1.包头医学院第一附属医院神经外科 内蒙古 包头 014030；2.包头医学院 内蒙古 包头 014030
【摘 要】目的 观察MC3T3-E1细胞在体外诱导条件下成骨分化的特征及碱性磷酸酶（ALP）的表达情况。方法 将MC3T3-E1细胞于六孔板中培养，将含诱导剂（β-GP和抗坏血酸）的MEM-α培养基作为实验组，不含诱导剂的MEM-α培养基作为对照组，两组于第14天、21天是分别行茜素红染色，光学显微镜下观察细胞矿化情况；每隔两天换液一次并收集上清液进行碱性磷酸酶（AIP）活性检测。结果 培养第14天时两组均无矿化结节形成，第21天时实验组细胞出现明显矿化结节，对照组仍不明显；两组碱性磷酸酶（ALP）活性都于15天前呈上升趋势，其后呈下降趋势，实验组细胞活性明显高于对照组（p＜0.05）。结论 实验组细胞培养过程中矿化程度和碱性磷酸酶（ALP）活性都明显高于对照组细胞。
【中图分类号】R329.2【文献标识码】A【文章编号】2096-0867（2016）09-234-02
骨组织的生理过程包括骨的形成和骨的吸收，其中成骨细胞参与骨细胞形成、分泌和矿化等一系列过程[1]。
MC3T3-E1细胞系来源于小鼠锁骨细胞，是作为体外研究成骨细胞模型的常用细胞[2]。本实验通过利用含诱导剂（β-GP和抗坏血酸）的培养基和无诱导剂培养基分别培养 MC3T3-E1细胞，观察两组细胞在不同时间的矿化和细胞活性情况。
1材料和方法
1.1材料和仪器
MC3T3-E1细胞（协和医科大学，中国），MEM-α培养基（gibco，美国），胎牛血清（四季青，中国），青链霉素（gibco，美国）二氧化碳培养箱（Thermo，美国），β-甘油磷酸钠和抗坏血酸（华迈科，中国），茜素红染色液（leagene，中国），碱性磷酸酶试剂盒（碧云天，中国）。
1.2细胞培养
将MC3T3-E1细胞接种于含MEM-α培养基（10%胎牛血清，1%青链霉素）的培养瓶内，放置于二氧化碳培养箱（37℃，5%CO2，潮湿）培养，每三天更换一次培养液，待细胞铺满瓶底的80%以上时，可用胰蛋白酶消化，进行传代、冻存或用于后续实验。
将MC3T3-E1细胞按照每孔1.2×105个细胞数接种于六孔板内，实验组加含诱导剂（50 μg/m L 抗坏血酸和 10 mmol/L β-甘油磷酸钠）的培养液，对照组用常规培养液分别进行培养，每三天更换一次培养液。
1.3茜素红染色
细胞培养至第14天、21天时分别行茜素红染色，弃去培养液，PBS冲洗细胞三次，4%多聚甲醛室温固定10分钟，每孔加入1ml 1%茜素红染色液染色30min，弃掉染色液，双蒸水洗涤4次，每次5min，留置少量蒸馏水于孔板内，显微镜下观察，矿化结节呈亮红色[3]。
1.4碱性磷酸酶（ALP）活性检测
收集细胞培养过程中第3、6、9、12、15、18、21天的细胞培养液用于碱性磷酸酶（ALP）活性检测，具体步骤详见试剂盒说明书。
1.5统计学分析
每组实验重复三次，重复性好，所用数据为重复试验结果之一。数据结果采用SPSS17.0软件进行统计学分析。
2结果
2.1 每组细胞在第14、21天生长情况如图所示，第14天时两组细胞均未有明显矿化结节想成，第21天时，实验组出现明显矿化结节，对照组矿化仍不明显。
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成对样本t检验，t=3.709，p=0.010<0.05。实验组与对照组差异具有统计学意义
3讨论
MC3T3-E1细胞已被广泛的应用于体外矿化过程的研究，在条件培养基（MEM-α培养液含10%胎牛血清、1%青链霉素、50 μg/ml抗坏血酸和10mmol/L β-GP）中培养具有体外增殖、分化及矿化能力，在矿化期（16-30天）随着培养时间的延长，矿化结节的大小和数量逐渐增多。碱性磷酸酶（ALP）是成骨细胞所分泌的一种酶蛋白，其在细胞中表达的多少能合理地反映出骨细胞的分化程度和功能状态。在体外成骨诱导条件下，细胞在增殖过程中ALP活性会逐渐增高，当细胞进入矿化期时则活性降低。
在本实验周期内，两组细胞培养至第14天、21天分别行茜素红染色，镜下可见第14天时，两组细胞呈均无矿化结节形成，第21天时，实验组细胞出现明显的矿化结节，对照组无矿化结节形成。两组中ALP的活性变化均是先增高再降低的变化趋势，但实验组细胞较对照组活性增高明显（p＜0.05）。
综上所述，本实验成功完成了体外诱导MC3T3-E1细胞的矿化过程。
参考文献：
[1]Gideon A.Rodan. Introduction to bone biology [J]. Bone，1992，13（1）：S3-S6
[2]Quarles LD.Yohay DA.Wenstrup RJ.et al.Distinct proliferative and differentiated stages of murine MC3T3-E1 cells in culture：an in vitro model of osteoblast development[J].Bone Miner Res.1992.7（6）：683-692.
[3]Fu H，Zhang XL，Xiao Y，et al. Evaluation of gefitinib plus radiotherapy in non-small-cell lung cancer patients with brain metastases[J]. National Medical Journal of China，2012，92（8）：524-527
基金项目：国家自然科学基金项目（81360164）
论文作者:崔阳1, 白丽云 2,李鲁1,张春阳
论文发表刊物:《系统医学》2016年第2卷第9期
论文发表时间:2016/8/20
标签：细胞论文; 实验组论文; 矿化论文; 磷酸酶论文; 培养液论文; 茜素论文; 活性论文; 《系统医学》2016年第2卷第9期论文;