（青岛大学附属医院耳鼻咽喉头颈外科 山东 青岛 266071）
【摘要】目的：探讨第二代杂交捕获法（HC2）和多重荧光聚合酶链反应（PCR）在口咽癌高危型人乳头状瘤病毒（HPV）中的检测性能。方法：采用HC2和多重荧光PCR检测31例口咽癌患者中高危型HPV感染情况，通过统计学方法比较分析两种检测方法在检测结果中的一致性。结果：HC2和多重荧光PCR两种方法检测高危型HPV一致性较好，总符合率为90.32%，总一致性指数（Kappa指数）为0.7364。结论：在口咽癌患者中应用HC2技术进行高危型HPV检测有可行性。
【关键词】杂交捕获；多重荧光聚合酶链反应；口咽癌；人乳头状瘤病毒；高危型
【中图分类号】R730.4 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2017）15-0180-02
omparison on the Detection of High-Risk HPV with the Technique of Hybrid Capture 2 and Multiplex Fluorescent PCR for Oropharyngeal Cancer
Lei Lu, Wei Li.
Department of Otorhinolaryngology and Head and Neck Surgery, Affiliated Hospital of Qingdao University, Qingdao City, Shandong Province, 266071, China
【Abstract】Objective To analyze the detective performance of the technique of hybrid capture 2 (HC2) and multiplex fluorescent polymerase chain reaction (PCR) on the high-risk human papilloma virus (HPV) for oropharyngeal cancer. Methods The infection of high-risk HPV was detected with HC2 and multiplex fluorescent PCR for 31 patients with oropharyngeal cancer, and then statistical methods were employed to compare and analyze the conformability of the two detective techniques in the detection results. Results HC2 and multiplex fluorescent PCR showed better consistency on the detection of high-risk HPV, the total coincidence rate being 90.32%, and the total consistency index (Kappa index) being 0.7364. Conclusions It is feasible that high-risk HPV is detected with HC2 technique for patients with oropharyngeal cancer.
【Key words】 Hybrid capture; Fluorescent polymerase chain reaction; Oropharyngeal cancer; Human papilloma virus; High-risk
头颈部恶性肿瘤（Head and neck cancer）最常见为头颈部鳞状细胞癌，其发病率在人体恶性肿瘤中排第六位。近年来我国头颈部肿瘤的发病率为15.22／10万。占全身恶性肿瘤的4.45%[1]。其病变主要起源为上呼吸道和上消化道黏膜，并且有着一些共同的风险因素。目前公认最主要的头颈部鳞癌的风险因素是吸烟和饮酒[2, 3]。但头颈部鳞癌患者中仍有20%～25%不存在吸烟和饮酒的危险因素，越来越多的证据表明，头颈部鳞癌与高危型（16／18亚型）人乳头瘤病毒（human Papilloma virus，HPV）感染密切相关。自从1985年首次报道在口咽癌(Oropharyngeal cancer，OPC)中检出HPV以来[4]，口咽、下咽及喉等多个部位的头颈部肿瘤中均已检测出HPV的存在。在HPV相关的头颈部恶性肿瘤中，HPV与口咽鳞癌的发生、发展最为密切，尤其是高危型HPV16[5.6]有较高的检出率，且与口咽癌的预后相关。Junor等[7]研究发现口咽癌患者中存在HPV阳性的对化疗的疗效更敏感。目前许多研究指出HPV阳性的口咽癌相比同一阶段的HPV阴性的口咽癌预后要好，并且患者的存活率要高，放化疗及手术治疗的效果也更好[8]。HPV相关的口咽癌以独特的病因和临床特征引起了越来越多的关注。
本文应用第二代杂交捕获法（HC2）和多重荧光聚合酶链反应（PCR）两种检测技术检测31例口咽癌患者的HPV感染情况，探讨两种检测方法的优缺点并验证HC2技术对高危型HPV检测的可行性。
1.材料和方法
1.1 标本来源和采样
1.1.1标本来源 2015年1月至2016年9月间，在我院耳鼻咽喉头颈外科及口腔颌面外科就诊的经病理证实的口咽鳞状细胞癌31例。
1.1.2标本采集 31例患者均签署患者知情同意书后取肿瘤表面刮片标本。0.9%的生理盐水漱口，充分暴露口咽肿瘤表面粘膜，用Digene公司的HC2取样刷于肿瘤表面，轻轻搓动使其顺时针旋转5圈，立即放入取样管的STM细胞保存液中，4℃保存及时送检。从体积为1ml的细胞保存液中取出50uL，用于多重荧光聚合酶链反应(PCR)检测，剩余标本液用于第二代杂交捕获法（HC2）的检测。
1.2 试剂和仪器
1.2.1 HC2检测所用为美国Digene公司生产的高危型HPV DNA试剂盒以及DML2000荧光光度仪。
1.2.2多重荧光PCR检测所用为上海复星公司生产的高危型HPV试剂盒以及美国MJ公司生产的OPTICON实时荧光PCR检测仪。
1.3 检测方法
1.3.1 HC2 利用对抗体捕获信号的放大和化学发光信号的检测，可一次性同时检测13种高危型HPV（16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68型）[9]。步骤如下：(1)利用碱性溶液将DNA双链解链为单链DNA；(2)加入与DNA单链互补的RNA探针，使之结合为RNA-DNA杂交复合物；(3)利用微孔壁上固定的第1抗体（特异性抗体）将RNA-DNA杂交复合物固定于微孔壁上；(4)碱性磷酸酶标记的的多个第2抗体与RNA-DNA杂交复合物结合从而使信号放大；(5)碱性磷酸酶能使酶底物发出荧光，利用读数器判读光的有无及强弱可得出碱性磷酸酶的含量从而确定RNA-DNA含量；(6)结果判定，HPVDNA≥1.0pg/ml_即定义为HPV感染阳性。
1.3.2多重荧光PCR检测共检测10种HPV基因型(16、18、31、33、35、45、52、53、56、58型)。操作步骤按试剂盒说明书进行，步骤如下：(1)标本DNA提取：取待测标本50uL细胞保存液加入50uL核酸提取液A，振荡混匀15s，13000r/min离心10min后弃上清，加入核酸提取液B 100uL振荡混匀15s，于100℃水浴10min，10000r/min离心3min后取上清5uL用于PCR扩增；(2)PCR反应条件：扩增程序为50℃1min，经94℃变性2min进入循环；93℃20s；50℃90s，共40个循环，荧光PCR检测时，在50℃时测定荧光变化。
1.4 统计学分析
应用SPSS17.0统计软件进行分析。对2种方法检测结果的符合情况使用一致性检验，计算一致性指数（Kappa指数），如Kappa指数在0.4～0.75之间说明一致性好，如Kappa指数≥0.75说明一致性极好。
2.结果
31例标本同时采用HC2和多重荧光PCR方法进行检测。其中HC2检测出高危型HPV阳性7例，阴性24例，阳性检出率为22.58%，其中有1例阳性患者经PCR检测为阴性。多重荧光PCR检测出高危型HPV阳性8例，阴性23例，阳性检出率为25.81%，其中有2例阳性患者经HC2检测为阴性。31例标本中有6例经2种方法检测为阳性符合，占总检测数的19.35%，22例为阴性符合，占总检测数的70.97%，总符合率为90.32%，Kappa指数为0.7364。见表1
3.讨论
目前已发现有人乳头瘤病毒(HPV)80多个基因型，不同型别可引起的不同的细胞病理变化，其中高危型HPV是诱发宫颈癌的重要病原学因素。有大量的证据表明与宫颈癌一样，HPV与部分口咽癌密切相关。大量的流行病学、分子病理学证明及体外实验证据支持HPV在口咽癌中起到病因角色的假设。越来越多的研究证实，HPV阳性的口咽癌患者比HPV阴性的患者，对放化疗的反应更有效，其生存率也更高[11-13]。对口咽癌患者准确地进行HPV的检测，有助于指导临床诊治策略，符合肿瘤治疗的“规范化”、“个体化”原则，将更好地改善口咽癌患者的治疗效果。本研究中，多重荧光PCR和HC2均可检测高危型HPV(16、18、31、33、35、45、52、56、58型)。HC2还能检测4个较少见的高危型HPV(39、51、59和68)。本实验结果显示，HC2阳性检出率为22.58%，PCR阳性检出率为25.81%，Kappa指数为0.7364，表明PCR和HC2二种检测方法具有较好的符合一致性。在本研究中，多重荧光PCR检测HPV阳性的8例患者中，有2例行HC2检测HPV为阴性病例，这可能与多重荧光PCR比HC2的检测灵敏度高或PCR实验过程易被污染有一定关系。多重荧光PCR能够检测到HPV病毒含量为1×103拷贝/mL的标本，而HC2的检测下限阈值是4.7×103拷贝/mL，对于HPV病毒含量较低的标本，HC2可能检测不到。PCR反应容易在实验过程中被污染而出现假阳性，因此PCR反应要在严格控制的分子生物学实验室中进行。
文献中报告虽然HPV（16，18和35型）占主导地位，但仍会有一些其他型别的HPV感染病例。本实验中行HC2检测的7例阳性标本中，只有6例多重荧光PCR检测呈阳性反应，而在PCR检测的22例阴性的患者标本中，行HC2检测时，有1例标本呈阳性HPV反应。这表明引发口咽癌的人乳头瘤病毒基因类型的多样性。近年来有文献报道，许多临床上少见HPV类型也属于高致病型HPV[14]，但HC2、PCR等单一检测手段不能完全检测到所有致病性的HPV类型，临床上可以联合多种手段进行HPV检测。多重荧光PCR检测无法识别4个较少见的高危型HPV(39、51、59、68)，相比较而言HC2更容易发现多型别的高危型HPV感染。HC2是目前由美国食品和药物监督管理局(FDA)惟一认证的HPV检测技术，HC2操作简便，反应不需要特殊的实验室，不易被污染，检测成本较低，缺点是不能确定HPV型别。
本研究的检测结果中，HC2可同时检测到多种高危型HPV亚型。与实时荧光PCR比较也具有较好的一致性，且操作简便、成本较低。本研究证实对于口咽癌患者使用第二代杂交捕获试验技术分析HPV感染结果有可行性，在严格质量管理的情况下可作为临床上口咽癌HPV DNA筛查的有效手段。
【参考文献】
[1]张洁莉，孙昭，霍真，等．头颈部鳞癌人乳头状瘤病毒16／18感染状态与Ki-67、p53表达的关系[J].中国医学科学院学报，2010,32 4)：429-432．
[2] Hunter,K.D.,E.K.Parkinson and P.R.Harrison, Profiling early head and neck cancer.Nat Rev Cancer, 2005.5(2):p.127-135.
[3] Leemans,C.R.,B.J.Braakhuis and R.H.Brakenhoff, The molecular biology of head and neck cancer.Nat Rev Cancer, 2011.11(1): p.9-22.
[4] Loning T,Ikenberg H,Becker J,et al.Analysis of oral papillomas,leukoplakias,and invasive carcinomas for human papillomavirus type related DNA[J].J Invest Dermatol,1985.8(4):417-420.
[5] Kreimer AR,Clifford GM, Boyle P,et al.Human papillomavirus types in head and neck squamous r,ell c:arcinomas worldwide:a systematic review[J].Cancer Epidemiol Biomarkers Prev,2005,14(2):467-475.
[6] Gillison ML,Kor.h WM,Capone RB,et al.Eviclenc:e fou a causal association between human papilloruavirus and a subset of head and neck cancers[J].J Natl Canc.er Inst,2000, 92(9):709-720.
[7] Junor E,Kerr G,Oniscu A,et a/.Benefit of chemotherapy as part of treatment for HPV DNA-positive but p16negative squamous cell carcinoma of the oropharynx [J].Br/Cancer,2012,106(2):358-365.
[8] Settle K,Posner MR,Schumakcr LM,et a/.Racial survival disparity in heacl ancl neck cancer results from low prevalence of human papillomavirus infection in black oropharyngeal cancer patients[J].Cancer Prev Res(Phila),2009,2(9):776-781.
[9] ClavelC,MasureM,PutaudI,etal.HybridcaptureⅡ,a new sensitive test for Human papilllomavirus detection.Comparison with hybridcaptureI and PCR results in cervical lesions[J].JClinPathol,1998,51(10):737-740.
[10] NagaoS,YoshinouchiM,MinyagiY,etal.Rapid and Sensitive detection of physical status of Human papilla mavirus type16 DNA by quantitative real-time PCR technique[J].JClinMicrobiol,2002,40(3):886-891.
[11] Gillison,M.L.,et al.,Evidence for a causal association between human papillomavirus and a subset of head and neck cancers.J Natl Cancer Inst,2000.92(9):p.709-720.
[12] Richards,L.,Human papillomavirus-a powerful predictor of survival in patients with oropharyngeal cancer. Nat Rev Clin Oncol, 2010. 7(9): p. 481.
[13] Ang,K.K.,et al.,Human papillomavirus and survival of patients with oropharyngeal cancer.N Engl J Med,2010. 363(1): p.24-35.
[14] Capra G,Giovannelli L,BellaVja C,etal HPV genotype prevalence in cytologically abnormal cervical samPles from women living in south Italy[J].V irusres,2008,133(2):185-200.
论文作者:路磊,李薇
论文发表刊物:《医药前沿》2017年5月第15期
论文发表时间:2017/5/27
标签：荧光论文; 阳性论文; 标本论文; 患者论文; 阴性论文; 检出论文; 率为论文; 《医药前沿》2017年5月第15期论文;