蒋电明, 赵波[1]2005年在《不同时段异体神经片段皮下包埋对神经再生影响的实验研究》文中提出目的探讨异体神经片段经皮下包埋不同时段,对神经再生的影响。方法Wistar大鼠55只,雌雄不限,随机分为5组。A、B组(实验组)和D组(对照组)每组各10只鼠,E组(供体组)15只鼠。A、B、C组大鼠在左后肢皮下包埋异体神经片段(15mm),1、2和3周后取出,修剪为长10mm片段并移植于右侧新鲜坐骨神经缺损处(10mm)。D组大鼠行右侧坐骨神经10mm原位吻合。术后2、4、6、8、10和12周监测坐骨神经功能指数(sciatic functional index,SFI),术后12周行电生理、光镜、电镜检查。结果术后各组SFI逐渐下降,12周A组和D组的SFI最小,两组间无明显差别,与B组和C组比较差异有明显统计学意义(p<0.05)。术后12周A组和D组再生大量有髓神经纤维及少量无髓神经纤维,再生神经的数量和结构与原神经相似,图像分析结果两组间无明显差别,与B组和C组比较差异有明显的统计学意义(p<0.05)。A组和D组的运动神经传导速度及潜伏期结果无明显差别,优于B组和C组,差异有明显统计学意义(p<0.05)。结论异体神经皮下包埋后有促进神经再生的作用,皮下包埋1周组再生作用最强。
赵波[2]2004年在《不同时段异体神经片段皮下包埋对神经再生影响的实验研究》文中研究表明目的 探讨异体神经片段经皮下包埋不同时段后对神经再生的影响。方法 Wistar大鼠55只，雌雄不限，随机分为5组。A、B、C组（实验组）和D组（对照组）每组各10只鼠， E组（供体组）15只鼠。A、B、C组大鼠在左后肢皮下包埋异体神经片段（15mm），1、2、3周后取出，修剪为长10mm片段并移植于右侧新鲜坐骨神经缺损处（10mm）。D组大鼠行右侧坐骨神经10mm原位吻合。术后2、4、6、8、10、12周监测坐骨神经功能指数（sciatic functional index，SFI），术后12周行电生理、光镜、电镜检查。结果 术后各组SFI逐渐下降，12周时A组和D组的SFI最小，两组间无明显差别，与B组和C组比较有明显统计学意义(p<0.05)。术后12周时A组和D组再生大量有髓神经纤维及少量无髓神经纤维，再生神经的数量和结构与原神经相似，图像分析结果两组间无明显差别，与B组和C组比较有明显的统计学意义(p<0.05)。A组和D组的运动神经传导速度及潜伏期结果无明显差别，优于B组和C
赵波, 蒋电明[3]2006年在《不同时段异体神经片段皮下包埋对周围神经再生影响的实验研究》文中研究指明目的探讨异体神经片段经皮下包埋不同时段后对周围神经再生的影响。方法Wistar大鼠55只,雌雄不限,随机分为5组,A、B、C组(实验组)和D组(对照组)每组各10只,E组(供体组)15只。E组动物在出骨盆口以远5mm处切断双侧坐骨神经,向远端游离约15mm,切断作为移植物。A、B、C组动物均行左侧大腿切口,皮下钝性分离,埋入供体神经片段。术后1周(A组)、2周(B组)、3周(C组)显露右侧坐骨神经,距骨盆出口约5mm处切断,向远端游离约10mm再切断,取出对侧包埋的神经片段,修剪远近端保留长度约10mm,移植于右侧神经缺损处。D组显露右侧坐骨神经后,在距骨盆出口约5mm处切断,向远端游离约10mm后再切断,原位缝合。术后2、4、6、8、10及12周监测坐骨神经功能指数(sciaticfunctionalindex,SFI),术后12周行电生理检查测试运动神经诱发电位的传导速度及潜伏期,组织学检测移植神经再生轴突数目和面积,以及移植神经的超微结构变化。结果术后各组SFI逐渐下降,12周时A组和D组的SFI最小,两组间差异无统计学意义,但分别与B组和C组比较差异有统计学意义(P<0.05)。术后12周A组和D组再生大量有髓神经纤维及少量无髓神经纤维,再生神经的数量和结构与正常神经相似,图像分析显示两组间无明显差别,与B组和C组比较差异有统计学意义(P<0.05)。A组和D组的运动神经传导速度及潜伏期结果无差异,优于B组和C组,且差异有统计学意义(P<0.05)。结论异体神经片断皮下包埋后有促进周围神经再生的作用,皮下包埋1周组促神经再生作用优于皮下包埋2、3周组。
阙军[4]2012年在《FK506通过减少瘢痕形成促进周围神经再生的作用及机制研究》文中进行了进一步梳理FK506是1984年从链霉菌中分离出的大环内酯类抗生素,英文名tacrolimus,广泛应用于器官移植术,近年来被发现具有强大的促神经再生作用。目的第一部分：通过建立大鼠坐骨神经横断伤修复模型,探讨FK506对神经吻合口瘢痕形成的影响及其与神经再生、神经功能恢复之间的关系。第二部分：通过FK506对大鼠皮肤成纤维细胞的作用研究,探讨其减少神经吻合口瘢痕形成的机制。方法第一部分：1.建立大鼠坐骨神经横断伤修复模型,FK506按手术后4mg/kg/d灌胃；动物分组(每组15只)如下：模型组：手术后生理盐水灌胃6周；灌胃2周组：手术后FK506灌胃2周+生理盐水灌胃4周；灌胃4周组：手术后FK506灌胃4周+生理盐水灌胃2周；灌胃6周组：手术后FK506灌胃6周；正常对照组：未手术生理盐水灌胃6周。2.手术后6周取坐骨神经行MASSON染色观察胶原纤维增生情况及测量瘢痕面积(mm2)。3.手术后6周取坐骨神经行HE(Hematoxylin eosin,苏木精伊红)染色观察有髓神经纤维密度及结缔组织情况并测量有髓神经纤维密度、平均轴突直径、髓鞘厚度。4.手术后6周取坐骨神经行超薄切片、醋酸铀-硝酸铅双染后,透射电镜下观察再生神经纤维超微结构。5.手术后6周,神经标本取材完毕后,切取两侧腓肠肌,测定腓肠肌湿重恢复率(术侧与各自对侧正常肌肉比较,%)。6.手术后6周,采用de Medinaceli方法,测定坐骨神经功能指数(Sciatic Functional Index, SFI)。7.手术后6周,测定复合肌肉动作电位(compound muscle active potential, CMAP)波幅、潜伏期。8.有髓神经纤维密度及SFI与瘢痕面积进行相关性分析。第二部分：1.获取大鼠皮肤成纤维细胞并培养,5mg晶体颗粒状FK506溶解在DMSO(Dimethyl sulfoxide,二甲基亚砜)中,并保存于-20℃。含不同浓度FK506的培养基于每次实验前配制。实验分组如下：对照组：细胞以不含胎牛血清的DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium,达尔伯克(氏)改良伊格尔(氏)培养基)培育8小时；DMSO组：细胞以含DMSO的DMEM培育8小时；FK50612.5μM组：细胞以含12.5μM FK506的DMEM培育8小时；FK50625μM组：细胞以含25μM FK506的DMEM培育8小时；FK50650μM组：细胞以含50μM FK506的DMEM培育8小时；FK50675μM组：细胞以含75μM FK506的DMEM培育8小时；FK506100μM组：细胞以含100μM FK506的DMEM培育8小时；JNK(c-Jun N-terminal kinase, c-Jun氨基末端激酶)抑制剂预处理组：SP600125(40μM)预处理30分钟,继以不含胎牛血清的DMEM培育8小时；ERK(extracellular-signal regulated kinase,细胞外信号调节激酶)抑制剂预处理组：PD98059(60μM)预处理30分钟,继以不含胎牛血清的DMEM培育8小时；JNK抑制剂预处理+FK50650μM组：SP600125(40μM)预处理30分钟,继以含50μM FK506的DMEM培育8小时;ERK抑制剂预处理+FK50650μM组：PD98059(60μM)预处理30分钟,继以含50μM FK506的DMEM培育8小时。2. CCK-8(Cell Counting Kit-8,细胞计数试剂盒-8)检测不同干预对成纤维细胞活性的影响。3. Hoechst33342荧光染色观察细胞凋亡形态。4.流式细胞分析技术检测细胞凋亡。5. Western blot法检测蛋白水平的表达。结果第一部分：1.FK506明显减少神经纵截面胶原纤维含量和神经横截面瘢痕面积。2.FK506明显增加神经横截面有髓纤维密度、平均轴突直径、髓鞘厚度。3.FK506明显增加有髓神经纤维的成熟度。4.FK506显着增加腓肠肌湿重恢复率。5.FK506显着改善坐骨神经功能指数,用药组较模型组恢复提前。6.FK506显着缩短复合肌肉动作电位潜伏期、提高复合肌肉动作电位波幅。7.相关性分析提示有髓神经纤维密度及坐骨神经功能都与瘢痕面积存在完全负相关关系。第二部分：1.FK506浓度依赖性的降低大鼠皮肤成纤维细胞存活率2.FK506诱导大鼠皮肤成纤维细胞产生凋亡特征性的形态学变化。3.FK506浓度依赖性的诱导大鼠皮肤成纤维细胞凋亡,并且凋亡能被JNK抑制剂SP600125或ERK抑制剂PD98059削弱。4.FK506浓度依赖性的增高大鼠皮肤成纤维细胞p-JNK(phosphorylation of c-Jun N-terminal kinase,磷酸化c-Jun氨基末端激酶)、p-ERK(phosphorylation of extracellular-signal regulated kinase,磷酸化细胞外信号调节激酶)、胞浆细胞色素C及活化的caspase-3表达。5.JNK抑制剂SP600125或ERK抑制剂PD98059预处理显着降低p-JNK或p-ERK、以及活化的caspase-3的表达。结论第一部分：1.FK506能明显减少神经损伤修复后神经内胶原纤维的含量和瘢痕的面积。2.FK506能显着提高神经损伤修复后神经再生的速度和再生神经的质量。3.FK506能明显加快神经功能的恢复。4.FK506通过减少瘢痕形成促进周围神经再生和加快神经功能恢复。第二部分：1.FK506显着降低大鼠皮肤成纤维细胞存活率；2.FK506显着增高大鼠皮肤成纤维细胞凋亡率；3.FK506诱导大鼠皮肤成纤维细胞凋亡的机制可能与FK506激活JNK.ERK信号通路,使JNK和ERK磷酸化水平升高有关,而这两条信号通路激活后,经过或不经过线粒体途径,最终都引起caspase-3的活化从而导致细胞凋亡。
赵亚红[5]2009年在《丝素蛋白导管体内外降解行为的研究》文中进行了进一步梳理目的:本实验旨在探讨利用蚕丝丝素蛋白制备的丝素蛋白导管体内外的降解性能,并以丝素蛋白纤维为对照。方法:我们课题组采用自制的模具和独特的工艺,利用蚕丝丝素蛋白制备了丝素蛋白导管。在实验中,通过体外在蛋白酶溶液中孵育18天,体内皮下植入到大耳白兔或肌下植入到大鼠体内4,8,12和24w后分别对它们进行降解水平测定,质量损失评估和聚丙烯酰胺凝胶电泳,或者光镜观察,电镜观察,和质量损失评估,从而看出丝素蛋白导管体内外降解的动态过程。此外,根据丝素蛋白导管可能的体内降解途径,实时RT-PCR用来检测丝素蛋白导管在皮下植入后4,8,12和24w溶酶体相关基因如:亨廷丁相关基因Hip1R,组织蛋白酶D,和组织型纤溶酶原激活物tPA在mRNA水平的表达。结果:红外分析表明,丝素蛋白导管的降解性能提高可能得益于导管加工过程中蛋白构象的改变。体外酶解18天后,丝素蛋白导管和纤维的失重率分别为71%和20%;体内皮下植入后24W丝素蛋白导管和纤维的失重率分别为79%和34%。实时PCR检测表明丝素蛋白导管在降解过程中溶酶体相关基因表达有显着性变化。结论:丝素蛋白导管的降解性能相对于丝素蛋白纤维有显着增加。实时检测结果有助于我们了解导管体内降解吸收分子方面的影响。
韩克军[6]2005年在《雪旺细胞复合脱细胞细胞外基质预构建修复长段神经缺损的实验研究》文中研究说明背景 虽然桥接法修复长段神经缺损的标准做法是神经移植,但自体神经移植可供桥接长段神经缺损的供区有限,是一种创伤修复创伤,限制了临床应用。为了克服这一缺点,一直在继续研究寻找更易接受的替代物。目前的研究认为神经缺损的替代材料有:非生物材料PLA、PGA、PPE;生物材料:血管、膜管、变性肌肉、AECM;自体神经移植:游离移植、带血管蒂移植;组织工程:人工神经。AECM抗原性低,且具备接近人体的网架结构、良好的生物相容性、生物力学性能;FN,LN能较完整保留在细胞外基质内,其表面具备细胞膜受体识别位点,有助于促进与雪旺细胞黏附和神经轴突生长,因而是组织工程化人工神经的理想支架。但应用AECM修复缺损的距离受限制,组织工程学研究为解决周围神经修复难题带来新的希望。 目的 本研究采用组织工程化技术制备的脱细胞细胞外基质并行端侧吻合法预构建桥接物修复长段神经缺损,并且雪旺细胞复合脱细胞细胞外基质并行端侧吻合法预构建桥接物修复长段神经缺损,对桥接长段神经缺损的效果做了初步探索,旨在开发自体神经移植的理想替代材料。为组织工程人工神经的临床应用提供理论依据。 方法 第一部分:组织工程化神经桥接物制备(化学萃取法);脱细胞细胞外
田德虎[7]2004年在《分米波防治肌腱粘连及促周围神经再生机制的实验研究》文中研究说明肌腱、周围神经损伤是手外科常见、多发损伤，肌腱修复术后常因肌腱粘连影响临床疗效。虽然近年来许多学者在探讨改善肌腱血供、肌腱愈合机制、修复和重建腱鞘、术后早期被动活动及物理治疗等方面进行了大量的研究，取得了一定成果，但迄今为止尚无一种完全有效且简便易行的防治肌腱粘连的方法。显微外科技术的飞速发展，使周围神经损伤修复日趋完美，精湛的显微外科修复技术能精确地吻接损伤之神经，为神经再生提供了良好的基础。但损伤神经的功能恢复仍不理想。近年来国、内外已发现许多理化因素、生物制品及相关药物等具有一定程度的促进神经修复与再生作用。但由于周围神经修复与再生过程中，不仅需要受损神经元存活、轴突生长，而且还需要朝正确方向、沿合适路线延伸，营养和导向缺一不可，既有赖于一个适宜的综合微环境。 近年来康复医学的飞速发展，应用物理因子防治疾病的报道越来越多。分米波是—种高频电磁波（属于电疗范畴），由于其具有良好的改善局部血液循环、促进代谢、减轻局部炎性反应、减轻疼痛等治疗作用而受到许多学者和临床医师的广泛关注。田德虎等于临床中对屈肌腱损伤术后和糖尿病周围神经病变患者行局部分米波辅射，结果发现屈肌腱损伤术后患者术后治疗3个月，TAM法测定，优良率达97％，推测其机制为分米波能有效地促进肌腱内愈合，减少外愈合，从而减轻粘连，镇痛作用可减轻患者早期功能锻炼时的疼痛利于早期功能锻炼；糖尿病周围神经病变患者，分米波治疗1个月，总有效率达83％，推测由于分米波增加血循环，改善神经缺血、缺氧，抑制炎症反应，减轻神经周围粘连、卡压，进一步改善神经缺血、缺氧，为神经再生提供良好的微循环，利于神经的修复与再生。基于此本课题采用Leghorn鸡趾屈肌腱损伤修复模型和SD大鼠坐骨神经再生室模型，局部分米波辅射，通过对肌腱、神经及周围组织大体观察、光镜观察、电镜观察，肌腱的生物力学检测、神经电生理检测、免疫组化观察、RT-PCR等方法，分析、揭示分米波对肌腱愈合、防治肌腱粘连的机制；促周围神经再生的组织学及分子机制。为临床应用提供理论
宋永周[8]2009年在《组织工程神经修复大鼠坐骨神经缺损的实验研究》文中进行了进一步梳理一、骨髓间充质干细胞的培养、生物学特性及向类雪旺细胞诱导分化。目的:掌握大鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养和扩增的方法,并探讨其生物学特性及向类雪旺细胞分化的条件。方法:无菌条件下取大鼠双侧股骨、胫骨和胸骨,并用吸取D-Hank’s液的注射器冲出骨髓细胞,置于含10%FBS、100U/ml双抗的L-DMEM培养基中,37℃、5%CO2环境下进行培养,应用全骨髓培养法结合贴壁分离的方法进行纯化。待细胞达95%融合时,用0.125%的胰酶-0.02%的EDTA消化2-3min后进行传代。倒置显微镜下观察原代及传代后的细胞生长特点。用MTT法测定大鼠骨髓间充质干细胞的生长曲线,从而进一步了解其生长特性。将骨髓间充质干细胞按顺序分别加入β-巯基乙醇、全反式视黄酸、Forskolin、神经调节蛋白、碱性成纤维细胞生长因子、血小板源性生长因子-AA向类雪旺细胞进行诱导,在倒置显微镜下观察生长情况及诱导后的形态学变化,S-100、GFAP免疫细胞化学染色并计算其阳性率,Western-blot法检测S-100、GFAP蛋白的表达。结果:原代培养显示原代细胞1-2天开始有少量细胞贴壁,形状不规则,呈梭形成纤维样细胞形态,7-9天左右细胞可长满培养瓶底,达95%以上融合,呈漩涡状,辐射状或鱼群样排列。传代后2h后部分细胞即开始贴壁,24h内即可完全贴壁,6-7天可铺满培养瓶底。传代10代以上,各代之间细胞生长均一,稳定。P2、P4、P6细胞生长曲线基本相同,分为潜伏期(第1-2天)、对数生长期(第3-5天)和平台期(第6-7天),且几代细胞间生长状况稳定。依次加入诱导剂后部分细胞向雪旺细胞形态转变,胞体呈椭圆形,有2-3个纤细的细胞突起,成纵形栅栏状排列,免疫细胞化学染色S-100和GFAP表达阳性率分别为71.34%和68.32%,Western-blot检测有S-100,GFAP表达,未诱导细胞则不表达。结论:1应用全骨髓培养法结合贴壁分离法成功建立了一种体外简单、快速的分离、纯化大鼠骨髓间充质干细胞的方法,并使其在体外迅速得到了增殖,而且性状稳定。2大鼠骨髓间充质干细胞可以在体外经诱导分化为类雪旺细胞。二、羊膜脱细胞基质的制备及生物相容性的研究目的:通过去污剂和酶消化法进行羊膜脱细胞基质的制备,并观察其作为组织工程支架材料的生物相容性。方法:取新鲜人羊膜冲洗后以1%tritonX-100溶液振荡24 h,0.25%胰蛋白酶37℃振荡4 h,充分漂洗,干燥后环氧乙烷消毒,并进行苏木精-伊红染色和扫描电镜检测,皮下埋置实验检测其组织相容性。四甲基偶氮唑盐法测定羊膜脱细胞基质浸提液对类雪旺细胞毒性。取培养的类雪旺细胞复合培养于羊膜脱细胞基质上,倒置显微镜下观察生长情况,并进行苏木精-伊红检测。结果:制备的羊膜脱细胞基质为白色菲薄、半透明的膜状物,柔韧性好,经苏木精-伊红和扫描电镜检测无细胞残留。皮下埋置实验检测其组织相容性好。羊膜脱细胞基质浸提液对类雪旺细胞毒性评分为1级,复合培养后可见羊膜脱细胞基质表面细胞黏附生长良好,细胞伸展,形态与正常培养细胞无差异。结论:经去污剂和酶消化法制备的羊膜脱细胞基质生物相容性良好,是一种理想的组织工程支架材料。叁、类雪旺细胞复合羊膜脱细胞基质修复大鼠坐骨神经缺损的实验研究目的:探讨应用类雪旺细胞及羊膜脱细胞基质构建组织工程化神经修复大鼠坐骨神经缺损的实验效果,为临床研究提供资料。方法:以类雪旺细胞为种子细胞,羊膜脱细胞基质为支架材料,体外复合培养后构建组织工程化神经来修复大鼠10mm坐骨神经缺损。术后12周,通过大体观察、电生理检测、组织学、超微结构、逆行示踪及图像分析等多方面分析评价修复效果。结果:术后12周,实验组患肢溃疡基本愈合,移植段与近、远坐骨神经直径相当。组织学检查示含有大量的有髓神经纤维,且髓鞘较厚。透射电镜见再生神经纤维呈较成熟形态学表现,髓鞘板层清晰。电生理功能检测、逆行示踪检测被HRP标记的神经元及图像分析与自体神经移植组相比无显着差异。结论:类雪旺细胞复合羊膜脱细胞基质构建的组织工程化人工神经可以成功修复大鼠周围神经缺损,其效果接近于自体神经移植。四、创伤性脑组织匀浆对大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞的影响目的:观察创伤后24 h和正常脑组织匀浆诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化的差别。方法:采用Gruncr改良法制作中度脑损伤大鼠模型,取伤后24 h和正常大鼠脑组织匀浆,对体外培养的第3代骨髓间充质干细胞进行诱导。在倒置显微镜下观察细胞形态学变化,并应用免疫细胞化学技术检测细胞内神经元特异性烯醇化酶的表达,比较创伤后和正常脑组织匀浆两组诱导率差别。结果:骨髓间充质干细胞经创伤性脑组织匀浆培养基诱导24 h后,细胞的胞体变大,36 h后部分细胞分化,回缩成圆形或梭形,48 h后部分细胞可见两个或多个突起伸出,类似神经元。免疫细胞化学技术检测显示,创伤性脑组织匀浆培养基诱导组神经元特异性烯醇化酶阳性表达为54.28±6.03%,正常脑组织匀浆诱导分化率较前者低,神经元特异性烯醇化酶阳性表达为32.76±3.25%,细胞生长状态略差。结论:脑组织匀浆可诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化,创伤性脑组织匀浆可明显提高诱导率。
参考文献：
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[4]. FK506通过减少瘢痕形成促进周围神经再生的作用及机制研究[D]. 阙军. 南京医科大学. 2012
[5]. 丝素蛋白导管体内外降解行为的研究[D]. 赵亚红. 南通大学. 2009
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