关键词：Leptin；腹内侧核；摄食；能量代谢
前言
已知长期能量摄入高于能量消耗将导致肥胖的产生，但是关于能量代谢调控及摄食调控的机制十分复杂，中枢及外周信号均参与其中[1]。Leptin在大鼠肥胖症的发病中具有重要作用，因此研究人员对于Leptin结构与功能的关系进行了大量的研究[2]。研究表明Leptin具有分泌蛋白的特征，且大部分为亲水性序列，其信号肽序列位于氨基端，由21个氨基酸残基组成[3]。目前研究认为Leptin具有广泛的生理功能，如抑制食物摄入，调节能量消耗、多种激素分泌及神经内分泌、炎症反应及免疫功能[4,5]。我们对大鼠腹内侧核VMH微量注射Leptin深入分析了其对代谢的调节作用，发现Leptin确实具有厌食作用，并且当大鼠核团注射时，能够调节全身能量稳态。此外，Leptin能够改变编码关键激素的mRNA的表达，而这些激素参与调节食物摄入和能量平衡。
1 材料与方法
1.1 实验动物
成年雄性Wistar大鼠，体质量在220–250 g，均在室温(25±2℃)、12h:12h昼夜循环光照、实验室标准饮食及自由进食和饮水的环境中饲养。实验开始前，大鼠禁食24 h，但可自由饮水。VMH内注射药物后，大鼠自由摄食和饮水。所有动物实验均严格按《青岛大学实验动物保护和使用管理办法》执行。
1.2 大鼠脑核团置管
大鼠腹腔注射戊巴比妥钠(剂量为50 mg / kg)麻醉后固定于脑立体定位仪，根据Paxinos&Watson大鼠脑图谱用微量注射仪定位[12]，以前囟为零点，定位VMH(前囟前：2.4mm；旁开：0.8 mm；颅骨下：8.5 mm)，用牙科钻钻孔，将一不锈钢套管置于VMH，用牙科粘固剂固定，不锈钢管探针封闭导管，缝合头皮切口[17]。大鼠分笼饲养，自由饮食饮水。手术结束后大鼠连续3天给予腹腔注射8万U青霉素以防止术后感染。大鼠恢复1周后开始实验。
实验结束后经套管向大鼠VMH内缓慢注射滂胺天蓝溶液，显微镜下观察药物注射的位置是否准确。
1.3 基因表达分析
确定外源性Leptin给药是否对编码mRNA的代谢激素的表达有任何影响。收集胃、小肠和大肠，胰腺和脂肪(白色和棕色)组织。在实验结束后，大鼠(n=3)腹腔注射戊巴比妥钠(50 mg/kg)麻醉，断头处死。快速取脑，分离VMH组织置于液氮内，并储存在-80℃冰箱。组织收集在中午开始，并在2小时内完成。根据制造商的说明，使用TRIzol试剂(Invitrogen Canada Inc.，Ontario，Canada)或Aurum总RNA试剂盒(Bio-Rad Laboratories Inc.，Ontario，Canada)从10mg组织匀浆中提取总RNA。使用NanoDrop 2000c(Thermo，Vantaa，Finland)测定RNA的浓度和纯度，并使用iScript cDNA合成试剂盒(Bio-Rad laboratories，Inc.，Ontario，Canada)合成互补DNA，并通过实时RT PCR定量。
用于定量mRNA表达的引物序列和PCR条件列于表1中。使用具有SYBR Green Master Mix的RT-定量PCR和CFX Connect实时PCR检测系统(Bio-Rad)测量基因表达，并且使用Livak方法将作为管家基因的β-肌动蛋白的表达标准化。在样品分析之前，通过验证和优化退火温度实现引物的高效率转录。样品一式两份进行，阴性对照反应混合物中不存在模板DNA。
1.4 大鼠VMH微量注射Leptin对代谢的影响
大鼠被安置并使其适应环境。在核团给药之前记录大鼠的体重。将大鼠转移至综合实验室动物监测系统(CLAMS; Columbus Instruments，Ohio)笼中以适应环境，并在第一次研究之前监测饲养和代谢参数4天。在监测代谢参数之前，根据制造商的指南校准CLAMS气体传感器和天平。将药物或生理盐水注射至大鼠VMH，通过CLAMS系统检测药物对大鼠代谢的影响。CLAMS系统中的单个笼子连接到开路热量计，用于测定氧气消耗(VO2)，CO2产生(VCO2)，呼吸交换率(RER)，热量，食物和水摄入量以及活动(水平，垂直)和动态运动。通过使用以下等式将热值乘以VO2(EE =CV*VO2)和CV来确定能量消耗(EE)：CV =(3.815 + 1.232)* RER。使用由Columbus instruments(http://www.colinst.com)提供的方案中描述的方程和方法，通过采用McLean和Tobin的方法从RER数据推断来自碳水化合物和脂肪的能量。使用与第一组大鼠体重匹配的第二组大鼠重复进行实验，获得相似的结果。
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1.5 统计学分析
应用SPSS 18.0和PPMS 1.5软件分析数据，所有数据均以(±SD)表示，多样本均数比较采用单因素方差分析，两组间样本均数比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 Leptin影响编码代谢激素的mRNA表达
与NS对照组相比，VMH微量注射Leptin，大鼠白色脂肪组织（WAT）中脂联素mRNA和抵抗素mRNA（P<0.05）、棕色脂肪组织（BAT）中解偶联蛋白1（UCP-1）mRNA（P<0.05）、以及胃粘膜组织中ghrelin mRNA（P<0.05）和小肠粘膜组织中胆囊收缩素（CCK）mRNA（P<0.05）的表达均显著上调，而大肠粘膜组织中PYY mRNA表达则下调（P<0.05），且Leptin注射组的大鼠，其棕色脂肪组织中的UCP1 mRNA表达量比NS组高6倍，但胰腺胰岛素mRNA和胰高血糖素mRNA表达无显著差异（P>0.05）。
2.2 VMH微量注射Leptin对大鼠摄食及饮水的影响
与NS对照组相比，光照期或黑暗期VMH微量注射Leptin，大鼠12h累计食物摄入量均显著减少（P<0.05），与黑暗期NS组相比，光照期VMH微量注射NS，大鼠摄食量无显著差异（P>0.05），但与黑暗期Leptin组相比，光照期Leptin组的抑摄食作用明显弱于黑暗期Leptin组（P<0.05）。
与NS对照组相比，VMH微量注射Leptin，大鼠在黑暗期或光照期饮水量均无显著差异（P>0.05）；与黑暗期NS组相比，光照期VMH微量注射NS，大鼠饮水量显著减少（P<0.05）。且与黑暗期Leptin组相比，光照期VMH微量注射Leptin，大鼠饮水水量也显著减少（P<0.05）。
2.3 VMH注射Leptin对代谢参数的影响
在黑暗或光照阶段，与NS对照组相比，VMH微量注射Leptin，大鼠每小时产热量（P<0.05），每小时总能量消耗量（P<0.05）、每小时脂肪酸氧化率（P<0.05）、每小时耗氧量（P<0.05）或每小时CO2产生量（P<0.05）均显著升高，但每小时碳水化合物氧化率无显著改变（P>0.05），黑暗与光照期相比，NS对照组之间或用药组之间比较无显著差异（P>0.05）。
3 讨论
既往研究显示Leptin能够抑制食物摄入，调节能量消耗，且对多种神经分泌肽具有调节作用[2]。本研究结果显示Leptin在大鼠中具有相似的厌食作用。在本研究中，我们观察了Leptin注射至VMH后，对胰腺和脂肪组织产生的长期代谢信号及其对体重的影响。在Leptin注射后，胰腺胰岛素和胰高血糖素mRNA表达无改变。然而，棕色脂肪中UCP1 mRNA表达显著增加。上述结果提示，下丘脑VMH内Leptin参与减少饮食进而降低体重调控可能与这些摄食相关肽表达有关，Leptin也许可作为大鼠新型代谢肽。
下丘脑VMH可参加调控机体多种生理过程，是大脑中十分重要的脑区，尤其是在调控摄食及能量代谢功能中占有重要地位。本研究发现，VMH微量注射Leptin，光照期或黑暗期大鼠12h累计食物摄入量显著减少，尤以黑暗期抑食效应更为显著；与黑暗期NS组相比，光照期VMH微量注射NS，大鼠饮水量显著减少。提示，Leptin可能主要通过减少大鼠摄食和饮水量进而降低大鼠体重。在黑暗或光照阶段，与NS对照组相比，VMH微量注射Leptin，大鼠每小时产热量，每小时总能量消耗量、每小时脂肪酸氧化率、每小时耗氧量或每小时CO2产生量均显著升高；这表明，Leptin降低大鼠体重可能是通过增加上述能量消耗途径而实现的。
本研究为深入理解Leptin对大鼠摄食和能量代谢调节的机制提供了重要的数据，但需要进一步的研究以解释Leptin如何与其它神经肽进行协同或抑制作用来共同参与调节大鼠食物摄入，以维持体重和能量平衡。因此，当前的研究对于肥胖症及暴食症的治疗及临床药物的研发具有重要意义。
参考文献
[1]Gridneva Z, Kugananthan S, Rea A, Lai CT. Human Milk Adiponectin and Leptin and Infant Body Composition over the First 12 Months of Lactation[J]. Nutrients, 2018, 10(8): 1125
[2]Cohen TR, Hazell TJ, Vanstone CA, Rodd C. Changes in eating behavior and plasma leptin in children with obesity participating in a family-centered lifestyle intervention[J]. Appetite, 2018, 125(7): 81-89
[3]Roth CL, von Schnurbein J, Elfers C. Changes in Satiety Hormones in Response to Leptin Treatment in a Patient with Leptin Deficiency[J]. Horm Res Paediatr, 2018, 11(4): 1-7
[4]Haghiac M, Basu S, Presley L, Serre D. Patterns of adiponectin expression in term pregnancy: impact of obesity[J]. J Clin Endocrinol Metab, 2014, 99(9):3427-3434
[5]Halaas JL, Gajiwala KS, Maffei M, Cohen SL, Chait BT, Rabinowitz D, et al. Weight-reducing effects of the plasma protein encoded by the obese gene[J]. Science, 1995, 269(5223): 543–546
论文作者:孙平1,2，李云霞2，朱琳2，李红2，刘平2
论文发表刊物:《医师在线》2019年第19期
论文发表时间:2019/12/6
标签：大鼠论文; 微量论文; 能量论文; 每小时论文; 组织论文; 饮水论文; 脂肪论文; 《医师在线》2019年第19期论文;