吕梁[1]2004年在《细小病毒B19检测基因芯片的制备及初步研究》文中研究说明人细小病毒B19是所有真核病毒中最简单的一类单链线状DNA病毒，其基因组全长为5594碱基(nt)。该病毒临床表现谱广泛而复杂。自1990年首次证实我国存在细小病毒B19感染后，陆续报告细小病毒B19是我国孕妇非免疫性流产、儿童急性再障危象、急性血小板减少性紫癜等疾病的重要病因之一。同时，我国妇女和儿童血清中保护性抗体水平低，易发生该病毒感染。因此，迫切需要一种快速、敏感、高通量、高效的临床诊断方法。 基因芯片技术为细小病毒B19的检测提供了一种有效途径。利用基因芯片技术，可将病毒的所有基因信息集成到一块小小的玻片上，作为临床诊断和治疗的依据。实验中我们使用了两种方法制备芯片探针。一种是PCR扩增DNA片段，另一种是人工合成寡核苷酸探针。 本研究首先利用Primer Premier 5.0软件针对细小病毒B19基因组保守区域设计PCR特异性引物。扩增特异性片段，纯化PCR产物，连接T载体并转化；提取重组质粒，测序鉴定；扩增质粒，将产物纯化并作为基因芯片的探针。用基因芯片点样仪将探针固定在特殊处理的玻片上。运用限制性显示(RD)技术，用Cy3标记的通用引物标记样品，重复检测。通过与基因芯片杂交，严谨洗涤，将非特异性的标记片段洗脱后，经扫描仪扫描，计算机解读。扫描结果显示，制备的芯片可有效检测出细小病毒B19基因。 其次通过合成仪合成60 mer寡核甘酸探针来制作寡核甘酸基因芯片。根据GenBank数据库中的信息，利用美国国家生物技术信息中心(NCBI)提供的BLAST分析软件找出细小病毒B19的保守序列，用生物学软件Oligo6.0设计10条60 mer Oligo探针。使用ABI公司3900合成仪合成探针，以12％变性PAGE纯化探针，制备寡核苷酸基因芯片。将芯片分别与Cy3标记的细小病毒B19基因及正常人cDNA杂交，比较杂交结果。结果与病毒基因杂交的芯片杂交信号明显，而与正常人cDNA基本无杂交。 综上所述，本研究采用了PCR扩增和寡核苷酸合成等两种方法制备细小病毒B19检测芯片探针，制备了细小病毒B19检测基因芯片。并进行了检测芯片可靠性的实验室验证及初步应用。
张学红[2]2009年在《细小病毒B19与人博卡病毒的基因检测及基因特异性探针的初步研究》文中提出细小病毒属于小DNA病毒,有的可以自主复制(如B19病毒、HBoV以及CPV、PPV),有的则需依赖其它辅助病毒才能复制(如AAV),可引起人类及动物多种疾病。自主细小病毒基因组序列有一些共同点,多数成员间核苷酸序列同源性较高。通常细小病毒具有宿主特异性,但是近年的一些研究结果表明,随着新的细小病毒突变株的出现及新的细小病毒的被发现,细小病毒的宿主特异性正在发生改变,在未来动物细小病毒有可能象SARS相关冠状病毒一样感染人类。目前我国儿童中主要存在B19病毒及HBoV感染,两者均可通过呼吸道传播。B19病毒可引起儿童第五病、急性再生障碍性贫血危象及急性血小板减少性紫癜等疾病,尤其是免疫功能低下或缺陷患儿可发生持续感染和慢性贫血,危及生命。HBoV是与牛细小病毒和犬极小病毒同属细小病毒亚科中的博卡病毒属,可引起儿童急性呼吸道感染。目前,国内外所建立的细小病毒检测技术是依据单株病毒或标准株的基因序列分析,不是一套各细小病毒株均可检测的快速生物检测系统,故大规模、快速检测细小病毒感染较困难。基因芯片技术为细小病毒的检测提供了一种快速、敏感、高通量、高效的临床诊断方法。因此有必要建立检测细小病毒的基因芯片,以便在细小病毒大规模流行时,最大限度地对所有可能成为传染源的细小病毒(包括插入变异的片段)进行检测。研究目的利用PCR技术制备B19病毒及HBoV等细小病毒特异性探针,在PCR循环过程中制备生物素标记的B19病毒及HBoV靶序列,为后续基因芯片的制备及检测奠定了基础。对B19病毒及HBoV的临床标本进行基因检测,对其临床特征进行分析,为B19病毒及HBoV感染的防治提供理论依据,并为细小病毒基因芯片的临床检测提供阳性样本。实验方法1.通过Genbank获得B19病毒、HBoV、CPV及PPV全基因序列及编码各蛋白的部分基因的基因序列号,针对上述基因分别进行BLAST及ClustalW分析,所得结果与相关文献对照,确定各细小病毒特异性基因区域。利用Primer Premier 5.0软件针对上述细小病毒基因组保守区域设计PCR特异性引物。2.利用PCR方法制备B19病毒、HBoV、CPV及PPV特异性探针,产物进行测序分析。3.以生物素标记的dNTP为底物,在PCR循环过程中制备生物素标记的B19病毒及HBoV靶序列。4.对2008年1月～2008年12月收集的252例以急性呼吸道感染住院患儿的血液标本和/或咽拭子、痰液标本进行了HBoV及B19病毒的检测,为细小病毒属基因芯片的特异性及临床检测提供阳性样本。5.分析B19病毒及HBoV呼吸道感染患儿的临床特点及流行病学特征。结果1.B19病毒、HBoV、CPV及PPV特异性探针及靶序列琼脂糖凝胶电泳检测时,均出现预期的明亮、单一条带。产物测序结果与标准株的变异小于1%。2.252份咽拭子及痰液标本中共检测到15份(6.0%)HBoV PCR阳性扩增产物,53.3%患儿合并有其它呼吸道病毒的感染,随机抽取1份HBoVNS1基因PCR阳性产物进行核苷酸序列测定,所测得的291bp核苷酸序列运用ClustalW软件与Genbank中的HBoV基因序列进行比较,结果显示:我们所获得的HBoV NS1测序的291bp与两个原型株HBoV Stockholml(stl,No.DQ00495)、HBoV Stockholm2(st2,No-DQ00496)和北京地区的2株流行株(No.DQ988934.2及No.DQ988933.1)的同源性大于99%。血液标本中未检出HBoV。3.在4例急性呼吸道感染患儿的咽拭子及痰液标本中B19病毒DNA检测阳性,其中有3例患儿伴有皮疹。结论1.针对简单、基因组较小的细小病毒,利用PCR技术制备细小病毒基因芯片的特异性探针及靶序列是一种快速、简单、低成本的实用方法。2.HBoV在15例以急性呼吸道感染住院患儿的咽拭子及痰液标本中检出,HBoV感染以下呼吸道感染为着,与其它呼吸道病毒有较高的合并感染,HBoV单独感染及其与其它呼吸道病毒的合并感染在临床特征方面无明显差别。血液标本中未检出HBoV。3.在急性呼吸道感染患儿的呼吸道标本中B19病毒DNA的检出率(1.6%)较低,但是这种使用非血液标本诊断急性B19病毒感染的方法值得尝试,尤其是对于儿童出疹性疾病的病原诊断。
吕梁, 马文丽, 石嵘, 马晓冬, 孙朝晖[3]2004年在《细小病毒B19诊断芯片的初步研究》文中认为初步探讨并制备细小病毒B19诊断芯片,进行实验室验证.用基因芯片点样仪将细小病毒B19诊断探针固定在特殊处理的玻片上,以细小病毒B19质粒重复检测.运用限制性显示(RD)技术,用Cy5标记的通用引物进行荧光标记,通过与基因芯片杂交,严谨洗涤,将非特异性的标记片段洗脱后,经扫描仪扫描,计算机解读.杂交结果显示,Cy5标记的探针均出现杂交信号,而阴性对照和空白对照的杂交信号均很弱;芯片检测具有高特异性、敏感性和可重复性.初步建立了较可靠的制备与检测细小病毒B19诊断芯片的方法,经验证诊断准确率高,假阳性率低.
张焕容[4]2005年在《伪狂犬病病毒、猪细小病毒和流行性乙型脑炎病毒检测基因芯片的构建及检测技术研究》文中提出本研究首次构建了PRV-PPV-JEV检测基因芯片,建立了PRV、PPV和JEV基因芯片检测新技术,该基因芯片技术对PRV、PPV和JEV具有同步检测和鉴别诊断,同时对PRV的野毒株和基因缺失疫苗株也具有鉴别功能。主要内容为以下几个部分: 1.PRV-PPV-JEV检测基因芯片靶基因克隆及鉴定 对PRV、PPV和JEV进行病原分子生物学分析,参考GenBank和文献中报道的PRV、PPV和JEV基因序列,采用Array Designer2.0软件分别设计了PRV、PPV和JEV靶基因引物。采用PCR或RT-PCR扩增靶基因扩增获得16个靶基因片段,用pMD18-T克隆和筛选获得了T/gB、T/gG、T/TK、T/gE、T/B1 NS1、T/B1 VP2、T/SR-1 NS1、T/SR-1 NS2、T/SR-1 NS3、T/SR-1 VP1、T/SR-1 VP2、T/C、T/PrM/M、T/E、T/NS1、T/NS5靶基因重组质粒。经序列测定和对位排列分析,结果为gB、gG、gE、TK靶基因扩增自PRV Fa株,分别为PRV gB、gG、gE、TK基因片段,片段长度分别为324bp、261bp、148bp、177bp;PPV靶基因B1 NS1、B1 VP2扩增自PPV B1株,SR-1 NS1、SR-1 NS2、SR-1 NS3、SR-1 VP1、SR-1 VP2扩增自PPV SR-1株,片段大小分别为127bp、471bp、208bp、550bp、389bp、209bp、471bp;JEV C、PrM/M、E、NS1和NS5靶基因扩增自JEV SA14-14-2株,分别为JEV C、PrM/M、E、NS1和NS5基因片段,片段长度分别为238bp、451bp、439bp、476bp和448bp。多重序列比对和BLASTN分析进一步表明:克隆鉴定的靶基因为目标病原的高度保守性基因,为PRV-PPV-JEV检测基因芯片的构建提供了确实可靠的材料。 2.PRV-PPV-JEV检测基因芯片的构建 本试验研究了PRV-PPV-JEV检测基因芯片靶基因和探针制备方法、靶基因杂交温度和特异性,确定了构建诊断芯片的靶基因及其浓度和有关芯片质量控制方法,结果如下。 1) 靶基因和定位对照基因的制备 以靶基因重组质粒DNA为模板,采用PCR扩增、异丙醇沉淀法纯化靶基因,其浓度和纯度符合芯片制作要求,定位对照基因制备参照曹叁杰(2004)报道方法进行。 2) 探针的制备 以病毒DNA、cDNA和λDNA为模板,PCR扩增标记荧光素Cy3制备探针,Cy3-dCTP的使用终浓度为2.5 μmol/L,制备的探针浓度在121-748ng/μL之间。 3) 本试验确定了靶基因最适点样浓度为200ng/μL,芯片系统灵敏度为3pg/μL探针,筛选出杂交信号强、杂交特异性好的靶基因及其杂交温度,确定了PRV-PPV-JEV检测基因芯片的预杂交时间为1h和杂交时间为6h。 4) 数据分析采用QuantArray~(?) Ver.3.0软件,数据量化使用总信号强度模式和信号中位值模式,总信号模式输出的样点信号强度与背景之比为SNR。 5) 基因芯片制备和质量控制 研究确定PRV gB、PRV gG、PRV TK、PRV gE、PPV B1 VP2、PPV SR-1 NS2、PPV SR-1 NS3、PPV SR-1 VP1、JEV C、JEV PrM/M、JEV E、
鲜思美[5]2009年在《水禽重要疫病的多重PCR与基因芯片检测技术研究》文中提出我国水禽养殖规模不断扩大,其中鸭饲养量平均每年以10%-15%的速度递增,鹅饲养量约占世界养鹅数量的70%以上。随着水禽养殖集约化程度的提高,水禽的传染性疫病如禽流感、鹅副粘病毒病、鸭瘟、小鹅瘟、鸭病毒性肝炎(Ⅰ型)、番鸭细小病毒病、禽霍乱等对水禽养殖业产生重要危害。本研究针对生产上水禽常发的重要疫病鸭瘟(Duck plague,DP)、小鹅瘟(Gosling plague,GP)、鹅副粘病毒病(GooseParamyxovirosis,GPMVS)和番鸭细小病毒病(Muscovy duckling parvovirosis,MDPVS)进行了多重PCR与基因芯片检测技术研究。主要研究内容如下:1水禽重要疫病的叁种多重PCR检测技术研究1)GPV和DPV多重PCR方法的建立根据GenBank上已公布的鹅细小病毒(GPV)和鸭瘟病毒(DPV)基因序列,分别设计合成了针对GPV VP3基因和DPV UL6基因的两对特异性引物,以人工接种鸭胚尿囊液和人工感染病例组织的核酸提取物为模板,采用Perfectshot~(TM) Ex Taq进行PCR检测。试验结果显示,所建立的多重PCR反应体系对GPV与DPV核酸提取物均能扩增出与预期设计大小一致(分别为550 bp和376 bp)的特异DNA条带,而对鹅副黏病毒、鸭肝炎病毒、鸭源沙门氏菌、鸭源巴氏杆菌和鸭疫里默氏杆菌均为阴性反应;对GPV核酸的最小检出量为1.66 pg,对DPV核酸为0.166 Pg;对20份人工感染雏鹅肝脏组织中GPV与DPV单独或混合感染的检出率均为100%。表明建立的GPV-DPV多重PCR方法具有特异性强、敏感性高、快速简便等特点,可用于GPV或/和DPV临床感染病例的联合检测与鉴别诊断。2)GPV和GPMV多重PCR检测方法的建立根据GenBank上公布的鹅副粘病毒(GPMV)和鹅细小病毒(GPV)基因序列,分别设计合成了针对GPMV HN基因和GPV NS基因的两对特异性引物,以GPMV/GPV人工感染鹅胚尿囊液和感染病例组织的核酸提取物为模板,进行RT-PCR检测。建立的多重RT-PCR反应体系对GPMV和GPV核酸提取物均能扩增出与预期设计大小一致(分别为484 bp和206 bp)的特异DNA条带,而对DPV、鸭肝炎病毒、鸭源沙门氏菌、鸭源巴氏杆菌和鸭疫里默氏杆菌均为阴性反应;对GPMV和GPV核酸的最小检出量分别为86 pg和0.176 pg;对GPV单独感染病例的检出率为100%(5/5),GPMV单独感染病例的检出率为100%(5/5);混合感染病例的检出率GPV为100%(10/10),GPMV为80%(8/10)。表明建立的GPMV-GPV多重PCR方法具有特异性强、敏感性高、快速简便等特点,可用于GPMV或/和GPV临床感染病例的联合检测与鉴别诊断。3) GPV和MDPV多重PCR检测方法的建立根据GenBank上公布的鹅细小病毒(GPV)和番鸭细小病毒(MDPV)基因序列,分别设计合成了针对GPV NS基因和MDPV NS-VP1基因的两对特异性引物,以GPV感染鹅胚尿囊液和MDPV感染番鸭胚尿囊液的核酸提取物作为模板,分别进行单独或多重PCR检测。所设计的PCR体系对GPV和MDPV核酸均能扩增出与预期设计大小一致(730 bp和624 bp)的特异DNA条带,而对鸭瘟病毒(DPV)和鹅副粘病毒(GPMV)均为阴性反应;单一PCR核酸检测的灵敏度是GPV 0.144 pg,MDPV 28.8 pg,而多重(二联)PCR检测灵敏度是GPV 14.4 pg和MDPV 28.8 pg。表明建立的GPV-MDPV复合PCR方法可用于其鉴别诊断和联合检测。2 DPV-GPV-GPMV检测基因芯片的构建与检测技术研究1)DPV-GPV-GPMV检测基因芯片靶基因克隆及鉴定通过对DPV、GPV和GPMV进行基因比较分析后,采用Array Designer4.2软件分别设计DPV、GPV和GPMV引物,以PCR或RT-PCR扩增获得13个靶基因片段,并进行了克隆和测序分析,结果获得了T/DPV DNApolymeras、T/DPV UL50、T/DPVTK、T/DPV UL6、T/DPV phosphoprotein、T/GPV NS、T/GPV VP3、T/GPV VP1-VP2、T/GPV VP2-VP3、T/GPMV HN、T/GPMV L、T/GPMV F和T/GPMV NP等13个靶基因,多重序列比对和BLASTN分析进一步表明:针对DPV靶基因的同源性在88%以上,GPV靶基因的同源性在92%以上,GPMV靶基因的同源性在92%以上,为DPV-GPV-GPMV检测基因芯片构建提供了确实可靠的材料。2)DPV-GPV-GPMV检测基因芯片的构建以所获得的13个靶基因,构建了DPV-GPV-GPMV检测基因芯片,并对芯片质量进行了评价。每张芯片含有特异靶基因、阳性参照、空白对照等15个靶基因,每个靶基因重复点10次,样点直径100μm,间距300μm;靶基因终浓度为250 ng/μL点制在氨基化基片上,紫外线交联固定,制备好的芯片经过42℃预杂交2 h之后,以Cy3标记探针杂交16 h,经梯度洗涤后,532 nm波长扫描采集杂交信号;GenePix Pro 6.0软件进行数据分析,芯片检测阳性判读标准为信噪比SNR_m≥2.0(信号总强度中位值模式量化)。结果表明,所制芯片上的靶基因间无交叉杂交,芯片特异性强,片间差异小。3)DPV-GPV-GPMV检测基因芯片检测技术研究多重PCR扩增标记探针,采用引物组合Ⅰ(GPV NS、DPV DNApolymerase和GPMVF)、引物组合Ⅱ(DPV UL50、DPV UL6和GPMV HN)、引物组合Ⅲ(DPV TK、GPVVP1-VP2和GPMV NP)和引物组合Ⅳ(GPV VP3、DPV phosphoprotein和GPMV L),多重PCR扩增标记Cy3制备探针与芯片杂交;并以GPV NS探针和引物组合Ⅰ扩增的混合探针比较基因芯片与琼脂糖凝胶电泳的灵敏度。试验结果显示:DPV-GPV-GPMV检测基因芯片与GPV GZ2、DPV SC和MDPV的VP3、VP1-VP2有杂交信号,而与MDPV的NS探针、鸭肝炎病毒、鸭源沙门氏菌、鸭源巴氏杆菌、鸭疫里默氏杆菌无杂交信号;芯片系统检测灵敏度可达7.886 ng/L探针,高于琼脂糖凝胶电泳;应用该诊断基因芯片对20份人工感染病料进行检测发现,DPV检出率为100%(20/20),GPV检出率为85%(17/20),GPMV检出率为80%(16/20)。表明所制备的DPV-GPV-GPMV检测基因芯片具有特异性强、灵敏度高等特点,能从核酸杂交水平上对鸭瘟病毒、鹅细小病毒、番鸭细小病毒和鹅副粘病毒进行多基因鉴定和检测,可用于四种病原混合感染的诊断。
梁冬莹[6]2007年在《ADV分离株全基因序列测定及VP2抗原表位区的表达与应用》文中指出水貂阿留申病(Aleutian Disease，AD)是由细小病毒亚科(Parvovirinae)阿留申水貂病毒属(Amdovirus)水貂阿留申病毒(Aleutian mink disease virus，ADV)引起的免疫系统病理性失调，是一种主要侵染水貂、病程缓慢的传染性疾病。该病以垂直和水平传播两种形式在世界各国的貂群中广泛流行，导致没有抗体的新出生幼貂的急性间质性肺炎甚至死亡，成年水貂的繁殖能力、皮张质量、健康状况下降以及死亡率增加，对水貂养殖业造成不可低估的经济损失。近年来，我国水貂养殖区阿留申病的流行情况在国内时有报道，高水平的AD感染一直是严重影响我国水貂养殖业高效、健康发展的一个非常重要的因素之一。由于目前针对该病缺少有效的防治方法，普遍采用的是通过定期检测，淘汰患病貂群，从而达到净化种群的目的。因此，在国内进行分离鉴定病毒株及进行分子生物学特性研究，建立国内适用的血清学诊断方法，将会对今后国内开展水貂阿留申病的临床诊断、有效防制及进一步的深入研究，提供更多的科学依据。在本研究中，首先通过CIEP以及本实验室建立的ADV PCR检测方法，对黑龙江某水貂养殖场发病送检貂以及辽宁某水貂养殖区疑似阿留申病貂进行检测，将经两种方法检测均为阳性结果的毒株进行PCR扩增产物的序列测定，从中抽取序列较为保守的四株病毒与标准对照毒株进行序列比对和同源性分析，与ADV-G相应片段的核酸同源率分别为92.8％、93.9％、93.2％和93.5％，与参考株ADV-Utah的同源率分别为94.5％、98％、94.6％和95.5％，确定为ADV特异性核苷酸片段。依据鉴定的结果，成功鉴定了四株病毒，分别命名为MS-1、DL-1、DL-2和DL-3。将MS-1、DL-1、DL-2和DL-3株病毒经组织病料提取总DNA，采用依据标准毒株ADV-G的DNA序列设计并合成的四对引物，经PCR扩增后分别构建重组质粒并测序，将测序结果用DNA Star软件中的SeqMan程序进行拼接，获得四株病毒的近全长DNA序列。用DNA Star软件MegAlign程序中的Jotun Hein method将实验测得的毒株与国外病毒参考株的对应核苷酸序列进行同源性比较和进化树分析。结果表明，ADV-Utah与四个实验毒株的序列同源性较高，同源率为92.9-93.4％，ADV-G、ADV-SL3与实验毒株的同源性较低；四个实验毒株和叁个参考毒株被分别划归为两个组，分属于两个进化分支；实验毒株中ADV-DL1与DL2和DL3虽然同为大连分离株，却表现出较远的亲缘关系。用DNA Star软件MegAlign程序中的Clustal W method将实验测得的ADV毒株核苷酸序列、ADV参考株序列以及细小病毒其它四个属的代表毒株全序列进行进化树分析，发现14株病毒共划归为五个相对独立的进化分支，ADV与牛犬细小病毒作为细小病毒亚科中新增的属，与其它属的成员分属于不同的进化分支，分析结果验证了ICTV8公布的新分类体系的合理性。选择VP2蛋白主要抗原表位区相对保守的ADV MS-1毒株作为种毒，分别设计合成两对引物，用PCR方法扩增其VP2基因中主要抗原表位区的两个片段，分别将其克隆到原核表达载体pMAL-c2的多克隆位点中，构建重组表达质粒pMAL-VP2a和pMAL-VP2b，经PCR扩增、酶切和测序分析确证其正确插入到表达载体中，阅读框正确，成功地构建了原核表达载体。阳性重组质粒转化宿主菌TB1，用IPTG进行诱导表达，对表达产物进行SDS-PAGE检测和免疫印迹分析。结果表明两段融合蛋白均以包涵体形式获得了有效表达，表达产物分别占总菌体蛋白的32.7％和37.41％；表达产物的分子质量分别约为63kD和65kD，与理论推测的分子质量一致；在终浓度为1mM的IPTG诱导下，4h时其表达量达到高峰：Western blot分析表明表达蛋白能被兔抗MBP抗体所识别。将分离和初步纯化的表达包涵体蛋白作为抗原，对阳性血清进行CIEP检测，验证其免疫活性，并与标准抗原的CIEP检测结果相比较，二者的符合率达到94.3％。以本实验获得的重组蛋白作为诊断抗原的特异性、重复性、敏感性均较好，初步建立了临床诊断方法。总之，本研究对ADV国内分离毒株进行分离鉴定和全序列测定，为研究国内ADV病毒株的进化特点和规律提供基础性资料；在国内首次利用原核表达载体成功地对VP2主要抗原表位区进行表达，并以其为抗原，初步建立了ADV抗体的CIEP检测方法，将为国内养貂场有效开展阿留申病血清学调查提供有效的技术手段，在貂群的净化中发挥巨大的作用。
吕梁, 马文丽, 孙朝晖, 马晓冬, 郑文岭[7]2003年在《细小病毒B19诊断芯片探针的制备》文中指出目的 制备细小病毒B19诊断芯片探针。方法 利用PrimerPremier 5 0软件针对细小病毒B19基因保守区域设计PCR引物 ,纯化扩增产物 ,克隆鉴定。结果 序列分析表明 ,扩增片段均为细小病毒B19特异基因。结论 利用PCR扩增产物可制备细小病毒B19诊断芯片探针。
徐胜平[8]2017年在《九种发热伴出疹病原体基因芯片检测方法的建立》文中研究表明目的:发热伴出疹性疾病(RFIS)是以发热和出疹为主要临床症状,伴有全身或局部皮肤及粘膜出疹,并可能引发其他临床症状的一系列疾病的总称,包括麻疹、风疹、伤寒、猩红热、流行性出血热、斑疹伤寒、流行性脑脊髓膜炎、水痘、带状疱疹、天花等,已经列入我国重点监测的传染性疾病的范畴之内。导致该类疾病的病原体包括病毒和细菌两大类,主要有麻疹病毒、肠道病毒、风疹病毒、登革热病毒、人类小DNA病毒B19、水痘-带状疱疹病毒以及溶血性链球菌、伤寒沙门氏菌。这些病原体多数在潜伏期或临床症状不明时已具有传染性。目前发热伴出疹性疾病的检测方法主要有分离培养、PCR法和免疫学诊断法,这些方法均不能满足同时检测多种病原体的需要。本文研究目的是建立一种能准确、同时、快速的检测九种发热伴出疹病原体的化学发光基因芯片的方法,即肠道病毒71型、登革热病毒、风疹病毒、水痘带状疱疹病毒、麻疹病毒、人类小DNA病毒B19、柯萨奇病毒A16型、A组β型溶血性链球菌、伤寒沙门氏菌。方法:通过文献调研确定待检测的病原体及其病原体的靶基因,从每个病原体靶基因的高度保守区序列中设计引物与探针,并筛选出特异性的引物和探针。进行多重不对称PCR扩增,将带有标记的扩增产物与带有特异性探针的芯片杂交,经洗涤,化学发光显色后进行结果分析。优化多重PCR体系、扩增条件、杂交条件以及化学发光检测条件后,评价该芯片的特异性、重复性和灵敏度。用实时荧光PCR法与芯片法分别检测肠道病毒EV71梯度稀释的核酸,比较两种方法的灵敏度。并利用该方法对74例发热伴出疹性疾病的实际临床样本进行检测以评价其实用性。结果:完成了九种发热伴出疹病原体基因芯片检测方法的建立。1.根据流行病学统计的调研结果最终确定九种待检测的病原体:麻疹病毒、风疹病毒、水痘带状疱疹病毒、肠道病毒71型、登革热病毒、人类小DNA病毒B19、柯萨奇病毒A16型、A组β型溶血性链球菌和伤寒沙门氏菌。共筛选出了11条特异性检测探针和9对特异性扩增引物。2.构建了这九种病原体的质粒参考品,并成功构建了麻疹病毒、风疹病毒、柯萨奇病毒A16型、肠道病毒71型、登革热病毒这五种RNA病毒的体外转录RNA参考品。3.优化后的多重PCR体系分为A、B两管,在优化好的多重PCR体系、杂交条件以及检测条件下,该芯片显示出良好的重复性、特异性以及灵敏度。4.质粒参考品和体外转录RNA参考品的最低检测限均达到3×103copies/反应,芯片法比实时荧光PCR法的灵敏度低10倍,但芯片具有明显的高通量优势。5.74例临床样本的检测灵敏度为95.00%,检测特异性为100.00%,总符合率为95.95%。结论:本文建立了一种能同时检测九种发热伴出疹病原体的化学发光检测基因芯片的方法,并经过初步验证该检测方法具有良好的特异性、重复性和灵敏度,为发热伴出疹的流行病学研究及其临床诊断提供了一种高通量、高效率的筛查手段。
张永涛[9]2011年在《猪瘟病毒和猪2型圆环病毒基因芯片检测技术研究》文中认为本试验采用基因芯片技术、借助PCR和核酸标记技术,构建了猪瘟病毒和猪2型圆环病毒检测基因芯片。不仅为多种猪传染性疾病在同一张芯片上进行检测奠定基础,而且也为其他动物疫病应用基因芯片方法进行检测提供了理论依据。主要内容分为以下几个部分:1.CSFV-PCV2检测基因芯片目的基因的克隆及鉴定通过对CSFV和PCV2进行病原及分子生物学分析,参考GenBank和文献中报道的CSFV和PCV2基因序列,选择其保守序列并采用Primer Primier5.0软件设计引物。采用PCR或RT-PCR方法扩增目的基因,获得2个目的基因片段;用pMD18-T或pUCm-T克隆载体对目的基因进行克隆并对重组质粒进行PCR或酶切鉴定,然后进行测序。试验结果表明:目的基因被成功克隆。多重序列比对进一步表明:克隆鉴定的目的基因为病原体的高度保守基因,为CSFV-PCV2检测基因芯片的构建提供了确实可靠的材料。2.CSFV-PCV2检测基因芯片的构建通过对引物进行标记,使荧光素(Cy3)掺入到PCR产物中,通过对探针进行氨基修饰,使其更好的与经过醛基化的基片更好的结合,探针就能够更好的固定在基片上;通过对重组质粒PCR扩增产物与相应探针杂交温度和杂交时间的优化,筛选出了杂交特异性好的目的基因并确定了适宜的杂交温度和杂交时间,最后通过扫描仪对杂交结果进行扫描获取杂交图像并用计算机软件对杂交结果进行分析,完成CSFV-PCV2检测基因芯片的构建,结果如下:1)目的基因的制备:以目的基因重组质粒DNA为模板,采用PCR扩增、异丙醇沉淀法纯化目的基因,其浓度和纯度均符合芯片制作要求。2)确定了探针最适点样浓度为100ng/μL,筛选出了杂交信号强、杂交特异性好的目的基因,确定了CSFV-PCV2检测基因芯片的杂交温度为48℃,杂交时间为5h。3)确立了点样环境参数:相对湿度55-65%,温度15-30℃。各探针点间距为1.5mm。3.CSFV-PCV2检测基因芯片检测技术研究试验采用以PRV为阴性对照株,对构建的CSFV-PCV2检测基因芯片特异性进行了评价,结果表明:PRV阴性对照和空白对照均没有杂交信号,而CSFV和PCV2杂交信号明显且肉眼可见,基因芯片特异性好;将所提取的重组质粒按10倍梯度稀释至10~(-8),运用PCR方法和芯片方法分别对不同梯度的重组质粒进行检测并进行对比,以评价芯片检测方法的敏感性,结果表明:芯片检测方法的敏感性均好于PCR方法;通过对现地疑似样品进行检测,以评价基因芯片的应用效果,结果表明:基因芯片应用效果较好,能进一步进行试验研究。
吕梁, 马文丽, 孙朝晖, 马晓冬, 郑文岭[10]2004年在《细小病毒B19 Oligo探针设计》文中进行了进一步梳理利用BLAST软件对细小病毒B19的序列进行序列比对,获得特异序列;利用生物学软件Oligo6.40设计特异性高、Tm值接近、长度均一的Oligo探针。结果获得了13条70bp的Oligo探针,用于芯片打印及细小病毒B19的检测。表明利用BLAST系统和生物学软件Oligo6.40设计细小病毒B19诊断芯片的探针是一种简便而有效的方法。
参考文献：
[1]. 细小病毒B19检测基因芯片的制备及初步研究[D]. 吕梁. 第一军医大学. 2004
[2]. 细小病毒B19与人博卡病毒的基因检测及基因特异性探针的初步研究[D]. 张学红. 第四军医大学. 2009
[3]. 细小病毒B19诊断芯片的初步研究[J]. 吕梁, 马文丽, 石嵘, 马晓冬, 孙朝晖. 生命科学研究. 2004
[4]. 伪狂犬病病毒、猪细小病毒和流行性乙型脑炎病毒检测基因芯片的构建及检测技术研究[D]. 张焕容. 四川农业大学. 2005
[5]. 水禽重要疫病的多重PCR与基因芯片检测技术研究[D]. 鲜思美. 四川农业大学. 2009
[6]. ADV分离株全基因序列测定及VP2抗原表位区的表达与应用[D]. 梁冬莹. 东北林业大学. 2007
[7]. 细小病毒B19诊断芯片探针的制备[J]. 吕梁, 马文丽, 孙朝晖, 马晓冬, 郑文岭. 广东医学. 2003
[8]. 九种发热伴出疹病原体基因芯片检测方法的建立[D]. 徐胜平. 安徽医科大学. 2017
[9]. 猪瘟病毒和猪2型圆环病毒基因芯片检测技术研究[D]. 张永涛. 河南农业大学. 2011
[10]. 细小病毒B19 Oligo探针设计[J]. 吕梁, 马文丽, 孙朝晖, 马晓冬, 郑文岭. 生物技术通讯. 2004
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