一、Cloned goats (Gapra hircus) from foetal fibroblast cell lines（论文文献综述）
李昊[1]（2019）在《Myostatin基因敲低克隆绵羊的研究》文中指出肌肉生长抑制素（Myostatin,MSTN）是一种生长因子,属于TGF-β超家族,主要在骨骼肌细胞中表达,对肌肉的生长具有负调控作用。MSTN基因的过表达可引起肌肉萎缩,而MSTN基因发生突变或被敲除时则会使动物的肌肉量增加,产生双肌现象。本研究利用克隆获得的绵羊MSTN基因构建真核表达载体,同时设计合成MSTN干涉序列并构建RNA干涉载体,共转染293GP细胞后经荧光定量PCR检测获得干涉效率最佳的载体;将其线性化后转染绵羊成纤维细胞后,经G418筛选获得MSTN敲低转基因细胞系;以MSTN敲低转基因细胞为核供体,利用细胞核移植的方法获得MSTN敲低转基因绵羊克隆胚和转基因绵羊,以期建立获得肌肉丰满绵羊新品系的方法。此外,本研究利用CRISPR/Cas9系统,获得了基因编辑胚胎和小鼠,为后续利用CRIISPR/Cas9系统获得基因打靶绵羊奠定基础。本研究的结果与结论如下:1、绵羊MSTN基因RNA干涉载体构建和活性分析（1）绵羊Myostatin基因的克隆:参照GenBank中绵羊MSTN基因序列（AF019622.1）,采用RT-PCR扩增技术,克隆绵羊肌肉生长抑制素基因,将其连接到pcDNA3.1（+）载体,获得肌肉抑制素基因真核表达载体;（2）RNA干涉表达载体的构建:参照绵羊MSTN基因的mRNA序列,设计合成RNA干涉序列并与pRNAT-U6载体连接,获得RNA干涉表达载体。与真核表达载体共转染293GP细胞后,通过实时定量PCR检测干涉效率,获得干涉效果最佳序列。（3）RNA干涉载体表达活性检测:将筛选获得的RNA干涉载体线性化,采用显微注射的方式,注射到小鼠原核时期的胚胎中,注射后的胚胎可以分裂为2细胞,经体外培养最终获得表达绿色荧光蛋白的囊胚,表明所构建的RNA干涉载体可以在胚胎中正常表达并支持胚胎的发育。2、绵羊MSTN敲低转基因成纤维细胞系的建立通过脂质体转染法将线性化的RNA干涉载体转染到绵羊成纤维细胞中,经G418筛选,获得转基因阳性细胞;PCR结果显示,构建的基因已整合到细胞基因组中;对获得的转基因阳性细胞的形态学特征、生长曲线以及冷冻复苏后特征的检测结果表明,转基因细胞具有正常细胞的生物学特征。3、绵羊MSTN敲低转基因胚胎的获得（1）供体细胞的修饰和处理:来源于成纤维细胞的核移植胚胎的卵裂率为44.6%,高于MSTN敲低转基因细胞的33.0%,且差异显着,但两者的桑/囊胚率差异不显着（分别为24.1%和15.6%）;供体细胞不需进行血清饥饿处理,使用接触抑制方法可以达到相同效果。（2）重构胚的融合、激活和培养:采用逐个融合（一次一个）的融合方式能显着提高融合效率,但融合后的胚胎发育能力和批量融合（一次多个）方法比差异不显着;采用A23187+6-DMAP激活卵母细胞与采用Ionomycin+6-DMAP激活方法之间的效果差异不大;重构胚融合后培养34 h后再进行激活可有效提高胚胎卵裂和囊胚发育率。KSOM和SOFaa都可以用来进行绵羊克隆胚的体外培养。4、转基因核移植胚胎的移植和胎儿鉴定（1）重构胚的移植:采用输卵管移植方法,将原核期或2-细胞期的核移植胚胎（242枚）移植到同步发情的受体绵羊（23只）体内,以检验其在体内的发育能力。（2）转基因胎儿鉴定:在23只受体中,最终只有1只受体妊娠,但妊娠期间发生流产,未能获得成活个体,获得流产胎儿1只;对流产胎儿进行PCR鉴定,结果显示,胎儿基因组中整合有目的基因。5、肌肉特异表达Cas9蛋白打靶胚胎的获得（1）Rosa26基因sgRNA的设计和体外验证:根据小鼠Rosa26基因序列设计sgRNA,体外编辑试验表明,所设计的sgRNA可以对Rosa26位点发生编辑作用;（2）肌肉特异打靶载体的构建:通过PCR和同源重组连接,成功构建了肌肉特异表达Cas9蛋白的同源打靶载体Donor-SP-Cas9-DsRed;（3）Rosa26基因编辑胚胎和小鼠的获得:注射Rosa26 sgRNA和Cas9到小鼠胚胎,注射后的胚胎可以正常卵裂并支持囊胚发育,通过PCR和测序结果显示,获得的胚胎为基因编辑胚胎,注射的胚胎经胚胎移植后,获得了 Rosa26基因编辑小鼠;（4）通过将同源打靶载体与Rosa26 sgRNA和Cas9联合注射的方式,获得肌肉特异表达Cas9蛋白的基因打靶胚胎;综上所述,通过构建MSTN基因RNA干涉载体、转染绵羊成纤维细胞建立MSTN敲低转基因细胞系和转基因细胞核移植等程序,可以获得MSTN敲低的绵羊转基因克隆胚,胚胎移植后获得流产胎儿且携带外源基因,表明获得的重构胚具有体内发育能力,可以通过该方法获得MSTN敲低的转基因绵羊。本研究结果为培育MSTN敲低的绵羊新品系提供了依据。此外,通过利用CRISPR/Cas9系统,获得了基因编辑胚胎和小鼠,初步在小鼠上建立了基因编辑和基因打靶体系,为后续利用CRISPR/Cas9系统获得基因打靶绵羊奠定基础。
马群[2]（2012）在《波尔山羊体细胞核移植的研究》文中研究指明本试验研究了波尔山羊体细胞核移植中供体细胞的原代和传代培养、成纤维细胞体外培养过程中β-半乳糖苷酶的表达、受体卵母细胞的体外成熟以及以成年羊体细胞作核供体（P14）的克隆波尔山羊的获得。试验采用组织块培养法和酶消化法两种方法，均有效的建立了波尔山羊的成纤维细胞系，通过生长曲线测定确定分离培养的波尔山羊皮肤成纤维细胞基本符合体外培养细胞生长的特性。细胞解冻后仍能保持与冻存前一样的生长速度，表明本试验冻存的各项条件和解冻复苏程序是适宜的。本试验中体外培养的波尔山羊成纤维细胞成功培养至50代，在50代时没有出现明显的群体增殖休止，理论上可以继续培养传代。年龄对成纤维细胞体外培养过程中的衰老有重要影响，同一代培养传代的细胞，老年动物阳性率比青年动物高，青年动物阳性率比幼年动物高，差异极显着（P<0.01）。衰老细胞数量随细胞代龄的增加而增加，且两者之间呈极显着相关（P<0.01），而且幼羊第10代和第15代之间差异显着（P<0.05），青年母羊第15代和第20代之间无显着差异（P>0.05），不论哪个年龄组，20代及其后代间阳性率差异极显着（P<0.01），表明细胞代龄对成纤维细胞的衰老有显着影响。从第10代到第45代，性别对成纤维细胞的衰老有显着的影响，同一批次阳性率公羊极显着低于母羊（P<0.01），但第50代两者之间无显着差异（P>0.05）。不论是来自屠宰场卵巢，还是经过FSH超排处理的卵巢，A、B级卵母细胞的体外成熟率均高于C级（分别为84.1%，77.4%比44.8%和70.3%，65.5%比41.7%），差异极显着（P<0.01），表明卵母细胞级别对体外成熟率有显着影响，但A、B级细胞间差异不显着（P>0.05）。FSH处理和屠宰场来源的卵巢，A、B级卵母细胞数量在获卵总数中所占的比例分别为86.2%和58.3%，平均每个卵巢获卵母细胞数分别为9.6和4.1，其中A、B级卵母细胞数分别为8.3和2.4，均是FSH处理卵巢高于屠宰场卵巢，差异显着（P<0.05），表明FSH超数排卵处理，可显着提高卵巢采集的卵母细胞数量和质量。FSH处理卵巢的卵母细胞体外成熟率高于屠宰场卵巢（81.6%比67.6%），差异极显着（P<0.01），表明FSH超数排卵处理，可显着提高卵巢采集的卵母细胞的体外成熟率，提高卵母细胞的发育能力。首次成功获得了用长期培养的成年山羊体细胞（P14）作为核供体的克隆山羊，并建立了一套完整的核移植技术程序。
刘军[3]（2011）在《转人溶菌酶和人β-防御素3基因克隆山羊的生产》文中进行了进一步梳理利用核移植技术生产转基因动物对农业生产和生物医学领域具有重要的应用价值。然而,核移植的总体效率较低,而且核移植动物存在多种异常表现,严重限制了该技术的广泛应用。而且转基因核移植技术操作步骤繁琐,全世界仅个别实验室可以利用该技术批量生产转基因动物。为了生产抗乳腺炎转基因奶山羊,本研究对山羊体细胞核移植体系和转基因供体细胞的制备进行了一系列优化。1.研究了激活时间、细胞松弛素B（CB）处理、胚胎培养条件、移植时间和移植胚胎数等因素对山羊核移植胚胎体内和体外发育的影响。结果显示,融合后2和3 h 90%以上的供体核显示浓缩型和中期样的染色体形态,而且激活后的囊胚率显着高于1、4和5 h的胚胎（P < 0.05）;CB处理组的囊胚发育率（24.8% vs. 17.7%; P < 0.05）和克隆胚胎早期妊娠率显着高于对照组（31.3% vs. 10.3%; P < 0.05）,有4只克隆羊出生;每只受体移植20和30枚胚胎组的胎儿存活率高于10和40枚组。结果表明,融合后胚胎在CB中处理2～3 h再激活,可提高山羊克隆胚胎的体内和体外发育能力,每只受体移植20～30枚早期克隆胚胎,早期妊娠率稳定在45%以上和胎儿出生率为38.2%。2.研究了不同胎儿成纤维细胞系的增殖能力、染色体稳定性、细胞周期和凋亡、转染效率和转人溶菌酶基因克隆山羊的生产效率。结果显示,5个细胞系（GFF1、GFF2、GFF3、GFF4和GFF5）中增殖能力和染色体稳定性:GFF1、GFF2>GFF4、GFF3;处理后G1/G0期细胞比例GFF4>GFF3、GFF5>GFF2>GFF1;细胞凋亡:GFF4<GFF1、GFF5<GFF3<GFF2;转基因效率:GFF2、GFF1>GFF5、GFF4、GFF3;不同转基因细胞系克隆胚胎体外发育能力:F2C11≥F3C1、FC3、F1C7、F3C2、F2C2>F5C3、F5C3;转基因克隆胚胎体内发育能力:FC3、F1C7>F3C1、F3C2。结果说明,来源不同胎儿的成纤维细胞系的增殖能力和染色体稳定性不同,增殖能力和染色体稳定性较高的细胞系转染后的克隆形成率和扩增率较高,此外各转基因细胞系的核移植效率差异显着,转基因核移植过程中应当选择多个转基因细胞系作为供体细胞,可以降低风险;本研究获得健康转人溶菌酶基因克隆山羊,早期妊娠率为30%,核移植效率1.2%。3.利用转基因核移植技术生产转人β-防御素3（Human beta-defensin-3,HBD3）基因克隆山羊。结果显示,共获得7个转基因阳性细胞克隆,以其中两个转基因细胞系为供体细胞构建克隆胚胎,30 d的妊娠率为40.5%（32/79）,妊娠到期的比例为21.5%（17/79）,17只羊分娩产下26只小羊,产羔率为32.9%（26/79）其中多胎率为35.3%（6/17）,核移植总体效率为1.4 %。通过PCR和Southern杂交鉴定,9只存活的小羊全部为转基因羊,拷贝数为5个左右,反向PCR鉴定整合位点5’端距离β-乳球蛋白前体基因（beta-lactoglobulin precursor）1587 bp,3’端距离糖基转移酶6蛋白1基因9598 bp（glycosyltransferase 6 domain-containing protein 1）。4.利用Tricine SDS-PAGE电泳及Western Blot检测目的基因HBD3的表达,并以纯化的转基因山羊乳腺上皮细胞进行了继代克隆,研究继代克隆对核移植效率的影响。结果表明,转基因羊乳腺上皮细胞经过诱导可分泌人防御素3蛋白;转基因羊乳腺上皮细胞（TGMEC）克隆胚胎的融合率、卵裂率和囊胚发育率与非转基因羊乳腺上皮细胞（GMEC）的克隆胚差异不显着,但两组实验的融合率较低（分别为54.5%和49.7%）,早期妊娠率为20%,但没有获得克隆后代。结果说明,继代核移植不能提高转基因克隆胚胎的发育能力。本论文开展的系列研究,对于完善山羊转基因核移植技术体系,批量生产转基因抗病动物,具有重要的应用价值。
胡日查,王玉宝,吴科榜[4]（2010）在《山羊体细胞核移植研究进展》文中研究表明体细胞核移植是目前生物技术领域的研究热点之一。山羊是转基因动物研制的理想模型,又是畜牧业生产中的一个重要畜种,而且还可以用转基因奶山羊进行乳腺生物反应器的研究等,因此,山羊的体细胞核移植具有较大的研究价值。就山羊体细胞核移植的研究情况进行了概述。
张艳丽[5]（2010）在《转基因克隆法制作人溶酶体β-葡萄糖苷酶奶山羊乳腺生物反应器的研究》文中研究指明人溶酶体β-葡萄糖苷酶（human lysosomal acidβ-glucosidase, GlcCerase）是糖蛋白降解途径的主要外糖苷酶,参与糖蛋白的回收利用。该酶减少或缺失会导致葡萄糖脑苷脂不能有效降解,在各器官中大量沉积,从而使机体发生广泛的病理变化,临床上称为“戈谢病”,酶替代法是目前该病的主要疗法。人体来源的GlcCerase获得极为困难,应用哺乳动物细胞和转基因植物表达系统生产重组人GlcCerase虽然已经有一些成功的报道,但也面临许多难以克服的问题,如在CHO细胞表达重组人GlcCerase,生产成本过于昂贵；在转基因植物中表达,存在重组蛋白质中糖链结构的改变以及下游加工处理困难等限制。如果应用转基因动物乳腺生物反应器生产重组人GlcCerase,在得到天然活性较高产品的同时,将极大地降低生产成本,具有其它表达系统所不能代替的优势。然而,显微注射法的高成本、低效率长期以来制约着转基因动物研究的发展,体细胞转基因与核移植相结合制备动物乳腺生物反应器是当今转基因整合表达的一种有效途径。因此,本研究选取人溶酶体β-葡萄糖苷酶作为研究对象,首先克隆人GlcCerase cDNA序列并对其在COS7细胞中的表达进行初步研究,然后构建含有人GlcCerase cDNA的乳腺表达载体,经体外培养的乳腺上皮细胞验证载体的有效性后,进一步将该载体转染奶山羊胎儿成纤维细胞,筛选稳定转基因细胞克隆株,通过体细胞核移植法生产转基因奶山羊克隆胚胎,以期获得乳腺特异性表达GlcCerase的转基因奶山羊乳腺生物反应器。本研究共分为六个部分,第一、二部分进行了人GlcCerase基因的克隆、表达载体的构建及体外细胞表达研究；第三、四部分主要是分离培养了奶山羊胎儿成纤维细胞,并优化了脂质体法转染该细胞的体系,获得了稳定整合人GlcCerase基因的供体细胞；第五部分利用转人GlcCerase基因的奶山羊胎儿成纤维细胞进行了核移植,研究转基因供体细胞对克隆胚胎体外发育的支持作用,并对克隆胚胎进行了胚胎移植；第六部分探讨了外源基因导入对奶山羊体细胞周期分布、细胞凋亡和基因表达水平的影响。主要的研究结果如下：第一部分人GlcCerase cDNA序列的克隆及真核细胞表达试验中,首先从人胎盘组织中分离提取得到总RNA,利用RT-PCR方法,直接获得人GlcCerase基因的编码序列,经测序分析,所得GlcCerase cDNA与GeneBank中同源性为99%,发现1个碱基差异,导致天冬氨酸到甘氨酸的改变。为了尽快检测所获得的目标基因是否能正常编码获得重组蛋白质,本试验以pEGFP-Cl为基础质粒,构建了含有人GlcCerase基因的真核表达载体pEGFP-GlcCerase。用脂质体介导法将该载体转染入COS7细胞中进行暂态表达研究,可见报告基因GFP顺利表达,经RT-PCR和荧光酶学法进行验证,在细胞中检测到了GlcCerase的mRNA表达,并在细胞裂解产物中检测到了GlcCerase的生物活性。这些结果表明所克隆的人GlcCerase cDNA能够正确编码蛋白,发挥生物学功能,可以用于下一步的乳腺表达载体构建。第二部分人GlcCerase基因乳腺特异性表达载体的构建及乳腺细胞表达试验中,将在体外经真核细胞表达验证正确的GlcCerase基因以及细胞筛选标记基因（Neor）插入含有山羊p-酪蛋白基因调控序列的pBC1载体中,经PCR和酶切鉴定,得到正确的重组质粒pBCl-GlcCerase-Neo。为了检测乳腺表达载体的有效性,将该载体转染入小鼠乳腺上皮细胞系——HC-11细胞中,经G418抗性筛选,获得阳性克隆细胞,将克隆细胞扩大培养后,经PCR检测结果表明,人GlcCerase基因己成功转入到HC-11细胞中。进一步用催乳素、胰岛素及氢化可的松诱导培养转基因细胞,经RT-PCR和Western-blot检测表明,山羊p-酪蛋白基因启动子驱动的人GlcCerase基因能够在乳腺上皮细胞中转录翻译并分泌到胞外。这些结果表明,所构建的人GlcCerase基因乳腺表达载体具有生物学功能,为下一步利用该载体进行转基因供体细胞的建立奠定了基础。第三部分奶山羊胎儿成纤维细胞的分离培养及脂质体法转染研究,采用组织块培养法结合胰蛋白酶消化法分离纯化得到奶山羊胎儿成纤维细胞,绘制了生长曲线,鉴定了胎儿细胞性别及核型特征,结果表明：该培养体系可以支持奶山羊胎儿成纤维细胞的体外生长,其细胞形态为梭形,高度汇合后呈火焰状,增殖特性以及核型特征均为正常,性别鉴定显示该奶山羊胎儿细胞为雌性,符合体细胞转基因克隆的基本要求。进一步利用脂质体法将pEGFP-Cl质粒转染入该细胞,研究了脂质体量、质粒量和转染时间对转染效率的影响,获得了脂质体转染该细胞的最佳条件：24孔细胞培养板中采用4.0μL脂质体转染试剂,1.2μg质粒DNA,细胞在复合物中孵育6 h。这为下一步目的基因转染奶山羊胎儿成纤维细胞的研究提供了参考依据。第四部分建立转人GlcCerase基因奶山羊胎儿成纤维细胞的试验,利用上述优化的转染体系,将线性化的乳腺特异性表达载体pBC 1-GlcCerase-Neo转染胎儿成纤维细胞,经G418筛选8-10天后,获得抗性细胞克隆,进一步通过96孔细胞培养板分离得到来源于单个转基因成纤维细胞的细胞克隆,经PCR扩增检测,得到稳定整人GlcCerase基因的转基因供体细胞8株,和对照组细胞比较,转基因过程中没有导致细胞的生长和核型异常。转基因细胞的核型（2n=58+XX）正常比例为66.8%,而第10-12代的非转染细胞核型正常率为70.9%,二者差异不显着（P>0.05）。这些结果表明可以利用这些阳性转基因细胞作供体细胞进行核移植研究。第五部分人GlcCerase转基因克隆胚胎的制备研究,采集屠宰山羊卵巢,获取卵母细胞并体外成熟培养,成熟率为63.3%。以100%汇合2天的转基因体细胞作核供体,以去核的MⅡ期卵母细胞作核受体进行核移植操作。完成核移植的卵母细胞采用122 kV/cm、20μs/次、间隔1s的直流电脉冲进行融合,融合率为83.3%,融合后的重构胚胎进一步用Ionomycin和6-DMAP进行激活处理,然后转移到SOFaa培养液中与单层卵丘细胞共培养,重构胚的卵裂率为89.1%,发育至桑葚胚/囊胚期的比例为36.4%。以正常体细胞来源的核移植胚胎作为对照,其融合率、卵裂率以及桑葚胚/囊胚率分别为77.8%、90.9%和38.9%,两种供体细胞来源的融合率和胚胎发育率差异不显着。手术法将发生卵裂且形态正常的转基因克隆胚（2-细胞期或以上）移植到同期发情的山羊输卵管中,16只受体山羊中有6只一直没有返情,在第40天经B超检测到2只妊娠的结果,但是最终妊娠没有发育到期,胎儿发生流产。第六部分探讨了外源基因转染对供体细胞生物学特性的影响。将构建的乳腺表达载体pBC1-GlcCerase-Neo分别转染体外培养的奶山羊乳腺上皮细胞、胎儿成纤维细胞以及成年皮肤成纤维细胞,获得整合有外源基因GlcCerase的转基因体细胞。以非转染的正常细胞为对照,利用流式细胞仪分析了转基因奶山羊体细胞的细胞周期分布和细胞凋亡的情况,研究结果显示：三种转基因细胞100%汇合2d后,G0/G1细胞的百分比都显着低于对照组细胞（P<0.05）,其中转基因胎儿成纤维细胞的G0/G1期比例高于其它两种转基因细胞；转基因胎儿成纤维细胞凋亡率达22.56%,较对照组细胞有显着提高（P<0.05）；然后进一步利用荧光定量PCR法探讨了外源基因转染对胎儿成纤维细胞基因表达模式的影响,检测的基因分别为基因印记基因（IGF2, IGF2R）、凋亡相关基因（Bax）、应激相关基因（热休克蛋白,Hsp70.1）、细胞连接相关基因（Cx43）和DNA甲基化转移酶1基因（DNMT1）。其中IGF2, IGF2R和Cx43mRNA的转录水平显着高于对照组非转染的对照组细胞（P<0.05）。本研究首次从细胞周期分布、细胞凋亡以及基因表达变化模式等方面探讨外源基因转染对奶山羊体细胞的影响,探索转基因克隆效率低的内在机制,为更好地促进供体细胞的重编程,进一步提高转基因克隆的效率奠定了基础。
巴特尔[6]（2010）在《山羊体细胞核移植的研究》文中认为本实验研究了绒山羊体细胞核移植中供体成纤维细胞的的原代和传代培养、受体卵母细胞的体外成熟以及重构胚的激活和培养,并将重构胚移植给代孕受体。实验采用组织块培养法,在37℃、5%CO2、饱和湿度条件下,DMEM/F12+10%FBS培养液适宜于绒山羊皮肤成纤维细胞的体外生长,通过组织块培养法可以有效地建立绒山羊成纤维细胞系;传代培养时,酶消化法可以分离纯化绒山羊皮肤成纤维细胞;通过生长曲线测定和染色体计数可确定分离培养的绒山羊皮肤成纤维细胞基本符合体外培养细胞生长特性（2n=60）;在山羊卵母细胞的采集方法上比较了切剖法与抽吸法对卵母细胞成熟的影响,结果发现,切剖法所获得的卵母细胞的成熟率比抽吸法的高（P<0.05）;研究了在卵母细胞体外成熟液中,添加不同血清对卵母细胞体外成熟的影响。结果表明,自然发情的山羊血清对卵母细胞的成熟效果最好（P<0.05）,PG诱导发情的山羊血清对卵母细胞的成熟效果也要比FBS好（P<0.05）;在对山羊卵母细胞孤雌激活的研究上,采用了电激活和化学激活两种方法,结果显示,这两种方法都可以激活山羊卵母细胞,其中离子霉素联合6-DMAP激活山羊卵母细胞的卵裂率、囊胚率为78.1%和20.4%,显着高于7%乙醇联合6-DMAP的卵裂率28.7%、囊胚率3.2%和电激活的卵裂率55.3%、囊胚率9.3%;山羊孤雌胚在6-DMAP中作用2～4 h在囊胚率上没有差异（P>0.05）;采用山羊卵丘细胞单层共培养孤雌胚,共培养囊胚率17.5%,非共培养囊胚率15.4%,对胚胎发育没有显着差异（P>0.05）;融合电压从2400～3200V/cm、脉冲时间30μs、脉冲次数2时,都可以使重构胚融合,并且都能发育到卵裂,但是只有2800V/cm电压融合时,能发育到囊胚,囊胚率为13.2%;将所得的重构胚140枚移植到11只受体羊中,没有羊妊娠。
刘凤军,张玉玲,杨自军,陈兴启,孙达权,王国华,张涌[7]（2008）在《体细胞核移植法获得转人乳铁蛋白基因克隆山羊妊娠的研究》文中研究说明[目的]探讨供体细胞类型、移植胚胎发育阶段、数量及部位对山羊转基因克隆效率的影响。[方法]利用体细胞核移植技术将转染人乳铁蛋白基因hLF的山羊胎儿成纤维细胞（GFF）和乳腺上皮细胞（GMGE）移植到MII期去核卵母细胞内,经电融合、激活、体外培养后,28细胞期克隆胚被移植到同期发情山羊的输卵管内,囊胚被移植到子宫角内。[结果]GFF与GMGE的妊娠率相近（输卵管移植妊娠率分别为26.47%及20.00%）;在GFF,输卵管移植的妊娠率与子宫角内移植妊娠率接近（分别为26.47%及25.00%）,输卵管移植胚胎平均数为21.2组的妊娠率显着高于5.93组和9.64组（40.00%及26.67%,21.43%）。[结论]供体细胞类型、移植胚胎的发育阶段及移植部位对山羊转基因克隆效率的影响不大,但对于输卵管移植,受体羊移植胚胎数量对妊娠率有明显的影响。此外,该研究还提示了利用成年羊乳腺上皮细胞制作转基因动物的可行性。
崔奎青[8]（2007）在《转基因体细胞克隆水牛与广西水牛的遗传特性研究》文中研究指明首先分离培养水牛胎儿成纤维细胞，并检测细胞传代培养过程中的核型稳定性和支原体污染情况。结果发现，组织块法和胰酶消化法均可从水牛胎儿皮肤组织获得大量高活力细胞，15代以前的水牛胎儿成纤维细胞生长良好。分别对体外培养5代、15代、25代和30代的胎儿成纤维细胞染色体分析结果显示，核型的正常率随体外传代增加呈下降趋势，但各代细胞之间差异不显着（P＞0.05），核型正常比率均在75％以上。设计两对PCR引物对第5、15、25和30代细胞的支原体检测污染情况进行了检测，结果检测细胞样本和阴性对照均为阴性，说明培养到30代以内的水牛胎儿成纤维细胞没有发生支原体污染。上述结果表明，在现有实验条件下水牛胎儿成纤维细胞能进行稳定传代培养，可满足体细胞核移植与转基因操作的需要。在此基础上，对影响水牛胎儿成纤维细胞在极低细胞接种密度条件下生长增殖和细胞集落形成的各种因素进行了系统的研究。结果发现，低密度接种的水牛胎儿成纤维细胞总体细胞集落形成率低于20％；在培养液中添加适宜浓度的胰岛素对水牛胎儿成纤维细胞的增殖具有显着的促进作用；培养液中添加不同浓度的细胞条件培养液，能明显改善细胞的增长；进口血清比自制血清更有利于提高细胞集落形成率；使用多聚赖氨酸做生长介质可以让细胞集落形成率增加，而琼脂和明胶的作用相反。这些研究结果表明，低密度接种的水牛胎儿成纤维细胞集落形成率较低；在培养液中添加胰岛素、条件培养液、进口血清及以多聚赖氨酸为细胞生长介质，可以提高水牛胎儿成纤维细胞集落形成率。对电穿孔法和阳离子脂质体法转染水牛胎儿成纤维细胞的条件进行系统摸索，获得了较好的DNA转染参数。电穿孔法转染时脉冲时间为15ms，电场强度为40～50V／mM时，细胞的死亡率处于20％～50％之间，比较适合外源DNA转入水牛胎儿成纤维细胞。将脂质体与DNA的比例控制在8μL：2μg，可获得较高的转染率。相同培养条件下，脂质体法比电穿孔能获得更多的转基因抗性细胞集落，转染DNA的纯度和细胞的状态也明显影响脂质体法的转染效率。用含有GFP基因的线性化载体pCE-EGFP-IRES-Neo-dNdB通过lipofectamineTM2000转染水牛胎儿成纤维细胞，G418筛选2周后挑取抗性细胞集落扩大培养，对转染外源基因的抗性细胞系的生物学特性进行了分析。结果发现，经过G418筛选后细胞增殖活力下降，细胞爬片HE染色后可看到细胞形态发生变化，凋亡分析发现部分抗性细胞表现出早期凋亡征状，但染色体核型正常率与正常组相比差异不明显。这些结果表明，转染本身或随后的筛选过程会对细胞造成一定的损害。从绵羊基因组扩增得到β-casein基因启动子区到第二内含子区4.1kb的5调控序列，从人基因组克隆得到人血小板生成素（TPO）基因长5.5kb的基因组序列，然后将启动子和TPO定向插入到ploxp骨架上。包含CMV超级启动子的GFP片段从质粒pCE-EGFP-IRES-Neo-dNdB中获得，并定向连接到ploxp-CN-TPO中。经酶切、PCR鉴定，成功获得了包含人TPO基因、绵羊β-casein启动子、GFP标记基因和新霉素抗性基因等长达20kb的转基因载体ploxp-EGFP-CN-TPO。通过脂质体介导将构建好的载体线性化后导入水牛胎儿成纤维细胞中，G418筛选后得到35个抗性细胞集落，扩大培养后其中4个表达GFP绿色荧光。经PCR鉴定目的基因整合的完整性，发现1个为完整转EGFP-CN-TPO基因阳性细胞集落。通过显微操作、电融合的方法将阳性细胞移入体外成熟去核的水牛卵母细胞内构建重组胚，囊胚率显着低于对照组（P＜0.05），说明供体细胞经过基因转染及长期体外培养筛选对克隆胚胎的早期发育有明显影响；对转基因体细胞构建核移植重组胚外源基因表达进行检测发现，绿色荧光蛋白开始表达于4细胞以后的重组胚，说明转染的外源基因能够在胚胎早期发育过程中表达。为研究广西沼泽水牛核基因组的多态性，采用23对荧光标记微卫星引物，对随机抽取的60个广西本地水牛样本进行了PCR检测，然后联合应用具有多态性的位点进行培养细胞的遗传鉴定。结果发现，23对引物中，有19对可以获得特异性产物且存在多态，平均有效等位基因数为4.0189，基因座ILSTS086含有13个等位基因；各微卫星基因座的平均杂合度变化范围为0.1852～0.4722，ILSTS019基因座平均杂合度最高（0.4722），而ILSTS017平均杂合度最低（0.1852）；群体基因平均多态信息含量（PIC）为0.6639，19个标记中有18个PIC大干0.5，属高度多态位点。联合应用19个位点对培养细胞的基因组来源进行同一分析，证明培养细胞与供体水牛基因型完全相同，培养细胞基因组来源于供体水牛。研究结果表明，18个微卫星标记可进一步用于水牛亲缘关系的分析研究。为研究广西沼泽型水牛线粒体D-loop区DNA的多态性，比较分析沼泽型水牛与河流型水牛之间的差异，本研究对26头广西本地水牛、8头贵州贵阳水牛、11头广西水牛与河流型水牛杂交后代、9头尼里拉菲和12头摩拉水牛（共4个品种66头水牛个体）的线粒体全长D-loop序列进行了扩增测序。66头水牛912bp的D-loop多重序列比较结果发现了147个多态位点，共形成58个单体型，其中中国沼泽型水牛与河流型水牛后裔单体型明显分成两簇；以牛为外群通过NJ、ML和贝叶斯方法构建的单体型进化树显示，沼泽型与河流型水牛分成明显两大支，河流型水牛聚在一起，而在沼泽型水牛内部又分成两个侧支；观察单体型之间的遗传关系与距离的median joining network网络分析产生三个区，与进化树分析结果一致；66头水牛D-loop区序列的碱基错配分布分析表明，水牛群体在历史上发生两次独立的群体扩增事件。为进一步验证实验结果，我们从genebank上下载了211条水牛D-loop序列与我们得到的序列整合在一起进行分析，在共有序列878bp区域中，包含了158个多态位点，共获得129个单体型；以牛为外群的进化树分析与单体型网络分析表明，沼泽型水牛分成两簇，所有的河流型水牛聚集成一紧密的簇，与进化树结果一致；碱基错配分布分析结果呈现两个明显的峰，进一步推断水牛群体在历史上发生过两次大的群体扩增。根据上述结果推断：沼泽型水牛与河流型水牛来自不同的家养化事件，沼泽型水牛起源于中国，其祖先可能存在两个基因池。
黄伟伟[9]（2007）在《牛体细胞核移植的研究》文中指出本研究以牛卵母细胞为材料,体外成熟培养牛卵母细胞,同时分离牛耳皮肤成纤维细胞和颗粒细胞为供核细胞,对牛卵母细胞体外成熟培养和核移植的影响因素进行了探讨,优化了牛体细胞核移植技术方案,为进一步进行转基因牛和分离牛ntESCs的研究奠定了基础。实验主要结果如下:1.供核细胞的准备从两头荷斯坦奶牛采取耳组织块,采用组织块法分离得2株成纤维细胞株BEF422和BEF274,并取第13代BFF422进行核型分析,核型正常（2n=60,XX）,证明细胞在传代培养过程中染色体数目未发生异常。可以作为供核细胞使用。利用成熟后的COCs的颗粒细胞,可以简单快速的分离得到颗粒细胞。2.牛卵母细胞体外成熟培养体系的建立从屠宰场采集牛卵巢,选择颗粒细胞层数2层以上、胞质均一的COCs进行体外成熟培养,对培养液组份进行了比较发现:⑴在基础培养液(TCM-199+2.5μg/mL丙酮酸钠+10mM/L HEPES+2mM/L谷胺酰胺+50μL/mL ITS+0.1 IU/mL hMG+1μg/mL E2+10 ng/mL EGF中分别添加FBS, NBS, BSA和PVA四种血清或血清替代物,其中添加10mg/ml BSA和10%FBS的成熟率无显着差异,但均显着高于10%NBS和1.0%PVA（P < 0.05）;激活后,添加10mg/ml BSA的分裂率显着高于其他三组（P < 0.05）, 10%FBS与1.0%PVA之间差异不显着,10%NBS分裂率最低。囊胚率1.0%PVA显着高于其他组,10mg/ml BSA和10%FBS之间囊胚率差异不显着,10%NBS囊胚率最低。表明添加10mg/ml BSA和10%FBS对牛卵母细胞成熟率和激活后胚胎发育率差异不大,二者可以相互代替用于牛卵母细胞体外成熟。⑵在无血清体外成熟培养体系中添加50μg/ml的尿嘧啶能提高牛卵母细胞的成熟率和囊胚率,与添加0,100,150μg/ml时的牛卵母细胞成熟率间存在差异显着（P < 0.05）,表明在成熟培养液中添加50μg/ml的尿嘧啶,既能促进牛卵母细胞的体外成熟,又能提高牛孤雌胚囊胚发育率。⑶在无血清体外成熟培养体系中添加不同浓度的ATP均不能提高牛卵母细胞的成熟率,但添加500,750μg/ml的ATP能提高牛卵母细胞激活后的囊胚发育率,与添加0,250μg/ml组相比存在差异显着（P <0.05）, 500,750μg/ml组间差异不显着（P >0.05）,但以添加500μg/ml时的囊胚发育率最高。表明在成熟培养液中添加ATP不能促进牛卵母细胞的体外成熟,但能提高牛孤雌胚囊胚发育率,尤其是添加500μg/mlATP的效果最佳。因此,使用TCM-199+2.5μg/mL丙酮酸钠+10mM/L HEPES+2mM/L谷胺酰胺+50μL/mL ITS+0.1 IU/mL hMG+1μg/mL E2+10 ng/mL EGF+10mg/ml BSA+50μg/ml尿嘧啶的无血清体外成熟培养体系比较有利于牛卵母细胞体外成熟和激活后胚胎发育。3.牛体细胞核移植⑴比较不同融合方案对牛重构胚融合及胚胎发育的影响。方案③（1.9KV/cm,10μs,一次电脉冲）的融合率（70.05%vs 59.48%,59.24%,33.07%, P <0.05）和激活后囊胚率（37.6%vs 20.24%,32.53%,18.92%, P <0.05）显着高于其他三组,表明方案③的融合效果最好,并能够促进重构胚的发育,提高囊胚率。⑵筛选最佳融合电压和脉冲时间。以方案③为基础方案,对融合电压和脉冲时间进行优化。结果显示1.9KV/cm的融合率,分裂率,囊胚率均高于1.8KV/cm和2.0 KV/cm组（P < 0.05）;10μs和15μs组之间的融合率,分裂率及囊胚率均高于20μs组（P < 0.05）,但二者之间差异不显着（P>0.05）,15μs囊胚率稍高于10μs。表明1.9KV/cm和15μs是较为适宜的融合电压和脉冲时间。⑶筛选最佳激活方法。离子酶素+6-DMAP的分裂率（91.6%vs 88.04%,87.5%,89.91%, P <0.05）和囊胚率（37.61%vs 34.93%,26.37%,32.65%, P <0.05）显着高于其他三组,表明离子酶素+6-DMAP能显着提高牛重构胚地发育率,是一种良好的激活方法。⑷筛选最佳激活时间。重构胚经电融合后间隔3h激活的分裂率（90.75% vs 83.51%,86.27%, P <0.05）和囊胚率（32.41% vs 27.28%vs16.05%, P <0.05）显着高于间隔1h和2h,表明延迟3h激活对牛重构胚体外发育有利。⑸筛选最佳重构胚培养体系。牛重构胚在序贯培养液G-1/G-2中分裂率（90.91%vs85.95%vs73.50%,P<0.05）和囊胚发育率（36.67%vs 27.88%vs18.60%,P<0.05）要显着高与SOFaa和CR1aa,而CR1aa培养液也也显着高与SOFaa,表明在三种胚胎培养液中序贯培养液G-1/G-2能更好的支持牛重构胚的发育。⑹共培养效果比较。牛重构胚在序贯培养液G-1/G-2和牛颗粒细胞共培养体系中无论是分裂率,还是囊胚率均显着高于单独使用G-1/G-2序贯培养液（P<0.05）。表明在与牛颗粒细胞共培养条件下,G-1/G-2序贯培养液才能更好的支持牛重构胚的发育。⑺不同供核细胞对牛体细胞核移植的影响。三种牛体细胞（颗粒细胞、成年成纤维细胞BEF422和BEF274）中,颗粒细胞的融合率（70.35%）,分裂率（94.07%）和囊胚率（40.94%）均显着高于成年成纤维细胞BEF422和BEF274 （P<0.05）。不同个体来源的成年成纤维细胞BEF422和BEF274之间融合率和分裂率无显着差异（P>0.05）,但BEF422的囊胚率显着高于BEF274（P<0.05）。表明颗粒细胞重构胚发育率要高于成年成纤维细胞,而不同个体来源的成年成纤维细胞重构胚发育率也有差异。⑻不同代数供核细胞对牛体细胞核移植的影响。BEF422的P20～21的融合率低于P6～7细胞（68.02% vs 73.72%）,但是分裂率（92.86%）和囊胚率（38.46%）显着高于P6～7细胞（P<0.05）。表明高代数的细胞作供核的核移植效率高于低代数的细胞。⑼不同品种受体对牛体细胞重构胚妊娠率的影响。进行了23次胚胎移植试验,214枚重构桑椹胚或早期囊胚移植给43头自然发情7d的受体牛,其中荷斯坦奶牛32头,秦川牛11头。移植75d后直检34头,7头妊娠,妊娠率20.59%。荷斯坦奶牛细胞重构胚移植的荷斯坦奶牛和秦川牛受体中,妊娠率无显着差异（P>0.05）。表明胚胎移植受体的品种差异对牛核移植胚胎的妊娠率影响不大。
郑月茂[10]（2005）在《转基因山羊乳腺上皮细胞系建立与转基因克隆胚发育》文中提出本研究通过PCR 法克隆了2 248 bp 的山羊β-乳球蛋白基因5′端调控序列,以之作为启动子指导人乳铁蛋白基因在山羊乳腺上皮细胞中特异性表达,以验证表达载体构建的合理性和外源基因的表达效率。利用脂质体包裹含人乳铁蛋白基因cDNA 的重组质粒pBLIG,并导入到山羊乳腺上皮细胞,经G418 及PCR 筛选获得阳性细胞,以之作为供体细胞利用核移植技术构建转基因克隆胚。应用PCR 法检测转基因克隆胚中的外源基因,并与荧光观察进行对照,从而实现在转基因克隆胚早期发育过程中对外源基因的检测,为进一步对荧光阳性胚胎进行移植,以期得到转基因动物个体奠定基础。研究结果如下: 1. 山羊乳腺上皮细胞传至第15 代时其生长仍正常。山羊乳腺上皮细胞增殖可形成圆顶型结构,呈乳头状,称之为乳球体;大多数上皮细胞呈短梭形或多角形,呈蜂窝状;部分细胞呈圆饼状,体积较大;出现部分长形细胞。第15 代细胞表面微绒毛极为发达,细胞质中线粒体和粗面内质网丰富并含有大量脂滴,表明细胞增殖活力旺盛。染色体分析表明,山羊乳腺上皮细胞系稳定,在离体培养条件下细胞未发生转化。通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳对山羊乳腺上皮细胞培养上清液中的蛋白质进行分离,发现山羊乳腺上皮细胞上清液有3 个条带与标准酪蛋白的3 个条带一致,表明本研究培养的上皮细胞为山羊乳腺上皮细胞,在体外培养条件下能表达山羊酪蛋白。2. 利用PCR 法克隆了山羊β-乳球蛋白基因5′调控序列（2 248 bp）,其中包括第一外显子及第一内含子。PCR 产物回收纯化后,克隆在pMD 18-T Vector 的T 位点。质粒标记为pBLG。序列分析表明,该序列与发表的山羊序列同源性达99.70 %。计算机分析表明,此调控序列含有多个调节因子结合位点或反应元件,包括STAT5（MGF）信号转导子和转录激活子5（乳腺因子）结合位点、CCAAT/增强子结合蛋白结合位点、SP1 因子结合位点、Milk box“乳盒”、TBF 因子结合位点、视黄酸反应元件（RARE）、乳腺特异性因子（MSBF）和核因子1（NF1）结合位点等,这提示此调控序列可调控外源基因在乳腺上皮细胞中高效表达,可用于构建乳腺特异性表达载体。3. 将质粒pBLG 和表达载体pEGFP-c1 用AseI 和NheI 双酶切,回收目的片断,T4DNA
二、Cloned goats (Gapra hircus) from foetal fibroblast cell lines（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、Cloned goats (Gapra hircus) from foetal fibroblast cell lines（论文提纲范文）
（1）Myostatin基因敲低克隆绵羊的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 肌肉生长抑制素(Myostatin,MSTN) |
| 1.1.1 MSTN基因的发现 |
| 1.1.2 MSTN基因和蛋白结构 |
| 1.1.3 MSTN基因的表达 |
| 1.1.4 MSTN的作用机制 |
| 1.1.5 MSTN的表达调控机制 |
| 1.1.6 MSTN基因的应用前景 |
| 1.2 RNA干涉 |
| 1.2.1 RNA干涉现象的发现 |
| 1.2.2 RNA干涉的作用机制 |
| 1.2.3 RNA干涉的作用特点 |
| 1.2.4 siRNA和shRNA技术优缺点 |
| 1.2.5 哺乳动物的RNA干涉 |
| 1.2.6 RNA干涉的应用前景 |
| 1.3 卵母细胞的体外成熟 |
| 1.3.1 卵母细胞的成熟 |
| 1.3.2 卵母细胞的成熟调控机制 |
| 1.3.3 卵母细胞成熟的特征 |
| 1.3.4 卵母细胞成熟的影响因素 |
| 1.4 哺乳动物细胞核移植 |
| 1.4.1 哺乳动物胚胎细胞核移植研究进展 |
| 1.4.2 哺乳动物胚胎干细胞核移植研究进展 |
| 1.4.3 哺乳动物体细胞核移植研究进展 |
| 1.4.4 哺乳动物转基因细胞核移植研究进展 |
| 1.4.5 影响细胞核移植结果的因素 |
| 1.4.6 核移植存在的问题 |
| 1.5 CRISPR/Cas9 |
| 1.5.1 CRISPR/Cas9的发现 |
| 1.5.2 Cas9蛋白的结构 |
| 1.5.3 CRISPR/Cas9的作用机制 |
| 1.5.4 CRISPR/Cas9面临的问题和挑战 |
| 1.6 研究的目的与意义 |
| 2 绵羊Myostatin基因RNA干涉载体构建与活性分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验动物、细胞和菌株 |
| 2.1.2 实验载体信息 |
| 2.1.3 药品和试剂 |
| 2.1.4 溶液的配制 |
| 2.1.5 主要仪器设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 绵羊Myostatin基因克隆与序列分析 |
| 2.2.2 绵羊Myostatin真核表达载体的构建 |
| 2.2.3 绵羊Myostatin基因RNA干涉载体的构建 |
| 2.2.4 293GP细胞的复苏和传代培养 |
| 2.2.5 绵羊Myostatin基因RNA干涉载体效率检测 |
| 2.2.6 绵羊Myostatin基因RNA干涉载体的显微注射 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 绵羊Myostatin基因的克隆与序列分析 |
| 2.3.2 绵羊Myostatin基因真核表达载体的构建 |
| 2.3.3 绵羊Myostatin基因RNA干涉载体测序 |
| 2.3.4 293GP细胞复苏传代与转染 |
| 2.3.5 RNA干涉效率结果与分析 |
| 2.3.6 RNA干涉载体表达活性分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 本章小结 |
| 3 绵羊Myostatin基因敲低成纤维细胞系的建立 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验动物 |
| 3.1.2 主要药品和试剂 |
| 3.1.3 溶液配制 |
| 3.1.4 主要仪器设备 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 RNA干涉载体的线性化 |
| 3.2.2 绵羊皮肤成纤维细胞的培养 |
| 3.2.3 G418浓度的筛选 |
| 3.2.4 绵羊皮肤成纤维细胞的转染及筛选 |
| 3.2.5 绵羊MSTN敲低转基因细胞系的鉴定 |
| 3.2.6 绵羊MSTN敲低转基因细胞的冷冻保存 |
| 3.2.7 绵羊MSTN敲低转基因细胞的冷冻复苏 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 绵羊皮肤成纤维细胞的原代培养 |
| 3.3.2 最适G418浓度的筛选 |
| 3.3.3 转基因细胞的生物学特征 |
| 3.3.4 转基因阳性细胞的PCR鉴定 |
| 3.3.5 冷冻复苏的转基因细胞的生物学特征 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 本章小结 |
| 4 绵羊Myostatin基因敲低细胞核移植 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 实验动物 |
| 4.1.2 药品试剂 |
| 4.1.3 溶液配制 |
| 4.1.4 仪器设备 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 绵羊卵母细胞的获取 |
| 4.2.2 绵羊卵母细胞的体外成熟 |
| 4.2.3 绵羊成熟卵母细胞的孤雌激活 |
| 4.2.4 绵羊皮肤成纤维细胞的复苏 |
| 4.2.5 显微操作前的实验准备 |
| 4.2.6 核供体细胞的准备 |
| 4.2.7 核受体卵母细胞的准备 |
| 4.2.8 卵母细胞的去核和注核 |
| 4.2.9 重构胚的融合与激活 |
| 4.2.10 重构胚的体外培养 |
| 4.2.11 转基因胚胎的分子鉴定 |
| 4.2.12 转基因胚胎的移植 |
| 4.2.13 数据统计 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 卵巢的保存和运输对绵羊卵母细胞成熟的影响 |
| 4.3.2 绵羊卵母细胞的采集方法和分级对卵成熟的影响 |
| 4.3.3 卵密度和不同成熟液对绵羊卵母细胞成熟的影响 |
| 4.3.4 绵羊卵母细胞成熟时间对成熟和去核的影响 |
| 4.3.5 不同的激活方法对绵羊卵母细胞孤雌激活的影响 |
| 4.3.6 供体细胞修饰和处理对绵羊重构胚发育的影响 |
| 4.3.7 绵羊重构胚融合方式对核移植胚胎发育的影响 |
| 4.3.8 重构胚激活前培养时间对绵羊重构胚发育的影响 |
| 4.3.9 不同培养液对绵羊核移植重构胚发育的影响 |
| 4.3.10 转基因重构胚的获得和PCR鉴定 |
| 4.3.11 胚胎移植和流产胎儿鉴定 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 卵巢的保存和运输 |
| 4.4.2 卵母细胞的采集、分级和培养 |
| 4.4.3 供体细胞的遗传修饰和处理 |
| 4.4.4 重构胚的融合、激活和培养 |
| 4.4.5 转基因动物的生产 |
| 4.5 本章小结 |
| 5 肌肉特异表达Cas9蛋白打靶胚胎的获得 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 实验动物和菌株 |
| 5.1.2 实验载体信息 |
| 5.1.3 药品和试剂 |
| 5.1.4 溶液的配制 |
| 5.1.5 主要仪器设备 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 小鼠Rosa26基因sgRNA的设计与获得 |
| 5.2.2 Rosa26基因sgRNA体外编辑效率检测 |
| 5.2.3 肌肉特异性小鼠Rosa26同源打靶载体的构建 |
| 5.2.4 小鼠胚胎的显微注射 |
| 5.2.5 注射后囊胚的基因分型和检测 |
| 5.2.6 胚胎移植和基因分型检测 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 sgRNA获得与体外编辑效率检测 |
| 5.3.2 肌肉特异表达同源打靶载体的构建 |
| 5.3.3 小鼠Rosa26基因编辑胚胎的获得 |
| 5.3.4 Rosa26基因编辑小鼠的获得 |
| 5.3.5 肌肉特异表达Cas9蛋白小鼠胚胎的获得 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 本章小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（2）波尔山羊体细胞核移植的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英文对照 |
| 第一部分 文献综述 |
| 1.细胞核移植发展过程 |
| 1.1 哺乳动物胚胎细胞核移植发展历程 |
| 1.2 哺乳动物胚胎干细胞核移植进展 |
| 1.3 哺乳动物体细胞核移植研究进展 |
| 1.4 山羊细胞核移植研究进展 |
| 2.核移植技术程序 |
| 2.1 供核细胞的准备 |
| 2.1.1 供体细胞类型对核移植效率的影响 |
| 2.1.2 供核细胞的周期 |
| 2.1.3 供体细胞的培养代数 |
| 2.2 受体细胞的准备 |
| 2.2.1 受体细胞的选择 |
| 2.2.2 卵母细胞的体外成熟 |
| 2.2.3 受体细胞的去核 |
| 2.3 重构胚的构建 |
| 2.3.1 透明带下注射法 |
| 2.3.2 胞质内注射法 |
| 2.4 重构胚的激活 |
| 2.5 重构胚的体外培养 |
| 2.6 胚胎移植 |
| 3.体细胞核移植技术的应用前景 |
| 3.1 在畜牧业上的应用 |
| 3.1.1 优良家畜的快速扩繁 |
| 3.1.2 生产转基因动物 |
| 3.1.3 保护濒危动物 |
| 3.2 在医学上的应用 |
| 4 本项目研究的目的和意义 |
| 第二部分 试验研究 |
| 第一章 波尔山羊皮肤成纤维细胞的分离和培养 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 试验试剂 |
| 1.3.1 主要试剂 |
| 1.3.2 主要溶液的配制 |
| 1.4 试验方法 |
| 1.4.1 原种波尔山羊皮肤成纤维细胞系的建立 |
| 1.4.1.1 组织块培养法 |
| 1.4.1.2 酶消化法 |
| 1.4.1.3 原代细胞的传代培养 |
| 1.4.1.4 成纤维细胞的纯化 |
| 1.4.1.5 成纤维细胞的冻存 |
| 1.4.1.6 成纤维细胞的解冻复苏 |
| 1.4.2 成纤维细胞生长曲线 |
| 2 结果 |
| 2.1 皮肤成纤维细胞原代和传代培养 |
| 2.2 成纤维细胞的生长曲线 |
| 3 讨论 |
| 3.1 供体细胞的选择 |
| 3.2 原代细胞的培养方法 |
| 3.3 成纤维细胞的分离纯化 |
| 3.4 成纤维细胞的冷冻与解冻 |
| 3.5 成纤维细胞的生长曲线 |
| 4 小结 |
| 第二章 成纤维细胞体外培养过程中β-半乳糖苷酶的表达 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 主要溶液的配制 |
| 1.4 试验方法 |
| 1.4.1 成纤维细胞的分离培养 |
| 1.4.2 细胞的形态学观察 |
| 1.4.3 成纤维细胞β-半乳糖苷酶染色 |
| 1.4.4 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 细胞的形态学观察 |
| 2.2 β-半乳糖苷酶染色检测 |
| 2.2.1 β-半乳糖苷酶染色形态 |
| 2.2.2 β-半乳糖苷酶染色阳性率与细胞代龄之间的相关分析 |
| 2.2.3 年龄对成纤维细胞衰老的影响 |
| 2.2.4 代龄对成纤维细胞衰老的影响 |
| 2.2.5 性别对成纤维细胞衰老的影响 |
| 3 讨论 |
| 3.1 皮肤成纤维细胞的体外长期培养 |
| 3.2 衰老相关β-半乳糖苷酶染色的研究 |
| 3.2.1 年龄对成纤维细胞衰老的影响 |
| 3.2.2 代龄对成纤维细胞衰老的影响 |
| 3.2.3 性别对成纤维细胞衰老的影响 |
| 4 小结 |
| 第三章 山羊卵母细胞的体外成熟 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 山羊卵巢的采集 |
| 1.1.1 FSH 超数排卵处理山羊卵巢的采集 |
| 1.1.2 屠宰场山羊卵巢的采集 |
| 1.2 主要仪器和耗材 |
| 1.3 试验试剂 |
| 1.3.1 主要试剂 |
| 1.3.2 溶液的配制 |
| 1.4 方法 |
| 1.4.1 卵丘-卵母细胞复合体（Cumulus Oocyte Complexes, COCs）的采集 |
| 1.4.2 COCs 的体外成熟培养 |
| 1.4.3 成熟的检查 |
| 1.5 数据分析 |
| 2、结果与分析 |
| 2.1 卵母细胞级别对体外成熟率的影响 |
| 2.2 卵巢来源对卵母细胞采集数量和质量的影响 |
| 2.3 卵巢来源对卵母细胞体外成熟率的影响 |
| 3 讨论 |
| 3.1 卵母细胞级别对体外成熟率的影响 |
| 3.2 卵巢来源对卵母细胞采集数量和质量的影响 |
| 3.3 卵巢来源对卵母细胞体外成熟率的影响 |
| 4、小结 |
| 第四章 成年体细胞克隆波尔山羊的研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 试验试剂 |
| 1.3.1 主要试剂 |
| 1.3.2 溶液的配制 |
| 1.4 方法 |
| 1.4.1 供体细胞的准备 |
| 1.4.2 受体卵母细胞的获得 |
| 1.4.3 核移植 |
| 1.4.4 融合 |
| 1.4.5 重构胚的激活与体外培养 |
| 1.4.6 受体山羊的同期发情与胚胎移植 |
| 1.4.7 妊娠检查 |
| 2、结果与分析 |
| 3 讨论 |
| 3.1 克隆动物的获得 |
| 3.2 核移植 |
| 3.3 融合 |
| 3.4 重构胚的激活与体外培养 |
| 3.5 胚胎移植 |
| 4 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（3）转人溶菌酶和人β-防御素3基因克隆山羊的生产（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 综述部分 |
| 第一章 提高体细胞核移植效率的研究进展 |
| 1.1 体细胞核移植技术的发展 |
| 1.2 体细胞核移植方法 |
| 1.3 提高核移植效率的方法 |
| 1.3.1 受体胞质的选择 |
| 1.3.2 供体细胞的选择和处理 |
| 1.3.3 激活方法对核移植效率的影响 |
| 1.3.4 胞质提取物处理对核移植效率的影响 |
| 1.3.5 表观遗传修饰药物处理对核移植效率的影响 |
| 1.3.6 抑制Xist 基因的表达对核移植效率的影响 |
| 1.4 展望 |
| 第二章 转基因家畜的研究和应用 |
| 2.1 转基因动物的生产方法 |
| 2.1.1 显微注射法 |
| 2.1.2 病毒载体法 |
| 2.1.3 精子载体法 |
| 2.1.4 胚胎干细胞介导法 |
| 2.1.5 体细胞核移植法 |
| 2.2 转基因家畜在农业生产上的应用 |
| 2.2.1 提高生产性能 |
| 2.2.2 提高产品质量 |
| 2.2.3 提高抗病力 |
| 2.3 转基因家畜在生物医学领域的应用 |
| 2.3.1 生产药用蛋白和生物制品 |
| 2.3.2 器官移植 |
| 2.3.3 人类疾病模型 |
| 2.4 展望 |
| 实验研究 |
| 第三章 山羊体细胞核移植体系的优化 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 试验动物 |
| 3.1.2 主要试剂和主要仪器设备 |
| 3.1.3 供体细胞处理 |
| 3.1.4 卵母细胞体外成熟（IVM） |
| 3.1.5 核移植（nuclear transfer，NT） |
| 3.1.6 胚胎培养和胚胎移植 |
| 3.1.7 实验设计 |
| 3.1.8 数据分析 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 激活时间对山羊克隆胚胎核重塑和早期发育的影响 |
| 3.2.2 CB 处理对山羊克隆胚胎发育潜能的影响 |
| 3.2.3 胚胎培养液对山羊克隆胚胎早期发育的影响 |
| 3.2.4 胚胎移植时间对核移植效率的影响 |
| 3.2.5 移植胚胎数量对核移植效率的影响 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 不同胎儿成纤维细胞系对转人溶菌酶基因克隆山羊生产效率的影响 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 试验动物 |
| 4.1.2 主要试剂和主要仪器 |
| 4.1.3 山羊胎儿的采集 |
| 4.1.4 胎儿成纤维细胞的培养 |
| 4.1.5 不同胎儿成纤维细胞系的增殖能力检测 |
| 4.1.6 不同胎儿成纤维细胞系的染色体稳定性检测 |
| 4.1.7 不同胎儿成纤维细胞系的细胞周期和凋亡检测 |
| 4.1.8 转基因载体的准备 |
| 4.1.9 胎儿成纤维细胞的转染和筛选 |
| 4.1.10 核移植程序 |
| 4.1.11 转基因山羊的鉴定 |
| 4.1.12 实验设计 |
| 4.1.13 数据分析 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 胎儿成纤维细胞的生长特性和形态 |
| 4.2.2 胎儿成纤维细胞的增殖能力和染色体稳定性 |
| 4.2.3 胎儿成纤维细胞处理后的细胞周期和细胞凋亡 |
| 4.2.4 不同胎儿成纤维细胞系的转染效率 |
| 4.2.5 不同转基因细胞系对核移植胚胎植入前发育的影响 |
| 4.2.6 不同转基因细胞株对核移植胚胎体内发育的影响 |
| 4.2.7 转基因羊PCR 和Southern 鉴定结果 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 转人β-防御素3 基因克隆山羊的生产 |
| 5.1 材料和方法 |
| 5.1.1 试验动物 |
| 5.1.2 主要试剂和仪器设备 |
| 5.1.3 载体 |
| 5.1.4 山羊胎儿成纤维细胞 |
| 5.1.5 转HBD3 基因山羊胎儿成纤维细胞的制备 |
| 5.1.6 转HBD3 基因单克隆细胞的PCR 鉴定 |
| 5.1.7 核移植 |
| 5.1.8 转基因羊的PCR 鉴定 |
| 5.1.9 转基因羊的southern 鉴定 |
| 5.1.10 反向PCR 鉴定整合位点侧翼序列 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 转HBD3 基因山羊胎儿成纤维细胞的筛选和鉴定 |
| 5.2.2 转HBD3 基因克隆羊的生产 |
| 5.2.3 转HBD3 基因克隆羊的鉴定 |
| 5.2.4 反向PCR 鉴定整合位点侧翼序列 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 第六章 转人防御素-3 基因克隆山羊乳腺上皮细胞诱导表达和继代克隆 |
| 6.1 材料和方法 |
| 6.1.1 主要试剂和主要仪器 |
| 6.1.2 实验动物 |
| 6.1.3 转基因羊乳腺上皮细胞的分离培养 |
| 6.1.4 乳腺上皮细胞的鉴定 |
| 6.1.5 转基因羊乳腺上皮细胞的诱导表达 |
| 6.1.6 利用Tricine SDS-PAGE 电泳和western blot 检测HBD-3 的表达 |
| 6.1.7 转基因羊乳腺上皮细胞的继代克隆 |
| 6.2 实验结果 |
| 6.2.1 转基因羊乳腺上皮细胞的分离培养 |
| 6.2.2 转基因羊乳腺上皮细胞的特异性染色 |
| 6.2.3 转基因羊乳腺上皮细胞的HBD3 诱导表达 |
| 6.2.4 转基因羊乳腺上皮细胞的继代克隆 |
| 6.3 讨论 |
| 6.4 小结 |
| 全文结论 |
| 主要创新点和下一步研究方向 |
| 参考文献 |
| 缩略词 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（4）山羊体细胞核移植研究进展（论文提纲范文）
| 1 山羊体细胞核移植技术流程 |
| 2 山羊体细胞核移植研究进展 |
| 3 山羊体细胞核移植技术研究展望 |
（5）转基因克隆法制作人溶酶体β-葡萄糖苷酶奶山羊乳腺生物反应器的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语中英文对照 |
| 引言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 文献综述 |
| 第一章 哺乳动物体细胞核移植研究进展 |
| 1 哺乳动物体细胞核移植技术的发展 |
| 2 哺乳动物体细胞核移植的基本技术环节 |
| 2.1 供体细胞的选择 |
| 2.2 核受体胞质的准备 |
| 2.3 供体细胞和受体细胞的重组 |
| 2.4 重构胚的激活 |
| 2.5 重构胚的培养 |
| 3 哺乳动物体细胞核移植有关机理研究进展 |
| 3.1 受体细胞和供体细胞的核质互作 |
| 3.2 体细胞供体核的表观重编程 |
| 4 体细胞核移植技术存在的问题与应用前景 |
| 4.1 体细胞细胞核移植技术存在的问题 |
| 4.2 应用前景 |
| 参考文献 |
| 第二章 转基因动物乳腺生物反应器生产重组药用蛋白的研究进展 |
| 1 转基因动物制药的诞生 |
| 1.1 细菌基因工程药物阶段 |
| 1.2 细胞基因工程药物阶段 |
| 1.3 转基因动物制药阶段 |
| 2 动物乳腺生物反应器的研究简史 |
| 3 乳腺生物反应器的分类 |
| 3.1 啮齿动物乳腺生物反应器 |
| 3.2 反刍动物乳腺生物反应器 |
| 4 乳腺生物反应器表达载体构建的研究 |
| 4.1 与乳腺组织特异性表达有关的调控元件 |
| 4.2 基于普通质粒的表达载体 |
| 4.3 基于人工染色体的表达载体 |
| 4.4 基于基因打靶的表达载体 |
| 5 乳腺生物反应器的制作技术及新方法进展 |
| 5.1 原核期胚胎的显微注射法 |
| 5.2 转座子介导法 |
| 5.3 逆转录病毒介导法 |
| 5.4 精子载体法 |
| 5.5 胚胎干细胞介导法 |
| 5.6 原始生殖细胞介导法 |
| 5.7 转基因克隆动物法 |
| 5.8 体细胞基因打靶制备乳腺生物反应器 |
| 5.9 诱导多能干细胞基因打靶制备乳腺生物反应器 |
| 6 乳腺生物反应器的鉴定 |
| 6.1 DNA水平的检测 |
| 6.2 RNA水平的检测 |
| 6.3 目的蛋白的检测 |
| 7 转基因乳腺生物反应器存在的问题 |
| 参考文献 |
| 第二部分 试验研究 |
| 第三章 人溶酶体β-葡萄糖苷酶基因的克隆及其在COS7细胞中的表达研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 人胎盘组织总RNA的完整性 |
| 2.2 GlcCerase cDNA的扩增 |
| 2.3 GlcCerase序列分析结果 |
| 2.4 pEGFP-GlcCerase重组质粒的构建与鉴定 |
| 2.5 荧光显微镜观察COS7细胞中GFP基因的表达 |
| 2.6 转染COS7细胞中GlcCerase基因的mRNA表达 |
| 2.7 转染COS7细胞中GlcCerase基因的蛋白表达 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 人GleCerase基因乳腺表达载体的构建及其在乳腺上皮细胞中的表达研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 乳腺特异性表达载体的鉴定 |
| 2.2 HC-11细胞的转染与鉴定 |
| 2.3 GlcCerase基因在转基因HC-11细胞中的诱导表达 |
| 3 讨论 |
| 3.1 乳腺特异表达载体的构建 |
| 3.2 乳腺特异表达载体的验证手段 |
| 3.3 乳腺上皮细胞合成乳蛋白的可能机制 |
| 参考文献 |
| 第五章 奶山羊胎儿成纤维细胞的分离培养及脂质体法转染研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 奶山羊胎儿成纤维细胞的一般形态观察 |
| 2.2 胎儿细胞性别鉴定 |
| 2.3 胎儿细胞生长曲线分析 |
| 2.4 胎儿细胞核型分析 |
| 2.5 胎儿细胞转染效率的优化 |
| 3 讨论 |
| 3.1 供体细胞的原代培养与生物学特性分析 |
| 3.2 脂质体转染体细胞效率的优化 |
| 参考文献 |
| 第六章 转人GlcCerase基因奶山羊胎儿成纤维细胞的建立 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 细胞抗性试验 |
| 2.2 外源基因转染山羊胎儿成纤维细胞 |
| 2.3 稳定转染细胞的PCR鉴定 |
| 2.4 转基因细胞的生长曲线 |
| 2.5 转基因细胞的核型分析 |
| 3 讨论 |
| 3.1 转基因阳性细胞克隆的分离 |
| 3.2 转基因阳性细胞的筛选 |
| 3.3 转基因供体细胞的染色体倍性 |
| 参考文献 |
| 第七章 转人GlcCerase基因奶山羊克隆胚的构建及胚胎移植 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 山羊卵母细胞的体外成熟培养 |
| 2.2 山羊转基因体细胞的核移植 |
| 2.3 转基因体细胞克隆胚的体外培养与发育 |
| 2.4 转基因体细胞克隆胚的PCR检测 |
| 2.5 山羊转基因克隆胚的胚胎移植 |
| 3 讨论 |
| 3.1 转染和筛选对转基因克隆胚胎发育的影响 |
| 3.2 技术操作过程对核移植效率的影响 |
| 3.3 重构胚胎培养体系 |
| 参考文献 |
| 第八章 外源基因转染对奶山羊供体细胞生物学特性的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 培养细胞的形态与生长曲线 |
| 2.2 稳定转染细胞的PCR鉴定 |
| 2.3 外源基因转染对细胞周期分布的影响 |
| 2.4 外源基因转染对细胞凋亡的影响 |
| 2.5 外源基因转染对细胞基因表达的影响 |
| 3 讨论 |
| 3.1 外源基因转染对奶羊体细胞周期分布和细胞凋亡的影响 |
| 3.2 外源基因转染对奶羊体细胞基因相对表达水平的影响 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 创新点 |
| 进一步研究的内容 |
| 附录 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（6）山羊体细胞核移植的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 细胞核移植的发展过程 |
| 1.1.1 早期细胞核移植发展回顾 |
| 1.1.2 哺乳动物细胞核移植的发展 |
| 1.1.3 山羊细胞核移植的发展历程 |
| 1.2 细胞核移植的相关机理研究 |
| 1.2.1 成熟促进因子（MPF） |
| 1.2.2 核质相互作用 |
| 1.2.3 组蛋白乙酰化 |
| 1.3 核移植的技术程序 |
| 1.3.1 受体细胞的准备 |
| 1.3.2 供体细胞的准备 |
| 1.3.3 核移植重构胚的构建方法 |
| 1.3.3.1 融合法 |
| 1.3.3.2 胞质内注射法 |
| 1.3.4 重构胚的激活 |
| 1.3.5 重构胚的培养 |
| 1.3.6 重构胚的移植 |
| 1.4 细胞核移植的前景 |
| 1.4.1 在畜牧以及物种保护的应用 |
| 1.4.2 医学上的应用 |
| 1.4.3 转基因克隆 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 绒山羊皮肤成纤维细胞的分离和培养 |
| 2.1.1 原代培养 |
| 2.1.2 传代培养与纯化 |
| 2.1.3 绒山羊成纤维细胞的冷冻保存 |
| 2.1.4 绒山羊成纤维细胞的解冻复苏 |
| 2.1.5 绒山羊皮肤成纤维细胞生长曲线 |
| 2.1.6 绒山羊成纤维细胞染色体的制备 |
| 2.2 山羊卵母细胞的采集 |
| 2.2.1 山羊卵巢的采集 |
| 2.2.2 卵丘-卵母细胞复合体(COCs)的采集方法 |
| 2.2.3 COCs 的成熟培养 |
| 2.2.4 卵母细胞体外成熟培养液 |
| 2.2.5 卵母细胞的成熟观察 |
| 2.3 山羊卵母细胞孤雌激活和发育培养 |
| 2.3.1 电激活 |
| 2.3.2 化学激活 |
| 2.3.2.1 离子霉素激活 |
| 2.3.2.2 乙醇激活 |
| 2.3.3 山羊孤雌胚的体外培养 |
| 2.3.3.1 卵丘细胞单层的制备 |
| 2.3.3.2 体外培养 |
| 2.4 山羊细胞核移植过程 |
| 2.4.1 核供体的准备 |
| 2.4.2 核移植 |
| 2.4.3 融合 |
| 2.4.4 重构胚的激活及体外培养 |
| 2.4.5 胚胎移植 |
| 2.4.6 实验数据统计分析 |
| 2.5 结果与分析 |
| 2.5.1 绒山羊皮肤成纤维细胞原代和传代培养 |
| 2.5.2 绒山羊皮肤成纤维细胞的生长曲线 |
| 2.5.3 山羊皮肤成纤维细胞染色体数目 |
| 2.5.4 采集方法对卵母细胞成熟的影响 |
| 2.5.5 培养液中所含血清对卵母细胞成熟的影响 |
| 2.5.6 不同激活电压对山羊卵母细胞孤雌激活的影响 |
| 2.5.7 不同激活方法对山羊卵母细胞孤雌激活的影响 |
| 2.5.8 6-DAMP 中不同激活时间对孤雌胚发育的影响 |
| 2.5.9 不同培养方法对孤雌胚的发育影响 |
| 2.5.10 不同融合电压对核移植效率的影响 |
| 2.5.11 胚胎移植结果 |
| 2.6 讨论 |
| 2.6.1 绒山羊皮肤成纤维细胞系的建立 |
| 2.6.2 影响山羊卵母细胞成熟的因素 |
| 2.6.3 山羊卵母细胞的孤雌激活 |
| 2.6.4 山羊卵母细胞孤雌胚胎体外发育的影响 |
| 2.6.5 山羊重构胚的融合 |
| 2.6.6 胚胎移植效率 |
| 3 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 作者简介 |
（7）体细胞核移植法获得转人乳铁蛋白基因克隆山羊妊娠的研究（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试剂 |
| 1.2 转染供体细胞的准备 |
| 1.3 卵母细胞的采集 |
| 1.4 卵母细胞的去核 |
| 1.5 核移植 |
| 1.6 克隆胚的激活及体外培养 |
| 1.7 克隆胚外源基因的检测 |
| 1.8 转基因克隆胚的胚胎移植和妊娠鉴定 |
| 1.9 试验数据处理 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 转染及筛选操作对转基因克隆胚体外发育的影响 |
| 2.2 克隆胚外源基因的检测 |
| 2.3 转基因克隆胚的胚胎移植 |
| 3 讨论 |
（8）转基因体细胞克隆水牛与广西水牛的遗传特性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 转基因克隆动物与水牛遗传特性研究进展 |
| 第一节 转基因克隆动物研究进展 |
| 一、克隆技术研究进展 |
| 二、转基因动物研究进展 |
| 三、转基因克隆动物的应用 |
| 四、转基因克隆研究亟需解决的问题 |
| 第二节 水牛遗传多样性研究进展 |
| 一、水牛起源与家养化 |
| 二、亚洲水牛的分布与分类 |
| 三、微卫星在物种遗传多样性研究中的应用 |
| 四、线粒体在物种遗传多样性研究中的应用 |
| 五、家养水牛的遗传多态性研究进展 |
| 第二章 水牛胎儿成纤维细胞的分离培养与条件优化 |
| 第一节 水牛胎儿成纤维细胞的分离培养 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 讨论 |
| 第二节 低密度水牛胎儿成纤维细胞的增殖培养 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 讨论 |
| 第三章 水牛胎儿成纤维细胞转染外源DNA的研究 |
| 第一节 影响水牛胎儿成纤维细胞转染效率的因素 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 讨论 |
| 第二节 转染外源DNA的水牛胎儿成纤维细胞的细胞学检测 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 讨论 |
| 第四章 人血小板生成素基因真核表达载体构建及其基因转染研究 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果与分析 |
| 4 讨论 |
| 第五章 广西水牛的遗传多样性分析 |
| 第一节 基于微卫星的广西水牛遗传多样性分析 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 讨论 |
| 第二节 基于线粒体控制区变异分析广西水牛的遗传多样性 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读博士学位期间发表的论文 |
| 致谢 |
（9）牛体细胞核移植的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 文献综述 |
| 第一章 哺乳动物核移植研究进展 |
| 1.1 哺乳动物胚胎细胞核移植研究进展 |
| 1.2 哺乳动物胚胎干细胞细胞核移植研究进展 |
| 1.3 哺乳动物体细胞核移植研究进展 |
| 1.3.1 牛体细胞核移植研究进展 |
| 1.3.2 其他动物体细胞核移植研究进展 |
| 1.4 哺乳动物异种体细胞核移植研究进展 |
| 1.5 哺乳动物体细胞核移植相关领域研究进展 |
| 1.5.1 利用体细胞核移植技术生产转基因动物的研究进展 |
| 1.5.2 治疗性克隆的研究进展 |
| 1.6 我国核移植研究进展 |
| 第二章 哺乳动物体细胞核移植理论基础 |
| 2.1 受体胞质 |
| 2.2 供体细胞 |
| 2.2.1 供体细胞类型对发育的影响 |
| 2.2.2 供体细胞周期对发育的影响 |
| 2.2.3 核供体细胞的传代次数和来源 |
| 2.3 核供体细胞与受体细胞之间的相互作用 |
| 2.4 核移植相关问题的研究进展 |
| 2.4.1 重构胚基因组的重编程 |
| 2.4.2 DNA 甲基化 |
| 2.4.3 组蛋白乙酰化 |
| 2.4.3 X 染色体失活 |
| 2.4.4 端粒 |
| 2.4.5 印记基因的表达 |
| 2.4.6 线粒体DNA 的命运 |
| 第三章 哺乳动物体细胞核移植研究存在的问题及应用前景 |
| 3.1 核移植研究中存在的问题 |
| 3.2 哺乳动物核移植的应用前景 |
| 3.2.1 体细胞核移植研究在基础科学研究中的作用 |
| 3.2.2 体细胞核移植研究在医学领域的作用 |
| 3.2.3 体细胞核移植研究与动物保护 |
| 3.2.4 体细胞核移植研究在畜牧生产的作用 |
| 试验研究 |
| 第四章 牛成纤维细胞和颗粒细胞的分离和培养 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.1.1 仪器和试剂 |
| 4.1.2 试验材料 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 牛耳皮肤成纤维细胞（BEF）的准备 |
| 4.2.2 颗粒细胞的分离与培养 |
| 4.2.3 牛耳皮肤成纤维细胞核型分析 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 牛耳皮肤成纤维细胞的分离和培养 |
| 4.3.2 牛颗粒细胞的分离和培养 |
| 4.3.3 牛耳皮肤成纤维细胞核型分析 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 BEF 的分离与培养,核型分析 |
| 4.4.2 供体细胞类型对克隆效率的影响 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 牛卵母细胞体外成熟的研究 |
| 5.1 材料和方法 |
| 5.1.1 试验材料 |
| 5.1.2 方法 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 血清及血清替代物对牛卵母细胞体外成熟和激活胚胎发育能力的影响 |
| 5.2.2 尿嘧啶对牛卵母细胞体外成熟和激活胚胎发育能力的影响 |
| 5.2.3 ATP 对牛卵母细胞体外成熟和激活胚胎发育能力的影响 |
| 5.3 讨论 |
| 5.3.1 血清及血清替代物 |
| 5.3.2 尿嘧啶 |
| 5.3.3 ATP |
| 5.4 小结 |
| 第六章 牛体细胞核移植的研究 |
| 6.1 材料和方法 |
| 6.1.1 仪器和试剂 |
| 6.1.2 方法 |
| 6.2 结果 |
| 6.2.1 不同融合参数的融合效率 |
| 6.2.2 不同融合电压对融合效率的影响 |
| 6.2.3 不同融合时间对融合效率的影响 |
| 6.2.4 不同激活方法对牛重构胚发育的影响 |
| 6.2.5 不同激活时间对牛重构胚发育的影响 |
| 6.2.6 不同培养液对牛体细胞核移植胚胎体外发育的影响 |
| 6.2.7 与牛颗粒细胞共培养对牛体细胞核移植胚胎体外发育的影响 |
| 6.2.8 不同供体细胞对牛体细胞核移植的影响 |
| 6.2.9 不同代数供体细胞对牛体细胞核移植的影响（BEF422） |
| 6.2.10 不同品种受体对牛体细胞核移植妊娠率的影响 |
| 6.3 讨论 |
| 6.3.1 关于电融合 |
| 6.3.2 关于重构胚激活 |
| 6.3.3 关于重构胚培养 |
| 6.3.4 关于供核细胞 |
| 6.3.5 不同品种受体对牛核移植妊娠率的影响 |
| 6.4 小结 |
| 结论 |
| 本研究新见解 |
| 进一步研究的课题 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（10）转基因山羊乳腺上皮细胞系建立与转基因克隆胚发育（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 文献综述 |
| 第一章 动物乳腺细胞培养研究进展 |
| 1.1 动物细胞培养研究进展 |
| 1.1.1 动物细胞培养发展简史 |
| 1.1.2 细胞系的生长特点 |
| 1.1.3 细胞系(株)的建立与鉴定 |
| 1.2 乳腺细胞培养研究进展 |
| 1.2.1 乳腺细胞培养方法研究进展 |
| 1.2.2 乳腺上皮细胞的类型及相互关系 |
| 1.2.3 建立乳腺细胞系的研究 |
| 1.2.4 牛乳腺上皮细胞系研究进展 |
| 1.2.5 山羊乳腺上皮细胞培养研究进展 |
| 第二章 转基因动物乳腺生物反应器研究进展 |
| 2.1 转基因动物的研究 |
| 2.1.1 啮齿动物转基因生物反应器模型 |
| 2.1.2 反刍动物转基因生物反应器 |
| 2.1.3 转基因动物制药的优点 |
| 2.2 乳腺系统基因表达调控的分子机制 |
| 2.3 转基因动物乳腺生物反应器的原理 |
| 2.4 转基因动物乳腺生物反应器的建立 |
| 2.4.1 构建表达载体 |
| 2.4.2 构建转基因动物 |
| 2.4.3 影响外源基因表达效率的因素 |
| 2.4.4 提高外源基因表达效率的策略 |
| 2.5 基因转移技术 |
| 2.5.1 显微注射法 |
| 2.5.2 配子介导法 |
| 2.5.3 转座子法 |
| 2.5.4 逆转录病毒浸染技术 |
| 2.5.5 胚胎干细胞转导法 |
| 2.5.6 PGCs 技术 |
| 2.5.7 核移植介导法 |
| 2.5.8 其它新技术的思考 |
| 2.6 体细胞基因打靶(同源重组技术)制备动物乳腺生物反应器 |
| 2.6.1 体细胞基因打靶的技术优势 |
| 2.6.2 体细胞基因打靶的策略 |
| 2.6.3 提高体细胞基因打靶的效率 |
| 2.7 转基因动物乳腺生物反应器的鉴定 |
| 2.7.1 DNA 水平的检测 |
| 2.7.2 RNA 水平的检测 |
| 2.7.3 目的蛋白的检测 |
| 2.7.4 目的蛋白生物活性的检测 |
| 2.8 转基因动物乳腺生物反应器的产业化动态 |
| 2.9 转基因生物反应器存在的问题、发展前景及我国研究现状 |
| 2.10 人乳铁蛋白基因表达载体构建及细胞表达的研究 |
| 第三章 哺乳动物细胞转染 DNA |
| 3.1 磷酸钙和 DEAE-葡聚糖介导的转染 |
| 3.2 电穿孔和电融合 |
| 3.3 利用阳离子型脂质体将 DNA 导入哺乳动物细胞 |
| 实验研究 |
| 前言 |
| 第四章 山羊乳腺上皮细胞体外培养及形态研究 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 乳腺上皮细胞的生长特性 |
| 4.2.2 乳腺上皮细胞的类型 |
| 4.2.3 山羊乳腺上皮细胞的超微结构 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 乳腺上皮细胞的生长特性 |
| 4.3.2 乳腺上皮细胞的类型 |
| 4.3.3 山羊乳腺上皮细胞的超微结构 |
| 4.4 结论 |
| 图版 |
| 第五章 山羊乳腺上皮细胞的鉴定 |
| 5.1 材料 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 山羊乳腺上皮细胞染色体分析 |
| 5.2.2 山羊乳腺上皮细胞表达酪蛋白的检测 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 山羊乳腺上皮细胞染色体分析结果 |
| 5.3.2 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 结论 |
| 第六章 山羊β-乳球蛋白基因5′调控成分克隆及序列分析 |
| 6.1 材料和方法 |
| 6.1.1 材料 |
| 6.1.2 方法 |
| 6.1.2.1 引物设计 |
| 6.1.2.2 山羊基因组 DNA 的提取 |
| 6.1.2.3 山羊 BLG(β-lactoglobulin)基因5′调控区PCR 扩增 |
| 6.1.2.4 琼脂糖电泳 |
| 6.1.2.5 目的片段的克隆、鉴定和序列测定 |
| 6.2 结果与分析 |
| 6.2.1 山羊基因组 DNA 的完整性 |
| 6.2.2 山羊 BLG 基因5′调控区的PCR 扩增 |
| 6.2.3 重组质粒酶切鉴定结果 |
| 6.2.4 序列分析结果 |
| 6.3 讨论 |
| 第七章 人乳铁蛋白基因乳腺特异性表达载体构建 |
| 7.1 材料和方法 |
| 7.1.1 材料 |
| 7.1.1.1 质粒、菌种和细胞 |
| 7.1.1.2 主要试剂和仪器 |
| 7.1.2 方法 |
| 7.1.2.1 人乳铁蛋白cDNA 的改造 |
| 7.1.2.2 人乳铁蛋白基因乳腺特异性表达载体的构建 |
| 7.2 结果 |
| 7.2.1 EGFP 和IRES 的PCR扩增后电泳鉴定 |
| 7.2.2 IRES 和 EGFP 的亚克隆和酶切鉴定结果 |
| 7.2.3 乳腺特异性表达载体构建结果 |
| 7.3 讨论 |
| 第八章 人乳铁蛋白基因表达载体导入山羊乳腺上皮细胞的研究 |
| 8.1 材料 |
| 8.1.1 细胞 |
| 8.1.2 质粒 |
| 8.1.3 试剂 |
| 8.2 方法 |
| 8.2.1 G418 对山羊乳腺上皮细胞最小致死量测定 |
| 8.2.2 电穿孔转化法将人乳铁蛋白基因表达载体导入山羊乳腺上皮细胞 |
| 8.2.3 脂质体转染法将人乳铁蛋白基因表达载体导入山羊乳腺上皮细胞 |
| 8.2.4 转染细胞的筛选 |
| 8.2.5 转染细胞的检测 |
| 8.2.5.1 荧光显微镜观察 |
| 8.2.5.2 PCR 检测 |
| 8.2.6 阳性细胞的体外传代培养 |
| 8.3 结果 |
| 8.3.1 G418 对山羊乳腺上皮细胞最小致死量的测定结果 |
| 8.3.2 G418 抗性山羊乳腺上皮细胞的阳性克隆筛选 |
| 8.3.3 转染细胞的检测结果 |
| 8.3.3.1 荧光显微镜观察结果 |
| 8.3.3.2 PCR 检测结果 |
| 8.3.4 阳性细胞的体外传代培养 |
| 8.4 讨论 |
| 8.5 结论 |
| 第九章 转人乳铁蛋白基因山羊乳腺上皮细胞诱导产物的检测 |
| 9.1 材料和方法 |
| 9.1.1 材料 |
| 9.1.2 方法 |
| 9.1.2.1 细胞诱导表达及样品处理 |
| 9.1.2.2 诱导产物的检测 |
| 9.2 结果 |
| 9.2.1 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果 |
| 9.2.2 Western blot 结果 |
| 9.3 讨论 |
| 9.4 结论 |
| 第十章 转人乳铁蛋白基因山羊克隆胚的发育 |
| 10.1 材料和方法 |
| 10.1.1 试剂和仪器 |
| 10.1.1.1 基础培养液及主要试剂 |
| 10.1.1.2 仪器设备 |
| 10.1.2 卵母细胞的体外成熟和去核 |
| 10.1.2.1 卵丘卵母细胞复合体(COCs)的回收 |
| 10.1.2.2 COCs的体外成熟 |
| 10.1.2.3 成熟卵母细胞的去核 |
| 10.1.3 供体细胞的准备 |
| 10.1.4 核移植、电融合及克隆胚的激活 |
| 10.1.5 克隆胚的体外培养 |
| 10.1.6 胚胎细胞计数 |
| 10.1.7 克隆胚外源基因的检测 |
| 10.1.7.1 荧光显微镜观察 |
| 10.1.7.2 PCR检测 |
| 10.1.8 数据分析 |
| 10.2 结果 |
| 10.2.1 不同构建方法对克隆胚的构建效率 |
| 10.2.2 转基因细胞的冻-融对克隆胚发育的影响 |
| 10.2.3 克隆胚在SOFaa培养液中的发育 |
| 10.2.4 克隆胚在CR1aa培养液中的发育 |
| 10.2.5 克隆胚在mCR1aa培养液中的发育 |
| 10.2.6 克隆胚在不同培养液中的发育 |
| 10.2.7 转基因细胞与正常细胞克隆胚发育的比较 |
| 10.2.8 转基因细胞的传代次数对构建克隆胚的影响 |
| 10.2.9 EGFP 在克隆胚中的表达 |
| 10.2.10 克隆胚外源基因的PCR 检测结果 |
| 10.3 讨论 |
| 10.4 结论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
四、Cloned goats (Gapra hircus) from foetal fibroblast cell lines（论文参考文献）
- [1]Myostatin基因敲低克隆绵羊的研究[D]. 李昊. 东北林业大学, 2019(01)
- [2]波尔山羊体细胞核移植的研究[D]. 马群. 福建农林大学, 2012(12)
- [3]转人溶菌酶和人β-防御素3基因克隆山羊的生产[D]. 刘军. 西北农林科技大学, 2011(05)
- [4]山羊体细胞核移植研究进展[J]. 胡日查,王玉宝,吴科榜. 畜牧与饲料科学, 2010(09)
- [5]转基因克隆法制作人溶酶体β-葡萄糖苷酶奶山羊乳腺生物反应器的研究[D]. 张艳丽. 南京农业大学, 2010(06)
- [6]山羊体细胞核移植的研究[D]. 巴特尔. 内蒙古农业大学, 2010(12)
- [7]体细胞核移植法获得转人乳铁蛋白基因克隆山羊妊娠的研究[J]. 刘凤军,张玉玲,杨自军,陈兴启,孙达权,王国华,张涌. 安徽农业科学, 2008(29)
- [8]转基因体细胞克隆水牛与广西水牛的遗传特性研究[D]. 崔奎青. 广西大学, 2007(05)
- [9]牛体细胞核移植的研究[D]. 黄伟伟. 西北农林科技大学, 2007(06)
- [10]转基因山羊乳腺上皮细胞系建立与转基因克隆胚发育[D]. 郑月茂. 西北农林科技大学, 2005(02)