multi nucleocapsid Nucleopolyhedrovirus ,SeMNPV)能专一性地感染甜菜夜蛾等昆虫，作为生物杀虫剂已得到广泛应用，但其主要缺点是杀虫速度慢。本论文筛选了甜菜夜蛾核型多角体病毒高活性菌株，针对组织蛋白酶基因和超氧化物歧化酶基因，研究它们在甜菜夜蛾核型多角体病毒杀虫剂中的潜在应用价值。具体内容包括：就国内外分离到的甜菜夜蛾核型多角体病毒的两个分离株（SeMNPV-M,SeMNPV-Z）,从其生物活性，多角体蛋白特性等方面进行了比较研究；甜菜夜蛾核型多角体病毒的组织蛋白酶基因的原核表达和生物功能研究；甜菜夜蛾虫体的组织蛋白酶基因序列的测定和分析；甜菜夜蛾核型多角体病毒的超氧化物歧化酶基因的功能和酶活的研究。研究结果为比较全面系统地认识这一类病毒，筛选高活性分离株，并为其作为生物杀虫剂的标准化提供依据，对组织蛋白酶应用于生物杀虫剂的添加剂，超氧化物歧化酶作为生物杀虫剂的光保护剂奠定了理论基础。
姚伦广[8]2004年在《囊膜蛋白P74在杆状病毒侵染宿主的初级感染过程中作用机制的研究》文中认为杆状病毒以其特有的双相复制周期与两种结构与功能不同的病毒粒子类型而区别于其他病毒。为了研究p74在杆状病毒初级感染过程中的作用及其作用机理，采用经典同源重组方法构建了2种p74缺陷型病毒。以同源重组的方式将由多角体启动子驱动的gfP表达盒分别重组到AcMNPV与HaSNPV基因组的p74 ORF位相，从而分别获得两种p74插入失活的重组病毒rAc-gfpΔp74和rHa-gfpΔp74，为下一步研究p74基因的功能打下基础。阳性重组病毒通过空斑纯化，GFP的表达，PCR扩增以及DNA测序来进行筛选与鉴定。所获得的阳性重组病毒通过注射感染能够在宿主细胞和幼虫内表达GFP，甚至在日光下就可以判定重组病毒的感染性，为研究和分析重组病毒的感染过程及机制带来了很大的方便。 为了进一步研究p74的功能，使用Bac-to-Bac系统构建了2个多角体阳性且p74超表达的两种重组病毒rAc-p74~(++)polh~+和rHa-p74~(++)polh~+。两种重组病毒rAc-p74~(++)polh~+和rHa-p74~(++)polh~+分别感染其敏感细胞Sf9和Hz-AM1，被感染宿主细胞中均产生包涵体，说明多角体基因已经成功地转座到Bacmid和Hanpvid中并得到高效率表达。而将感染后的细胞裂解物进行SDS-PAGE电泳，结果发现两种重组病毒感染的宿主细胞均出现2条特异性的带，一条为74 kD左右的P74蛋白带，另一条为30 kD左右的多角体蛋白带。将重组病毒感染的细胞蛋白用Ni~(++)-NTA树脂进行纯化，结果获得纯化的带组氨酸标签的重组P74蛋白，经SDS-PAGE检测到单—74 kD的蛋白带，同时Western blot分析结果表明所纯化的74KD蛋白与抗组氨酸标签的单克隆抗体发生特异性结合，这表明所构建的重组病毒成功的使带组氨酸标签的P74蛋白在宿主细胞内得到了高表达。因此，成功获得了2种既能在宿主细胞中超表达P74蛋白又具有可供口服感染的包涵体形式的重组病母。 比较p74一失活型病毒(包括rAC一gfp△p74和rHa一gfp△p74)，p74“双拷贝病毒(即rAe一p74“polh‘和rHa一p74++ polh‘)、以及p74+野生型病毒(包括wtAeMNPV与wtHaSNPV)这3类病毒的生长曲线，发现这3种病毒的一步生长曲线极其相似，并没有出现显着差异。说明无论是p74基因的失活，还是p74基因的超表达，都几乎不影响BV装配和形成，也不影响BV的产量和增殖。进一步研究发现p74一失活型病毒，p74++双拷贝病毒、以及p74+野生型病毒所产生的病毒包涵体的产量之间没有显着的差异。将纯化的包涵体病毒在电子显微镜下进行观察，发现3类病毒形成的包涵体之间在大小，形状方面基本相似，也没有明显的区别或者差异。这说明了p74的缺失、超表达对包涵体病毒的形状、大小、产量几乎没有什么影口向。 但是3类病毒包涵体感染宿主幼虫的生物测定结果表明，p74一重组病毒包涵体失去了对敏感宿主幼虫的感染力。而p74++双拷贝病毒对宿主幼虫的感染率和p74十野生型病毒对宿主幼虫的感染率十分接近。以上结果充分说明了P74蛋白的超表达不影响病毒包涵体的毒力和感染力。但是p74基因的缺失却导致了感染力的丧失，这说明p74是NPV包涵体病毒感染宿主的必要因子，在病毒侵入宿主中肠过程中起到十分关键的作用。而使用野生型病毒和p74缺陷型病毒共感染宿主昆虫时，幼虫被有效地感染并发出绿色荧光。这说明在野生型病毒的拯救下，P74缺陷型病毒突破了宿主中肠的防御而有效感染了宿主幼虫。 由于野生型病毒能拯救p74缺陷型重组病毒包涵体对宿主幼虫的感染力，提示着P74蛋白在毒力拯救过程中发挥了功能，所以有必要使用纯化的P74蛋白进行确证。将两种重组病毒rAc一p74++polh+和rHa一p74++ polh+分别感染Sfg细胞和Hz一AMI细胞。收集感染后48和72小时的细胞进行SDS一PAGE分析和Western Blot分析，结果表明被感染细胞高效表达了带有HIS一tag(组氨酸标签)的重组P74蛋白。并用Ni++一NTA亲和树脂纯化该重组蛋白，结果成功地获得纯化的带有组氨酸标签的融合P74蛋白。 将纯化的P74蛋白与同种的p74缺陷型重组病毒包涵体一起喂食敏感宿主幼虫，结果发现由于P74蛋白的存在，使得p74缺陷型病毒恢复了对敏感宿主幼虫的感染力，由于GFP的表达，被感染幼虫在3天后虫体变成绿色，最终液化死亡。并且这种拯救是一种可饱和的方式。AcMNPV一P74蛋白只能拯救同种的p74一AcMNPV的口服感染力，而不能拯救p74书aSNPV，反之HaSNPV一P74蛋白也只能拯救同种p741aSNPV而无法拯救p74认cMNPV的口服感染力。这说明一种P74蛋白只能拯救自身p74缺陷病毒的感染力而不能拯救异源p74缺陷病毒，因此P74蛋白和宿主的相互作用具有种属特异性，很可能和病毒的宿主范围有一定的关系。 用HaSNPV一Bacmid(Hanpvid)构建了高表达P74一GFP融合蛋白的重组病毒rHa一p74gfp。用该重组病毒感染Hz一AMI细胞，在病毒接种后24小时、36小时、48小时、72小时取样，直接在激光扫描共聚焦显微镜下观察被感染细胞的形态以及细胞中绿色荧光分布情况。rHa一p74gfP感染后24小时，绿色荧光主要出现在细胞质中，说明绿色的P74一GFP融合蛋白大部分集中在胞质中。感染后36小时，绿色荧光只要在细胞核中被观察到，表明绿色融合蛋白主要集中?
王成燕[9]2012年在《混合侵染和交替传代对斜纹夜蛾核型多角体病毒宿主域和毒力影响及机制》文中进行了进一步梳理核型多角体病毒(Nucleopolyhedrovirus, NPV)作为一类昆虫病原微生物,资源丰富,对害虫作用独特且对环境安全,是一种理想的害虫生物防治剂。但天然的昆虫病毒因宿主范围窄、作用速度慢和作用活性低,大大限制了其在生产上的应用。如何打破昆虫病毒的专化性以及提高它们的毒力成了拓宽昆虫病毒应用范围的重点和难点。NPV间自然重组现象较为普遍,不同NPV间重组可产生宿主域扩大病毒；另外病毒的毒力与宿主密切相关,在一种新宿主中的连续传代可提升其对传代宿主毒力,不过其对原宿主毒力显着下降。病毒在两种不同宿主中交替传代后,病毒能否对两种宿主同时具有高毒力?尚无实验证明。因此,研究不同病毒混合侵染后的宿主域变化及其在不同宿主中交替传代过程中的毒力演化对于揭示病毒进化规律及发掘宿主域扩大和病毒毒力提升具有着重要意义。本研究以鳞翅目重大害虫斜纹夜蛾Spodoptera litura和甜菜夜蛾S. exigua为靶标对象,首先研究两种病毒混合侵染后的宿主域变化,接着研究宿主域扩大病毒在甜菜夜蛾和斜纹夜蛾中交替传代时的毒力演化,最后研究病毒多角体超微结构变化和遗传变异,主要研究结果如下：1病毒混合侵染后的宿主域扩大和交替传代时的毒力演化本文选用不能经口感染甜菜夜蛾的斜纹夜蛾NPV (SINPV)日本福冈株和不能经口感染斜纹夜蛾的甜菜夜蛾NPV (SeNPV)美国株,将它们共同侵染甜菜夜蛾后,获得了能同时感染甜菜夜蛾和斜纹夜蛾的宿主域扩大病毒株系,其对斜纹夜蛾的致病力与SINPV相当,致死中浓度(LC50值)无显着差异,同时对甜菜夜蛾也具备了一定的侵染力,但尚显着低于SeNPV对甜菜夜蛾的毒力。进一步将该病毒在甜菜夜蛾和斜纹夜蛾这两种宿主中按4种模式进行交替传代,分别为以甜菜夜蛾和斜纹夜蛾为起始宿主的严格交替传代,以及以甜菜夜蛾和斜纹夜蛾为起始宿主的非严格交替传代,研究病毒毒力的演化规律。发现宿主域扩大病毒在经历斜纹夜蛾和甜菜夜蛾多代交替传递过程中,其对甜菜夜蛾的毒力有显着上升,且对斜纹夜蛾的毒力未有显着下降,但在传递20代过程中,除从斜纹夜蛾开始的严格交替传代模式下,病毒对甜菜夜蛾的毒力一直呈上升趋势,以甜菜夜蛾为起始宿主的严格交替模式以及两种非严格交替传代模式下,病毒对甜菜夜蛾毒力未一直呈上升趋势,在14代以内显着上升,此后则有所下降。研究表明两种宿主中的交替传代可以提高病毒对一种宿主的适应性且同时保持了其对另一种宿主的适应性。2混合侵染和交替传代后多角体超微结构变化通过透射电镜观察研究了病毒混合侵染和交替传代后其多角体超微结构变化。比较了混合侵染前、混合侵染后、交替传代后以及连续传代后病毒的多角体超微结构。观察结果表明,各病毒均属多粒包埋型病毒,混合侵染没有引起病毒多角体大小的改变,多角体直径无显着差异。但经以斜纹夜蛾为起始宿主的交替传代以及在斜纹夜蛾中的连续传代后,病毒多角体的直径显着减小。同时还发现混合侵染和交替传代都没有造成病毒多角体内病毒束数量的改变,多角体内病毒束平均数量在各病毒间无显着差异。但带来病毒束内核衣壳数量的变化,经过混合侵染及在甜菜夜蛾和斜纹夜蛾中的一次交替传代后,病毒束内平均病毒核衣壳数较起始的SINPV福冈株显着下降,在经历20代次交替后,仍显着低于福冈株,而在斜纹夜蛾中连续传代时病毒核衣壳的数量未有显着变化。另外从各病毒束内不同核衣壳的分布来看,SeNPV美国株中病毒束内核衣壳分布均匀,62.5%病毒束中病毒核衣壳数量为3个,而其余病毒则分布较广,在以斜纹夜蛾为起始宿主的交替传代后的病毒中,病毒核衣壳的数量在1-12个间。研究表明,SeNPV和SlNPV昆合侵染以及在两种宿主中交替繁殖后能够改变其多角体的组装,从而带来多角体超微结构的变化。3混合侵染后宿主域扩大病毒polh和iap基因变异通过基因组酶切、基因克隆分析研究了病毒混合侵染后的遗传变异。病毒基因组DNA限制性酶切结果表明,混合侵染后宿主域扩大病毒的基因组DNA酶切图谱较混合侵染前的SINPV福冈株没有产生明显变化,Pst Ⅰ、Hind Ⅲ、EcoR Ⅰ和Xba Ⅰ这4种限制性酶切图谱均与混合侵染前一致。进一步对病毒多角体蛋白基因(polh)分析发现,病毒混合侵染后其polh基因序列较混合侵染前SlNPV在第281个碱基上发生突变,氨基酸序列也发生相应的变化。另还对宿主域扩大病毒细胞凋亡抑制基因(iap)进行了克隆,发现其与已报道的SpliNPV iap基因同源性达95%,与SlNPV中国株G2iap基因同源性和SlNPV日本株iap同源性均只有80%。4混合侵染和交替传代后病毒全基因组序列变化分析对混合侵染和交替传代前后叁个病毒株系的全基因组序列进行了分析,研究发现,SlNPV和SeNPV经过混合侵染后产生的宿主域扩大病毒,在基因组大小上较SlNPV福冈株变小,基因数量也有变化,少了1个基因,基因总长度也有增加；再经过交替传代,基因总长度进一步变长。再从各病毒基因总长度占基因组的百分比来看,混合侵染后产生的宿主域扩大病毒较混合侵染前SlNPV基因总长度占基因组百分增加,再经交替传递20代后,百分比进一步增加。各病毒株系GC含量变化不大。病毒基因组全序列具体分析则发现混合侵染后病毒lef-8(晚期表达因子)基因产生了一个碱基的变化,另外病毒基因组内有一个255bp片段的插入,且在进一步交替传递20代后,此变化仍存在。
梅春蕾[10]2006年在《甜菜夜蛾核多角体病毒和宿主昆虫细胞凋亡抑制蛋白基因的克隆及表达》文中提出本论文共分叁章。第一章为引言。主要介绍了杆状病毒的主要特征,杆状病毒的iap基因以及细胞凋亡抑制蛋白IAP概述第二章主要内容为以甜菜夜蛾核多角体病毒基因组为模板,根据已知的杆状病毒iap基因序列设计引物,采用PCR技术扩增出甜菜夜蛾核型多角体病毒(Spodoptera exigua nucleopolyhedrovirus,SeNPV)的iap2和iap3基因,SeNPV iap2和iap3的分子大小分别为951bp和939 bp,两个基因编码蛋白均含有RING结构,其中IAP2含有2个BIR区,IAP3含有1个BIR区。将PCR得到的iap2和iap3基因分别克隆到表达载体pET-28a上。用表达载体pET28a-iap2转化宿主菌BL21(DE3)感受态细胞,挑取单菌落并接种于加卡那霉素的LB中,扩大培养后加入IPTG诱导表达,表达结果显示,含iap2基因载体的表达产物在电泳中出现一条约40kDa的表达带,与理论推测的蛋白分子量一致。第叁章论述了从甜菜夜蛾的脂肪体中提取总RNA,反转录成cDNA做为模板,根据鳞翅目昆虫粉蚊夜蛾(Trichoplusia ni),草地滩夜蛾(Spodoptera frugiperda)和家蚕(Bombyx mori)的IAP(inhibitor of apoptosis)基因的同源性设计引物,通过PCR调出IAP基因的一段序列,根据测序结果再设计引物分别做3‘race和5’race,获得甜菜夜蛾IAP蛋白的整个cDNA序列。甜菜夜蛾的IAP基因包括两个杆状病毒的重复序列和一个RING结构。根据从NCBI中比对的结果可知,甜菜夜蛾的IAP与草地滩夜蛾(Spodoptera frugiperda)同源性最高,其次为粉蚊夜蛾(Trichoplusia ni),而与家蚕(Bombyx mori)的同源性最低。另外,甜菜夜蛾IAP与杆状病毒CpIAP和OpIAP有一定的同源性。获得甜菜夜蛾全cDNA序列后,根据ORF序列设计引物,分别进行原核表达,和真核表达,原核表达载体为PET-28a,真核表达载体为pEGFP-C1。
参考文献：
[1]. 甜菜夜蛾NPV在昆虫细胞的增殖及生物学特性研究[D]. 吴福泉. 华南农业大学. 2001
[2]. 甜菜夜蛾核型多角体病毒及其宿主抑制凋亡蛋白的功能研究[D]. 朱丽娜. 中国科学院研究生院（武汉病毒研究所）. 2007
[3]. Ⅱ型核型多角体病毒新型P13蛋白的结构、功能及杀虫潜力研究[D]. 杜恩岐. 武汉大学. 2006
[4]. 昆虫核型多角体病毒的增效途径和机理[D]. 郭慧芳. 南京农业大学. 2005
[5]. 杆状病毒新型表达系统及P74基因功能和杀虫剂800亩田间释放研究[D]. 周文科. 武汉大学. 2005
[6]. RBSDV P7-2基因重组AcMNPV及其生物学研究[D]. 刘龙. 西北农林科技大学. 2018
[7]. 甜菜夜蛾核型多角体病毒（SeNPV）的研究及宿主中相关基因的分析[D]. 张海元. 中国科学院研究生院（武汉病毒研究所）. 2004
[8]. 囊膜蛋白P74在杆状病毒侵染宿主的初级感染过程中作用机制的研究[D]. 姚伦广. 武汉大学. 2004
[9]. 混合侵染和交替传代对斜纹夜蛾核型多角体病毒宿主域和毒力影响及机制[D]. 王成燕. 南京农业大学. 2012
[10]. 甜菜夜蛾核多角体病毒和宿主昆虫细胞凋亡抑制蛋白基因的克隆及表达[D]. 梅春蕾. 中国科学院研究生院（武汉病毒研究所）. 2006