周明锐[1]2000年在《EGF抑制人脑胶质母细胞瘤BT325细胞生长的相关基因分离、克隆及其意义探讨》文中研究指明脑胶质瘤是危害人类健康的常见恶性肿瘤之一，在各种原发性中枢神经系统肿瘤中发病率最高。目前，胶质瘤特别是恶性胶质瘤的治疗还是一个非常棘手的问题。与正常胶质细胞相比，胶质瘤细胞中许多基因发生了结构和表达的改变，其中主要有癌基因的激活和抑癌基因的失活以及大量相关基因的表达变化。这些基因改变是胶质瘤恶性生物学行为的基础，但对此的了解还不是很清楚。体外培养的肿瘤细胞系的刺激、诱导常能提供有关肿瘤发生发展及药物、生物治疗的有用信息。分离、克隆胶质瘤发生发展和分化相关的cDNA，能够丰富人们对胶质瘤的分子机理认识，可以提供诊断、治疗的新线索，在理论和应用上具有重要的价值。 脑胶质瘤，特别是胶质母细胞瘤最常见而突出的分子特征为表皮生长因子受体(EGFR)的突变和(或)过表达，并与胶质瘤的恶性程度和生物学行为密切相关。为此，我们用其相应的配基EGF刺激诱导人脑胶质母细胞瘤BT325细胞，分析这一过程中所发生的基因表达谱变化；探寻胶质瘤发生发展的相关基因，以期发现可用作胶质瘤治疗的靶基因和(或)分期分型的分子标志。 分别给予每毫升0.1ng，1ng，10ng，100ng EGF刺激BT325细胞，发现并证实随着剂量的增大，BT325细胞生长增殖明显的抑制。EGF可抑制胶质瘤细胞生长这一现象，尚未引起人们的关注，文献中主要是EGF刺激胶质瘤细胞增殖和浸润的报道，但也仍未对其分子机制进行深入的研究。 应用新近发展的mRNA差异显示分析(DDRT-PCR)技术，分析BT325细胞生长抑制后的差异表达基因。进行不同的锚定引物和随机引物配对的DDRT-PCR反应，经变性聚丙烯酰胺长凝胶电泳，PCR产物的回收、扩增，分离了61个差异片段，大小介于200-500bp之间。为进一步鉴定分离出的片段所代表的基因的差异表达情况，把这些片段点膜制成cDNAarray，采用生长抑制组和对照组RNA反转录标记的cDNA第一条链的混合探针，分别同时对所得的差异片段进行反向Northern斑点杂交。根据斑点杂交的结果挑选出6个表达明显上调的差异表达片段进行克隆和测序。
周明锐, 任祖渊, 王欣, 黄秉仁, 苏长保[2]2002年在《EGF抑制BT325细胞生长的相关基因分离、克隆》文中进行了进一步梳理目的 寻找抑制胶质瘤细胞生长的新的相关基因。方法 应用mRNA差异显示技术与cDNAarray反向Northern杂交相结合 ,分离、克隆表皮生长因子 (EGF ,10 0ng/ml)作用后生长抑制的人脑多形性胶质母细胞瘤BT32 5细胞与对照组 (不加EGF)相比新表达或表达明显上调的基因。结果克隆了 6个BT32 5细胞生长抑制后表达明显增高的EST (expressedsequencetag) ,其中 1个为新基因序列 ,另 5个分别与CGI 5 1、转醛缩酶 (Transaldolase、TAL)、核糖蛋白L35a、 4 0s核糖相关蛋白基因及BC 2蛋白mRNA有不同程度的同源性 ,其中功能分析提示TAL表达增加可诱导细胞凋亡。 6个EST均投递GenBank ,分别获得了接受号 :AW4 0 884 4～ 4 0 884 8。结论 所分离、克隆的基因可能与胶质瘤的生长抑制有关。
李侠[3]2007年在《EphA2基因表达及其对人脑星形胶质细胞瘤生物学特性的影响》文中研究说明脑胶质细胞瘤是中枢神经系统最常见的原发肿瘤,其发生率约占全部颅内肿瘤的30%~50%;在脑胶质细胞瘤的不同组织分型中,以星形胶质细胞起源的肿瘤最为多见。根据WHO 2000年肿瘤病理分级标准,所有星形胶质细胞瘤分为四级(I级~IV级)。虽然少量的低级别星形胶质细胞瘤为良性肿瘤,但是绝大多数该类肿瘤为恶性肿瘤,常导致不良预后。以多形性胶质母细胞瘤(IV级)为例,即便是采用手术、化疗、放疗等综合治疗措施,患者的平均生存期往往不足1年。为了进一步改善恶性脑星形胶质细胞瘤的治疗效果,研究者一直试图发现新的具有诊断和/或治疗意义的生物标记分子,但是成效并不显著。由于一些受体型酪氨酸激酶(Receptor Tyrosine Kinase,RTK)在多种恶性肿瘤组织中显著高表达,其被认为是一类有价值的肿瘤候选生物标记分子。Eph受体家族是最大的RTK家族,目前关于Eph分子家族的研究多集中于探讨其在恶性肿瘤生物学行为及靶向治疗中的意义。EphA2为A型Eph分子家族的重要成员,广泛表达于多种上皮组织,已证实它在神经元发育、细胞侵袭-黏附调控等方面具有重要作用。此外,在多种非神经系统恶性肿瘤组织中也检测到了EphA2表达上调,这提示EphA2可能对于多种肿瘤的恶性进展具有重要的意义。就脑肿瘤而言,目前仅在高级别恶性星形胶质细胞瘤中发现EphA2表达上调,如多形性胶质母细胞瘤(Glioblastoma Multiforme,GBM)和间变性星形细胞瘤(Anaplastic Astrocytomas,AA)。然而,EphA2在低级别星形胶质细胞瘤中的表达特点目前还不清楚;EphA2是否能够成为新的、有价值的星形胶质细胞瘤生物标记分子尚有待进一步研究证实。本研究系统地检测了EphA2分子在脑星形胶质细胞瘤中的表达特征,揭示了EphA2表达与星形胶质细胞瘤病理分级、增殖和凋亡的关系。此外,本试验还初步探讨了EphA2分子诱导高表达和干涉表达对于星形胶质细胞瘤细胞体外增殖、侵袭、凋亡、FAK磷酸化以及裸鼠致瘤性的影响,为发现EphA2分子在脑星形胶质细胞瘤恶性进展中的作用提供了实验基础。本课题主要包括以下四方面研究:1. EphA2在人脑星形胶质细胞瘤中的表达及意义采用反转录聚合酶链反应(Reverse-transcription PCR,RT-PCR)检测EphA2 mRNA在4株人脑星形胶质瘤细胞系(U251、U87、BT325和SHG44)、90例人脑星形胶质细胞瘤组织和10例正常人脑组织中的表达水平。结果显示,EphA2 mRNA在U251、U87、SHG44细胞中均有表达;而BT325细胞未见EphA2 mRNA表达。90例人脑星形胶质细胞瘤标本中,共有43例(47.8%)表达EphA2 mRNA;10例正常人脑组织均未见EphA2 mRNA表达。EphA2 mRNA表达阳性率在人脑星形胶质细胞瘤及正常人脑组织之间存在显著差异(P<0.01)。EphA2 mRNA表达阳性率随肿瘤标本病理级别增高而增高(P<0.05)。EphA2 mRNA表达阳性率与患者性别、年龄、肿瘤大小及部位无关(P均>0.05)。采用免疫荧光法检测EphA2蛋白在4株人脑星形胶质瘤细胞系(U251、U87、BT325和SHG44)中的表达。结果显示,EphA2蛋白在U251、U87及SHG44细胞中均有高表达,在BT325细胞中未见表达。EphA2蛋白阳性染色多定位于细胞胞浆。分别采用免疫组化SABC法和凋亡原位检测法( Terminal Deoxynucleotidyl Transferase-mediated dUTP Nick End Labeling,TUNEL)检测90例人脑星形胶质细胞瘤组织、10例正常人脑组织中EphA2蛋白、Ki67蛋白表达以及细胞凋亡水平。结果显示,43.3% (39/90)肿瘤标本表达EphA2蛋白,而正常人脑组织未见EphA2蛋白表达。EphA2蛋白阳性染色定位于胞浆和/或胞膜;90例肿瘤组织EphA2蛋白免疫染色评分(Immunoreactivity Score,IRS)为2.90±3.89,与正常人脑组织有显著差异(P<0.01)。EphA2蛋白表达阳性率和EphA2 IRS在I~IV级肿瘤组织间差异显著(P<0.05);但二者均与患者性别、年龄、肿瘤大小及部位无显著相关性(P均>0.05)。所有肿瘤组织均有Ki67表达,其肿瘤细胞增殖指数(Proliferative Index,PI)范围为2.8%~90.3%,平均(30.42±24.91)%。随肿瘤病理级别增高,PI明显升高(P<0.01);EphA2蛋白阳性组和阴性组PI分别为(53.71±20.39)%和(12.61±6.45)%,二者间存在显著差异(P<0.01),且PI与EphA2 IRS呈显著正相关(P<0.01)。所有肿瘤组织均见凋亡细胞,凋亡指数(Apoptotic Index, AI)范围是0.2%~4.9%,平均为(1.42±0.99)%。随肿瘤病理级别增高,AI明显升高(P<0.01),EphA2蛋白阳性组和阴性组AI分别为(1.26±0.71)%和(1.55±1.16)%,二者之间虽然无显著差异(P>0.05),但AI与EphA2 IRS呈显著负相关(P<0.05)。本部分研究结果表明,EphA2 mRNA和蛋白在人脑星形胶质细胞瘤组织及细胞系中高表达,其表达水平随肿瘤病理分级增高而显著升高;此外,EphA2蛋白表达与肿瘤增殖成正相关、与肿瘤凋亡成负相关,提示EphA2可能是一个有价值的脑星形胶质细胞瘤生物标记分子。2. EphA2真核表达载体及RNAi载体转染星形胶质瘤细胞系的研究设计并合成包含EphA2 RNA干涉序列及其单碱基突变序列的两对互补寡核苷酸序列,构建干涉载体pSilencer-EphA2-SR及单碱基突变载体pSilencer-EphA2-mSR并酶切鉴定、测序。采用脂质体介导法将所构建载体及空载体pSilencer转染U251细胞,分别命名为U251-SR、U251-mSR和U251-P细胞。采用半定量RT-PCR和Western blot法检测瞬时转染后U251、U251-P、U251-SR和U251-mSR细胞中EphA2 mRNA和蛋白表达水平。结果显示,成功合成两对寡核苷酸序列并克隆入pSilencer载体中,重组克隆经双酶切鉴定和DNA序列分析证实与设计序列完全一致。RT-PCR检测显示,U251-SR细胞中EphA2 mRNA表达受到明显抑制,而U251-P和U251-mSR细胞中EphA2 mRNA表达水平较转染前无明显变化。Western blot检测显示,U251-SR细胞中EphA2蛋白表达受到明显抑制,而U251-P细胞和U251-mSR细胞中EphA2蛋白表达水平无明显改变。双酶切获赠EphA2真核表达载体pcDNA3.2-DEST-EphA2和空载体pcDNA3.2-DEST,琼脂糖凝胶电泳鉴定并测序分析。采用脂质体介导法将载体pcDNA3.2-DEST-EphA2及空载体pcDNA3.2-DEST分别转染BT325细胞,筛选稳定转染的细胞株并分别命名为BT325-E和BT325-P细胞。采用半定量RT-PCR和Western blot法检测EphA2 mRNA和蛋白在BT325、BT325-P和BT325-E细胞中的表达水平。电泳结果如预期,pcDNA3.2-DEST-EphA2质粒切出大约7200bp和1290bp左右的两个条带,而空质粒pcDNA3.2-DEST切出大约7100bp和630bp左右的两个条带。测序分析显示,质粒DNA序列与目的基因序列完全一致。RT-PCR检测显示,BT325-E细胞中EphA2 mRNA表达明显升高,而BT325-P和BT325细胞中均未检测到EphA2 mRNA表达。Western blot检测显示,BT325-E细胞中EphA2蛋白表达显著升高,而BT325-P和BT325细胞中均未检测到EphA2蛋白表达。本部分结果提示:成功构建EphA2 RNA干涉载体,将该载体和获赠EphA2真核表达载体分别转染星形胶质瘤细胞系后,可明显抑制或诱导EphA2 mRNA和蛋白表达,这为进一步探讨EphA2表达对于星形胶质瘤细胞生物学特性的影响提供了良好的细胞模型。3.诱导EphA2高表达或RNAi对人脑星形胶质瘤细胞体外增殖、凋亡、侵袭及FAK蛋白磷酸化的影响分别采用细胞计数法和克隆形成实验检测两组细胞(U251-SR、U251-P、U251和BT325-E、BT325-P、BT325)的体外增殖速率和活力。两组细胞生长曲线显示:U251-SR细胞增殖受到明显抑制,U251和U251-P细胞的增殖速率显著高于U251-SR(P<0.05);BT325-E细胞的增殖速率明显提高,显著高于BT325和BT325-P细胞(P<0.05)。克隆形成实验显示:U251、U251-P和U251-SR细胞的平均克隆数分别为(67.0±4.82)%、(63.8±4.51)%和(32.5±4.36)%,U251-SR细胞显著低于U251和U251-P细胞(P<0.01);BT325、BT325-P和BT325-E细胞的克隆数分别为(43.0±4.09)%、(42.2±3.06)%和(59.2±2.08)%,BT325-E细胞显著高于BT325和BT325-P细胞(P<0.01)。采用流式细胞仪测定两组细胞的细胞周期,观察G0/G1期、G2/M期、S期细胞所占百分比,以及是否存在凋亡峰。结果显示,与U251和U251-P细胞相比,U251-SR细胞中S期细胞明显减少,G2/M期细胞略有减少,G0/G1期细胞明显增加,并出现明显的凋亡峰;与BT325和BT325-P细胞相比,BT325-E细胞中S期细胞明显增加,G2/M期细胞略有增加,G0/G1期细胞明显减少。分别采用HE染色、Hoechst染色、透射电镜以及FCM(PI/Annexin V双染)检测两组细胞凋亡。HE染色显示,U251和U251-P细胞生长状态良好,罕见凋亡,而U251-SR细胞凋亡增多,表现为胞核固缩、深染;BT325、BT325-P、BT325-E细胞生长状态均良好,未见明显凋亡。Hoechst染色显示,U251、U251-P和U251-SR细胞核呈现深蓝色荧光,而U251-SR细胞可见较多胞核呈浅亮蓝色荧光着色,提示为凋亡表现;BT325、BT325-P、BT325-E细胞胞核呈均一的深蓝色荧光染色,未见明显凋亡。透射电镜显示U251-SR细胞凋亡增多,凋亡细胞表现出典型的超微结构特征,如细胞膜表面微绒毛消失、出泡,染色质浓集;在凋亡早期,染色质边集,核仁存在;晚期核仁消失,染色质断裂成块,并形成凋亡小体;而U251、U251-P、BT325、BT325-P、BT325-E细胞均未发现明显的凋亡超微结构改变。FCM分析显示,与U251(2.7%)和U251-P细胞(3.4%)相比,U251-SR细胞凋亡比率明显升高,达22.3%;较BT325(4.9%)和BT325-P(5.3%)细胞,BT325-E细胞(2.0%)的凋亡率明显降低。采用BD BioCoat? Matrigel?侵袭小室检测两组细胞的体外侵袭能力。结果显示,U251、U251-P和U251-SR细胞的侵袭率分别为(39.7±2.52)%、(38.3±2.08)%和(22.3±5.03)%,U251-SR细胞明显低于其它两种细胞(P<0.01);BT325、BT325-P和BT325-E细胞的侵袭率分别为(29.7±4.73)%、(29.3±2.52)%和(46.3±10.02)%,BT325-E细胞的侵袭率明显增加(P<0.01)。采用免疫共沉淀法检测两组细胞的FAK表达及磷酸化水平。结果显示:U251、U251-P和U251-SR细胞均有FAK表达,且表达水平一致,而U251-SR细胞的FAK磷酸化水平显著低于U251和U251-P细胞(P<0.01);BT325、BT325-P和BT325-E细胞中FAK表达水平一致;但是较BT325和BT325-P细胞而言,BT325-E细胞的FAK磷酸化水平显著升高(P<0.01)。上述研究结果提示,EphA2的高表达可能与脑星形胶质瘤细胞的体外增殖、侵袭和抗凋亡等恶性生物学特性密切相关,而FAK的磷酸化可能是EphA2诱导星形胶质细胞瘤恶性进展的重要分子机制。4.诱导EphA2高表达或RNAi对人脑星形胶质瘤细胞裸鼠体内成瘤、增殖以及凋亡的影响将定量的U251细胞(1.0×107/200μl)接种于裸鼠腹部外侧皮下,建立人脑胶质细胞瘤裸鼠皮下移植瘤模型。移植细胞15 d后,于移植瘤原位分别定量注射PBS(简写为U251-PBS组)、Lipofectamine 2000+无血清RPMI 1640培养基(简写为U251-Lipo-RPMI 1640组)、Lipofectamine 2000+pSilencer(简写为U251-Lipo-P组)或Lipofectamine 2000+pSilencer-EphA2-SR(简写为U251-Lipo-SR组),每周两次,继续观察肿瘤生长情况,测定肿瘤体积,绘制肿瘤生长曲线。接种细胞30 d后处死动物,称瘤重后取瘤组织行HE、EphA2/Ki67免疫组化以及TUNEL荧光染色,并计算AI和PI值。结果显示,与U251-PBS组、U251-Lipo-RPMI 1640组、U251-Lipo-P组相比,U251-Lipo-SR组裸鼠肿瘤生长明显缓慢。HE染色显示,U251-Lipo-SR组标本中凋亡细胞显著多于其他三组。EphA2免疫组化显示,U251-Lipo-SR组肿瘤组织中EphA2蛋白表达明显下调。四组肿瘤组织的PI值分别为(71.26±4.54)%、(70.58±5.68)%、(66.64±4.94)%、(40.62±4.39)%,U251-Lipo-SR组明显降低(P<0.01);AI值分别为(2.40±0.43)%、(2.22±0.76)%、(2.16±0.47)%、(11.78±1.56)%,U251-Lipo-SR组明显升高(P<0.01)。分别以BT325、BT325-P和BT325-E细胞建模,方法同上。定期观察肿瘤生长情况,测定肿瘤体积,绘制肿瘤生长曲线,观察30 d后处死动物,称瘤重后取瘤组织行HE、EphA2/Ki67免疫组化以及TUNEL染色,并计算AI和PI值。结果显示,与BT325、BT325-P组相比,BT325-E组裸鼠肿瘤形成时间短,肿瘤生长迅速。EphA2免疫组化染色显示,BT325-E组EphA2蛋白表达明显上调。BT325、BT325-P和BT325-E组肿瘤组织的PI值分别为(51.74±13.98)%、(48.10±13.21)%、(78.64±14.87)%,BT325-E组PI值明显高于另外两组(P<0.01);AI值分别为(3.58±0.61)%、(4.32±0.59)%、(1.78±0.33)%,BT325-E组AI值明显低于另外两组(P<0.01)。上述研究结果提示,转染EphA2 RNAi载体可明显抑制人脑胶质瘤细胞裸鼠移植瘤的生长,而诱导EphA2高表达可显著促进星形胶质瘤细胞裸鼠移植瘤的生长;这不仅进一步证实了EphA2分子在脑星形胶质细胞瘤恶性进展中的作用,还为脑恶性星形胶质细胞瘤的基因治疗提供了新的策略。综上所述,我们认为EphA2高表达可能与人脑星形胶质细胞瘤的过度增殖、侵袭和抗凋亡等恶性生物学特性密切相关,EphA2不仅是有价值的脑星形胶质细胞瘤生物标志分子,还有望成为恶性脑星形胶质细胞瘤基因治疗的候选靶点。
王江[4]2012年在《NOK基因在人脑胶质细胞瘤增殖和侵袭中的作用及其机制研究》文中指出脑胶质细胞瘤是中枢神经系统最常见的恶性肿瘤，其发生率约占全部颅内肿瘤的40%；目前尽管脑胶质细胞瘤的治疗方法在不断地改善和提高，但其治疗仍然没有显著提高，而且患者预后较差，平均生存期还不到一年。治疗困难的主要原因在于脑胶质细胞瘤的恶性生物学特性；因此，为了进一步改善脑胶质细胞瘤的治疗效果，寻找和研究在脑胶质细胞瘤的恶性进展中发挥重要作用的相关分子具有重要的科学意义和临床应用价值。NOK（Novel Oncogene with Kinase-domain）基因是2004年从人扁桃体癌中克隆的一个新的癌基因（基因登录号为Genebank AAT01226），属于受体型酪氨酸蛋白激酶家族的一员。NOK基因组全长2.79kb，位于染色体12q13.2，mRNA全长1269bp，能够编码422个氨基酸，分子量约为47.6kD的蛋白质。NOK基因广泛高表达于多种肿瘤细胞和肿瘤组织，如肺癌（A549）、乳腺癌（MDA-MB-231）、急性髓系白血病（HL-60、U937和K562）、卵巢癌（HS832、OvCar3和CaOv3）和前列腺癌（LNCaP）等；这些都预示着NOK蛋白可能对肿瘤生成有一定的调控作用。但是目前尚未有关NOK基因与脑胶质细胞瘤相关性研究的报道。NOK分子能否成为有价值的脑胶质细胞瘤治疗的新靶点需要进一步的研究证实。本课题系统地研究了NOK分子在脑胶质细胞瘤中的表达特征，揭示了NOK分子在脑胶质细胞瘤中的表达特征及其与肿瘤病理分级的关系；本研究还初步探讨了NOK分子在不同表达水平下对于脑胶质瘤细胞体外增殖、侵袭、凋亡以及裸鼠致瘤性的影响，这些都有助于揭示NOK分子在脑胶质细胞瘤恶性进展中所发挥的作用。本课题主要包括以下四方面研究：1. NOK在人脑胶质细胞瘤中的表达及意义本研究首先从mRNA和蛋白水平研究了NOK分子在83例人脑胶质细胞瘤组织、10例正常人脑组织以及3株人脑星形胶质瘤细胞系（U251、BT325和U87）中的表达。反转录聚合酶链反应（Reverse-transcription PCR，RT-PCR）和Western blot研究结果发现，NOK mRNA和蛋白在U251和U87细胞中表达水平均较高，而BT325细胞中NOK mRNA和蛋白表达较低；在10例正常人脑组织中，只有1例检测到NOK mRNA和蛋白表达，其余9例均未见NOK的表达；而NOK mRNA和蛋白在不同病理级别的神经胶质瘤中均有表达，并且其表达强度随着临床病理级别的增高，NOK的表达有增高的趋势。本研究进一步采用免疫组织化学法检测了NOK蛋白在人脑胶质细胞瘤组织和正常脑组织中的表达。结果提示：NOK蛋白阳性染色定位于胞浆和/或胞膜；在83例人脑胶质细胞瘤标本中，57例标本表达检测到NOK表达，表达阳性率为68.7%，而10例正常人脑组织中只有1例表达。在人脑胶质细胞瘤及正常人脑组织中，NOK蛋白阳性表达率存在显著差异（P<0.01）。并且，NOK蛋白表达阳性率随着临床病理级别的增高而显著升高，在I~IV级肿瘤组织间差异显著（P<0.05）；但是其与患者性别、年龄、肿瘤大小及肿瘤的发生部位无关（P均>0.05）。本部分研究结果表明，NOK mRNA和蛋白在脑胶质细胞瘤组织和部分细胞系中高表达，其表达强度随着脑胶质细胞瘤病理级别的升高而增高。2. NOK慢病毒表达载体及慢病毒干涉载体转染人脑胶质瘤细胞系的研究根据NOK的cDNA全长特点，设计了PCR引物，成功的从获赠真核表达载体pcDNA3.1-NOK中获得了NOK的cDNA全长，将其克隆入Gateway系统中入门克隆载体pENTR/3C中，重组体pENTR/3C-NOK酶切、PCR和测序鉴定；然后利用重组反应（Gateway LR Clonase Reaction），将pENTR/3C-NOK重组体中的NOK全长导入慢病毒载体pLenti-6.3/V5中，重组体pLenti-6.3/V5-NOK酶切、PCR鉴定和测序；pLenti-6.3/V5-NOK和对照质粒pLenti-6.3/V5-cherry分别与辅助质粒psPAX2, pMD2.G，按照4：3：1的比例混合，分别转染293T细胞进行病毒包装。慢病毒感染BT325细胞，Blasticidin抗性筛选出稳定细胞株分别命名为BT325-NOK和BT325-cherry细胞，RT-PCR和Western blot法检测稳定细胞株中NOK mRNA和蛋白表达水平，结果显示：与BT325-cherry细胞相比，BT325-NOK细胞中的NOKmRNA和蛋白表达水平显著升高。将购买两个NOK慢病毒干涉载体（pLKO.1-NOK-1和pLKO.1-NOK-2）及对照载体scramble分别与辅助质粒psPAX2, pMD2.G，按照4：3：1的比例混合，分别转染293T细胞进行病毒包装。慢病毒感染U251细胞，嘌呤霉素抗性筛选出稳定细胞株分别命名为U251-sh1、U251-sh2和U251-control细胞，RT-PCR和Western blot法检测稳定细胞株中NOK mRNA和蛋白表达水平，结果显示：与U251-control细胞相比，U251-sh1和U251-sh2细胞中的NOK mRNA和蛋白表达水平均受到明显抑制。本部分结果提示：成功构建含有NOK全长的慢病毒表达载体，将该载体和NOK慢病毒干涉载体分别进行病毒包装，分别感染脑胶质瘤细胞系，成功的建立了上调或抑制NOK mRNA和蛋白表达的稳转细胞系，为下一步研究NOK分子在调控脑胶质瘤细胞生物学特性中的作用提供了良好的细胞模型。3.上调或抑制NOK基因的表达对人脑胶质瘤细胞生物学特性的影响本部分针对已经建立的两组稳转细胞系（U251-sh1、U251-sh2、U251-control和BT325-NOK、BT325-cherry）进行实验研究。首先观察了NOK基因对胶质瘤细胞增殖和细胞周期的影响；MTT绘制生长曲线显示：与U251-control细胞相比，U251-sh1和U251-sh2细胞生长、增殖均受到明显抑制（P<0.05）；BT325-NOK细胞的增殖明显增快，显著高于BT325-cherry细胞（P<0.01）。平板克隆形成实验和软琼脂集落形成实验用来测定细胞克隆形成数量，结果发现：U251-sh1和U251-sh2细胞增殖数和克隆形成数均明显低于其对照组（P<0.01）；BT325-NOK细胞增殖数和克隆形成数则显著高于其对照组（P<0.01）。流式细胞术检测细胞周期结果显示发现：与U251-control细胞相比，U251-sh1和U251-sh2两组细胞的G1期细胞均明显增加（P<0.01），G2/M期细胞均明显减少（P<0.01），发生了G1期阻滞；与对照组BT325-cherry细胞相比，BT325-NOK细胞的G0/G1期细胞明显减少（P<0.01），S期细胞显著增多（P<0.01），G2/M期细胞略有增多。其次我们运用划痕实验和Transwell侵袭小室法观察了NOK基因对胶质瘤细胞迁移和侵袭的影响；结果发现：U251-sh1和U251-sh2两组细胞的迁移能力均明显低于其对照组（P<0.01），而且在Transwell实验中，U251-sh1和U251-sh2两组细胞穿过Matrigel的细胞数也均明显低于其对照组（P<0.01）；与BT325-cherry细胞相比，BT325-NOK细胞的迁移和侵袭能力均明显增加（P<0.01）。本部分研究结果表明，NOK基因可能在调控人脑胶质瘤细胞的体外增殖和侵袭等恶性生物学特性中发挥重要作用。4. NOK基因RNAi对人脑胶质瘤细胞裸鼠体内成瘤、增殖以及侵袭的影响本部分研究U251-control、U251-sh1和U251-sh2三种细胞分别接种于裸鼠背部皮下，定期测量肿瘤体积，绘制肿瘤生长曲线，观察其在裸鼠体内的成瘤性。共观察了30天。Western blot方法检测移植瘤组织中NOK蛋白的表达情况。实验结果发现：U251-sh1和U251-sh2两组细胞在裸鼠体内的成瘤能力和生长速度均明显低于其对照组（P<0.01），肿瘤体积和重量也均明显低于其对照组（P<0.01）；结果显示与U251-control组相比，U251-sh1和U251-sh2组的肿瘤中NOK蛋白表达均明显抑制（P<0.01），而U251-sh1和U251-sh2组之间的NOK蛋白表达水平无明显变化（P>0.05）。研究结果进一步证实了下调NOK基因的表达可以抑制脑胶质瘤细胞的体内增殖和侵袭能力。综上所述，我们认为NOK分子可能在人脑胶质瘤的发生与发展中起着重要的促进作用，不仅是一个有价值的人脑胶质细胞瘤生物标记分子，同时NOK分子也可能是人脑胶质瘤基因治疗的一个潜在候选靶点。
王和平[5]2006年在《EGFR信号通路对胶质瘤生物学行为影响的实验研究》文中研究说明第一部分:EGFR信号通路对人胶质瘤细胞系GL15增殖的调控作用目的探讨EGFR信号通路对于人胶质瘤细胞系GL-15细胞增殖及PCNA表达的影响。方法应用细胞培养技术培养GL15细胞,免疫组化法检测胶质纤维酸性蛋白(Glial fibrillary acidic protein, GFAP)、EGFR表达情况,细胞计数法检测不同浓度的EGF对于胶质瘤细胞增殖的影响,分别运用免疫组化法和流式细胞仪检测不同浓度EGF作用后PCNA表达情况。结果GFAP在GL15细胞呈散在表达,EGFR明显的高表达;剂量小于等于1ng/ml的EGF对于胶质瘤细胞有促增殖作用,与对照组相比,细胞数目明显增加,EGF作用后细胞核PCNA的表达明显增加;而10ng/ml、100ng/ml的EGF对于胶质瘤细胞生长有明显的抑制作用,PCNA的表达明显减少。结论GL15细胞为典型的胶质母细胞瘤,EGFR信号通路对于胶质瘤细胞的生长影响具有双相调控作用,小剂量EGF可促进细胞增生,大剂量EGF可抑制细胞生长。第二部分:EGFR信号通路对胶质瘤细胞系GL15增殖双相调控的分子机制目的探讨EGFR信号通路对于人胶质瘤细胞系GL-15细胞细胞周期及及细胞内钙信号的影响。方法以不同浓度的EGF处理GL15细胞,流式细胞仪检测细胞周期及凋亡率的改变,激光扫描共聚焦显微镜(laser scan confocal microscope, LSCM)检测EGF对于细胞内游离钙离子浓度的影响。结果0.1ng/ml、1ng/mlEGF作用后,与对照组相比,G0/G1期细胞比例明显下降,S期比例增加,10ng/ml、100ng/mlEGF作用以后均出现明显的亚G1峰,细胞凋亡率明显升高,EGF可明显诱导细胞内游离钙离子浓度的增加,但大剂量EGF组诱导的细胞内钙升高的辐度明显高于小剂量组。结论小剂量的EGF有促进肿瘤细胞由静止期转入DNA合成期的作用,大剂量EGF能诱导细胞凋亡并导致细胞的增殖受抑制,EGFR信号通路的差异性调控可能与细胞内钙信号的差异有关。第三部分:转染LRIG1基因对于胶质瘤细胞增殖及细胞内钙信号的影响目的探讨LRIG1基因对于胶质瘤细胞系GL15增殖及EGFR信号通路的影响,为胶质瘤发生机制的研究和基因治疗提供理论依据。方法采用基因转染技术,将LRIG1-EGFP真核表达载体转染到GL15细胞系中,了解其对细胞增殖能力及细胞周期的影响,应用共聚焦显微镜检测转染后对EGF引起的细胞内钙信号的变化情况。结果转染LRIG1基因能抑制EGF引起的细胞生长,对细胞周期分析表明,处在G0/G1期的细胞由47.13%±1.79增加到62.42%±2.18,细胞内钙离子浓度检测表明转染后EGF引起细胞内钙离子浓度升高的辐度明显下降。结论LRIG1蛋白能抑制0.1ng/mlEGF刺激生长作用,其作用机制可能与抑制蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)途径从而降低了细胞钙离子浓度升高有关,导入LRIG1基因是一种潜在治疗胶质瘤的新途径。
惠宏襄[6]1993年在《逆转录病毒载体表达的TGFα反义RNA对人脑胶质瘤细胞BT325的生长抑制和诱导分化作用》文中研究指明转化生化因子α(TGFα)是一种小肽分子，正常细胞较少产生，而在许多肿瘤组织(肾癌，黑色素瘤等)却大量合成。TGFα与细胞表面的表皮生长因子受体(EGFR)结合，以自分泌方式参与肿瘤的形成和生长，具有重要的肿瘤诊断、预后及疗效评估意义。胶质瘤是临床常见的肿瘤之一，其死亡率极高。有关胶质瘤中TGFα状况的文献报道较少且互有出入。采用分子生物学方法研究胶质瘤中TGFα及相关基因的改变并予以纠正具有重要的理论和临床意义。 为开展此项工作，我们函索到phTGF-1-10-925质粒，其载体部分为pBR327，在EcoRI位点处插有925bp的TGFα cDNA片段。为鉴定此质粒，先用EcoRI及EcoRIPstl进行酶切图谱分析，此外，我们合成了一对针对TGFα第四外显子的引物，以该质粒为模板进行PCR，并对PCR片段进行DNA序列分析。结果表明所扩增片段确系TGFα第四外显子。 我们以phTGFα-1-10-925和c-myc质粒探针，检测了两株瘤细胞系(BT325，SHG44)及数例临床脑胶质瘤标本中TGFα和c-myc基因的变化。Southern杂交表明TGFα基因无扩增，但两株细胞系及4／6病例有TGFα基因的高表达，正常脑组织无表达。本文还以建立的定量差异PCR技术(靶基因为TGFα第四外显子，参比基因为ras第一外显子)考察了胶瘤中TGFα基因的拷贝数，其结果与Southern杂交相同。c-myc基因检测表明各种胶质瘤中有不同程度的c-myc基因扩增和重排，同时伴有c-myc基因的高表达。TGFα和c-myc的高表达具有平行性。 我们采用化学合成方法合成了TGFαN末端七肽小分子(Val-Val-Ser-His-Phe-Asn-Asp)，并以EDC为交联剂将其与BSA偶联后免疫兔子制备出TGFα抗体。该抗体抗同一抗原决定簇，与EGF无交叉反应，且具有抑制BT325细胞生长的活性。
佚名[7]2002年在《作者索引》文中指出(按汉语拼音字母顺序排列,索引论文前3位作者)AAdrian W Gelb Development 0f anaesthesiology (15):1 345一1346艾玉峰应用带蒂皮瓣、肌皮瓣修复小腿骨外露、骨髓炎创面 (2):183 组织工程骨复合骨
郭庆东[8]2002年在《脑胶质瘤患者抗胶质瘤抗体的检测和筛选》文中进行了进一步梳理胶质细胞瘤是常见的脑肿瘤，虽经采用手术、放疗、化疗及基因治疗等疗法，但预后仍较差。综合疗法是未来肿瘤治疗的发展方向。免疫和生物治疗作为综合治疗的一个重要组成部分，近年来得到医学界的广泛重视，特别是抗体介导的免疫治疗更成为目前肿瘤治疗研究的热点之一。而抗体介导的免疫治疗的关键是靶抗原的特异性强，抗体的免疫原性低及亲和力高等。随着基因工程抗体研究取得的进展，相继出现了嵌合抗体，人源化抗体，小分子抗体，双功能抗体及双特异性抗体等，这些抗体携带的化疗药物、毒素和放射性核素治疗取得了一定的治疗效果，这有力地促进了脑胶质瘤抗体的研究。 目前脑胶质瘤抗体都是经过基因工程改造的鼠源性抗体，鼠免疫源性和低亲和力是脑胶质瘤抗体导向治疗中存在的主要问题，因此迫切需要获得人源性抗脑胶质瘤抗体。采用杂交瘤技术制备人源性单克隆抗体存在许多困难，90年代初期出现了抗体库技术，为抗体的制备提供了新的途径。为了构建人源性抗脑胶质瘤抗体库，我们必须先从患者的血液内检测到抗脑胶质瘤抗体，才能为建立人源性噬菌体抗体库奠定基础。 第四军医大学硕士学位论文 一 本研究应用免疫组化技术，对52例胶质瘤患者的血清进行分离 纯化后，与52例胶质瘤患者自身的瘤体标本及不同部位的肿瘤（包 括胃癌、子宫内膜癌、乳腺癌、肝癌、甲状腺癌、横结肠癌和垂体瘤 各6例）施行免疫组化染色，进行比较研究。并采用酶联免疫吸附试 验，用原代培养的正常胶质细胞、胶质瘤细胞以及胶质瘤细胞系对这 52例胶质瘤患者进行检测和筛选。从而证明脑胶质瘤患者血液内有抗 脑胶质瘤抗体的存在，有助于认识和阐明人体对脑胶质瘤的免疫机 制。 结果表明：1．用分离纯化的52份血清对其自身的胶质瘤手术标 本进行染色，有3例呈阳性结果。而所采用的其余部位的肿瘤标本中 无阳性表达。2．对于有阳性抗体的血清再次与其余49例标本进行染 色，发现阳性例数增多（7例）。3．对于阳性的标本进行分析表明， 阳性结果在低度恶性（WHO—11级）组与高度恶性（WHOlll—IV） 组间有显著差异（P＜0．05），并只出现于低度恶性的标本中。4．从酶 联免疫吸附试验（ELISA）的结果来看，它们的阳性反应基本相同。 本研究提示，在部分脑胶质瘤患者体内可检测到抗脑胶质瘤抗 体，并主要出现在低度恶性的胶质瘤患者中。通过对脑胶质瘤抗体的 检测，可澄清人体对胶质瘤的免疫特点，为建立噬菌体抗体库奠定了 基础，并为脑胶质瘤的免疫治疗提供了新思路。
参考文献：
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