1.济南市食品药品检验检测中心 250101；2.解放军第八十八医院 271000
摘要：目的：对三株牌歧特生冲剂进行小鼠睾丸染色体畸变试验，以测定其是否具有遗传毒性。方法：参照《保健食品检验与评价技术规范》（2003年版）中的试验方法。结果：试验期间，所有组别动物症状表现正常，未见明显由于给予样品引起的异常症状，未见动物异常死亡。各剂量组体重与Veh组比较均无显著差异（P>0.05）。CP组染色体畸变细胞率与Veh组比较有明显差异（P＜0.01），其余各组与Veh组比较未见明显差异（P>0.05）。结论：本试验条件下，受试样品剂量组的睾丸染色体结构畸变细胞率与阴性对照组（Veh）比较无显著性差异（P>0.05），无剂量反应关系，表明三株牌歧特生冲剂对小鼠睾丸染色体结构未产生明显影响，试验结果为阴性。
关键词：三株牌歧特生冲剂；小鼠睾丸染色体畸变试验
睾丸染色体畸变是指睾丸细胞染色体数目和结构异常，包括裂隙、短篇、移位等[1]。三株牌歧特生冲剂，由三株福尔制药有限公司生产，其主要作用在于调节肠道菌群平衡，从而改善肠道功能的作用。三株牌歧特生冲剂，6 g/袋，白色粉末状固体，本品易溶于水，由三株福尔制药有限公司生产，批号为160403，常温保存，功效成分为水苏糖，含量每袋不少于3 g。本品人体推荐食用方法及食用量为口服，每日1～2次，每次1袋。溶媒为灭菌蒸馏水。
1实验动物及饲养环境
小鼠，品系：KM，雄性，体重25~30 g，25只，来源：北京维通利华实验动物技术有限公司，生产许可证号：SCXK（京）2012 0001。实验动物质量合格证号：11400700166948。经检疫观察4 d后使用。
饲养环境：屏障系统。5只/笼（同性别、同剂量组），喂食SPF鼠料，自由饮水。温度24.7～26.0 ℃，相对湿度50～60 %，人工光照，明暗12 h/天。
SPF大小鼠生长维持饲料，来源：北京华阜康生物科技股份有限公司，动物饲料生产许可证号：SCXK（京）2014 0008。
实验动物饮用水为中心提供纯化水，高压蒸汽灭菌。
饲养笼种类：PP聚丙烯鼠盒，底铺高压蒸汽灭菌的玉米芯垫料。
2主要仪器和试剂
PL2001-L型电子天平，PL-303型电子精密天平，BX51型生物显微镜（OLYMPUS）环磷酰胺，来源：SIGMA公司；氯化钾，来源：国药集团化学试剂有限公司；甲醇，来源：国药集团化学试剂有限公司；冰乙酸，来源：国药集团化学试剂有限公司；秋水仙素，来源：成都华夏化学试剂有限公司；Giemsa染液，来源：Solarbio公司。
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3剂量设计
试验设样品低（L）、中（M）、高（H）三个剂量组、阴性对照组（Veh）和阳性对照组（CP），每组雄性小鼠5只。本品急性毒性试验未求出LD50，按照高剂量组选择的次序，首选10 g/kg BW，按等比设中、低剂量组，剂量分别为5 g/kg BW、2.5 g/kg BW。
称取样品5 g，加蒸馏水至10 ml，制成0.5 g/ml的高剂量样品溶液，中、低剂量样品溶液由高剂量样品溶液稀释而成。阳性对照组给予环磷酰胺（以氯化钠注射液配制成4 mg/ml的溶液），剂量为40 mg/kg BW。阴性对照组给予灭菌蒸馏水。
4试验方法
4.1染毒方案
将25只动物按体重采用随机分组的方法分为5组，每组5只。受试组小鼠均经口灌胃给予样品，灌胃体积均为20 ml/kg，阳性对照组腹腔注射给予环磷酰胺，注射体积为10 ml/kg，连续给予5 d，于灌胃首次、之后每7 d称一次体重。所有动物于首次给予受试物14 d后颈椎脱臼处死动物。处死动物前6 h腹腔注射0.04 %秋水仙素溶液，剂量为4 mg/kg BW，注射体积为10 ml/kg。
4.2标本制作
4.2.1取材
解剖取出两侧睾丸，去净脂肪，置于盛有生理盐水的平皿中。
4.2.2 低渗
用眼科镊挑破睾丸被膜，分离出曲细精管，放入盛有低渗液的平皿中，室温下静置，低渗25 min。
4.2.3 固定
用滴管仔细吸尽低渗液，在平皿中加新配的固定液（甲醇：冰乙酸=3：1）10 ml，固定15 min，倒掉固定液，再加入新固定液20 min以上。
4.2.4 离心、滴片、染色
吸尽固定液，加60 %冰乙酸1ml，待大部分曲细精管软化后，用吸管吸出上清液移入放有倍量固定液的离心管，打匀，吸出细胞残物，以1000 r/min离心10 min。弃去上清液，留下约0.5 ml，充分吹打匀后滴于冰水玻片上。每个样本制片2张。自然干燥后，用Giemsa应用染液染色20 min，自来水冲洗，干燥后待观察。
4.3阅片
在低倍镜下按顺序寻找背景清晰、分散良好、染色体收缩适中的中期分裂相，然后在油镜下进行分析，每只动物至少观察100个中期分裂相，每组至少观察500个细胞。观察染色体是否有异常。常见的染色体的异常类型可分为染色体结构畸变（断裂、微小体、相互易位）、X-Y和常染色体的单价体。
5试验数据统计
对每个动物记录含染色体结构畸变的细胞数，并列表给出各组不同类型的染色体结构畸变数目和频率。将染色体结构畸变细胞率（%）、X-Y和常染色体的单价体分别计算，用X2检验进行统计学分析。
以?x ? s表示动物体重，SPSS18.0软件进行统计学分析。
6 结果判定
当各剂量组与阴性对照组相比，畸变细胞率有显著意义的增加，并有剂量-反应关系时；或仅一个剂量组有显著意义的增加，并具有可重复性时，可判为试验结果阳性。
7结果
试验期间，所有组别动物症状表现正常，未见明显由于给予样品引起的异常症状，未见动物异常死亡。
各剂量组体重与Veh组比较均无显著差异（P>0.05）。
CP组染色体畸变细胞率与Veh组比较有明显差异（P＜0.01），其余各组与Veh组比较未见明显差异（P>0.05）。
8 讨论
本试验条件下，受试样品剂量组的睾丸染色体结构畸变细胞率与阴性对照组（Veh）比较无显著性差异（P>0.05），无剂量反应关系，表明三株牌歧特生冲剂对小鼠睾丸染色体结构未产生明显影响，试验结果为阴性。
参考文献：
[1]中华人民共和国卫生部.《保健食品检验与评价技术规范》（2003年版）[Z].2003.02
论文作者:郑鹏1,吴传亮2,任晓伟1
论文发表刊物:《健康世界》2017年20期
论文发表时间:2017/11/30
标签：染色体论文; 剂量论文; 畸变论文; 睾丸论文; 小鼠论文; 样品论文; 冲剂论文; 《健康世界》2017年20期论文;