祝行琴
（浙江大学医学院附属第二医院 浙江 杭州 310008）
【摘要】ALK基因重排是晚期非小细胞肺癌的驱动基因之一，携带ALK重排的非小细胞肺癌患者可以从靶向ALK激酶的酪氨酸激酶抑制剂中获益，因此NCCN指南推荐NSCLC常规进行ALK基因检测以筛选靶向药物获益人群。传统的ALK基因重排检测是通过组织活检提取RNA逆转录后完成检测，然而存在部分晚期非小细胞肺癌患者无法进行组织活检，因此基于血液标本的液体活检技术给这类患者带来了新的希望，但血液ALK重排检测相对于EGFR基因检测难度更大，本文对现阶段血液ALK基因重排的检测技术进行综述，以促进晚期NSCLC患者ALK重排检测的普及。
【关键词】ALK重排；液体活检；非小细胞肺癌
【中图分类号】R734.2 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2018）20-0013-02
肺癌是我国发病率和死亡率最高的恶性肿瘤，大多患者确诊时已属晚期，丧失了手术治疗的机会，因此放化疗和靶向治疗是晚期非小细胞肺癌治疗的主要方式。EML4-ALK基因重排是非小细胞肺癌靶向治疗的有效靶点之一，约5%患者携带有EML4-ALK基因重排，特别是非吸烟患者，突变率可达17%，该类患者可以从靶向ALK激酶的酪氨酸激酶抑制剂中获益 [1,2]。目前，常规的EML4-ALK基因重排的检测方法是基于 组织标本的免疫组化法、荧光原位杂交法、rt-PCR法以及高通量测序法[3,4]。然而存在部分晚期非小细胞肺癌患者无法进行组织活检，因此基于血液标本的液体活检技术给这类患者带来了新的希望，但血液ALK重排检测相对于EGFR基因检测难度更大。下文对现阶段血液ALK基因重排的检测技术进行综述，以促进晚期NSCLC患者ALK重排检测的普及。
1.循环肿瘤细胞技术检测ALK基因重排
近年来，研究表明循环肿瘤细胞也能用于EML4-ALK重排检测，并且多个研究结果显示，循环肿瘤细胞中EML4-ALK重排的检测结果与组织活检标本中的检测结果具有较高的符合率[5,6]。2012年，Hofman, V.等人使用ISET技术（Isolation by size of epithelial tumour cell），根据循环肿瘤细胞直径比正常血液细胞大的特征，使用特定尺寸的微孔滤膜将循环肿瘤细胞与血液细胞分离，直径较大的循环肿瘤细胞留在滤膜上。微孔滤膜过滤技术的优势在于分离出的循环肿瘤细胞可以同时被用于下游的细胞形态学研究，因此可以通过一定的形态学判读标准将分离出来的细胞进行更精准地分类[7]，此外，这种技术捕获的循环肿瘤细胞也能用于下游免疫细胞化学或荧光原位杂交检测。但是，这种方法的缺点在于很多患者常常仅能分离出不到100个循环肿瘤细胞，这就限制了判读的阳性阈值。
2.血浆RNA检测ALK重排
血浆循环游离DNA已经较常规地被用于晚期非小细胞肺癌患者EGFR基因的突变检测，然而血浆游离RNA却并未被常规用于EML4-ALK重排的检测，究其原因主要在于血浆RNA在抽血采样后降解非常迅速，临床上很难控制采血后能否及时地进行血浆RNA的分离和检测，此外，血浆RNA中EML4-ALK的含量也较低，RT-PCR的最低检测限也很难满足常规的EML4-ALK检测，因此限制了血浆RNA的临床应用。
3.血小板检测ALK重排
近年来多个研究发现血小板的微囊泡结构可以较好地将肿瘤RNA进行隔离保护[8,9]。肿瘤来源的血小板可以被用于富集肿瘤RNA进行EML4-ALK重排的检测。有研究显示血小板检测EML4-ALK比血浆RNA检测具有更高的特异性和敏感性，并且，在克唑替尼治疗的患者中血小板EML4-ALK的存在预示着肿瘤的进展与不良的预后[10]，此外，血小板中EML4-ALK的再现是克唑替尼耐药的一个标志，这种现象往往比影像学的进展提早了几个月的时间。
4.二代测序技术检测ALK重排
在晚期肺癌中，除了ALK重排外，其他基因重排例如ROS1、RET、NTRK等也同样被发现与靶向治疗相关，总体的突变率约为1-2%左右。因此，二代测序技术近年来被不断地开发用于同时从血浆游离DNA中检测这些基因组的异常[11,12]。基于杂交捕获建库，二代测序技术能同时检测到基因重排、点突变、插入缺失、拷贝数变异等，但目前为止在血浆游离核酸标本中该技术检测ALK基因重排的敏感性相对于组织标本来说还较低，在常规应用于临床之前还需要进一步的技术改进。
5.液体活检检测ALK重排的优缺点
与EGFR液体活检检测优缺点相似，ALK基因重排液体活检具有下列优势：（1）液体活检为非侵入性的检测，具有无创或微创的特点，因此可以进行重复检测，可以作为组织活检的有效补充。例如当患者无法进行活检手术或活检组织不适合进行基因检测时（肿瘤细胞太少、非正常福尔马林固定、组织大面积坏死等）可以首先进行液体活检检测；（2）监测靶向治疗疗效与肿瘤进展。液体活检在靶向治疗疗效监测中的应用相对于组织活检具有较显著的优势。晚期肺癌患者可以在不同时间点进行多次液体活检，以反映克唑替尼靶向治疗后疾病的进展情况。值得一提的是液体活检技术可以在影像学进展之前数月检测到耐药突变的产生，可以为临床治疗方案的调整提供依据。然而，ALK重排的液体活检也存在不少的问题有待解决。首先是ALK重排的液体活检技术目前还不是临床的常规应用技术，因此其重复性较大程度依赖于实验操作的熟练度。其次，循环肿瘤细胞的捕获技术也还未在临床普遍开展，因此并非每个医疗机构都能采用该技术。此外，上述技术对临床外周血采样后的血浆、血小板分离时效性要求较高，不合理的管理和操作均会显著影响ALK重排的检测结果。最后不能忽视的一个问题是患者个体间无论是循环肿瘤细胞还是游离核酸差异非常大，这取决于患者的肿瘤生物学特性，甚至在部分已经发生远处转移的患者中依然仅存在极少量的循环肿瘤细胞或游离肿瘤核酸，并且，对于二代测序技术来说，一管10毫升的外周血中所分离到的循环肿瘤DNA往往不足以进行一次检测。
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6.总结与展望
液体活检技术可以检测ALK基因重排，包括循环肿瘤细胞、血浆和血小板，都具有较高的特异性，但敏感性差异较大，综合应用上述液体活检技术将有助于提高ALK重排的检出率。液体活检检测ALK重排的优势与EGFR基因突变的液体活检类似，具备以下主要优势：（1）在无法获取活检组织时可以一定程度补充ALK基因重排的信息；（2）可以用于ALK基因耐药突变的早期监测；（3）可以用于靶向治疗的疗效监测。综上所述，目前液体活检最大的挑战在于如何提高检测的敏感性以及如何优化二代测序技术用于全面地检测EGFR突变、ALK融合、ROS1融合、RET融合、NTKR融合等以及其他相关基因例如BRAF、HER2、Met等突变并且评估微卫星稳定性。这需要提高标本的管理响应水平以及提高现有技术的敏感性。
【参考文献】
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论文作者:祝行琴
论文发表刊物:《医药前沿》2018年8月第20期
论文发表时间:2018/7/27
标签：细胞论文; 基因论文; 肿瘤论文; 液体论文; 血浆论文; 患者论文; 靶向论文; 《医药前沿》2018年8月第20期论文;