徐文[1]2003年在《锰对PC12细胞的增殖抑制及其MAPKs活化表达的实验研究》文中提出慢性锰中毒产生的功能性损伤与自发性PD锥体外系的表征和症状紧密相关，其主要病理进程是选择性的黑质纹状体多巴胺能细胞的退行性变性，导致纹状体多巴胺的耗竭。体内和体外实验揭示锰可能是一种多巴胺能的神经毒素，与帕金森氏病这类神经退行性疾病的发生有关。多项研究表明凋亡在锰及MPP~+引起的多巴胺能神经毒性作用中起着重要作用。 丝裂原活化的蛋白激酶(MAPKs)在将细胞外刺激信号转导至细胞及核内的过程中，通过丝／苏／酪氨酸磷酸化，参与细胞增殖、分化及凋亡等及其重要的生物学反应。胞外信号调节激酶(ERK)信号转导主要参与细胞增殖与分化的调控。p38MAPK多在应激条件下激活，可能与细胞凋亡及应激时的多种病理生理过程有关，而且并行的MAPK信号通路相互协调、相互调控。 近年来，锰与细胞增殖、凋亡关系的研究受到了关注，有学者试图证明细胞凋亡在锰中毒机制中的贡献。初步的研究结果认为较低剂量的锰(0.03mM)短时间作用于神经细胞其磷酸化水平明显增高，但也有降低的报道，同时锰引发了p-p38表达的升高，并且有细胞发生凋亡的证据， 第四军巴大学硕士学攸蛤X24h和 48h的细胞生存活力实验表明锰可使细胞增殖抑制I‘q。由于实验条件不同，研究结果不一致。一般认为锰作为机体必需微量元素和多种酶的活性或激活因子，低浓度锰短时间作用可诱导ERK ffiRKZ的磷酸化增高，PC12细胞的增殖、分化需要ERKlffiRKZ的磷酸化。而高剂量较长时间的作用则会表现为毒性作用。 基于以往的实验事实，我们以多巴胺能的鼠嗜铬神经瘤细胞PC12为模型，筛选锰对神经细胞增殖抑制作用的时间及剂量效应关系，探讨在此过程中细胞MAJ，KS信号转导通路活化表达的特点及其相互之间的关系，旨在寻找锰等PD相关环境危险因子对基底神经节损伤作用的分子机制，以期揭示PD等神经退行性疾病的病因学基础，为制定环境危险因子的暴露剂量、临床治疗神经退行性疾病奠定基础。实验方法 取对数生长期神经细胞株PC，使用含有200、400、600、800pthol几MflC12的培养液，分别作用 l，2，3，4天后，用噬哇蓝（MTT）比色试验和平板集落形成实验检测细胞的存活和生长；台盼蓝染色法绘制细胞生长曲线；筛选锰的细胞毒性剂量；流式细胞仪检测细胞周期分布；透射电镜观察细胞形态学变化；琼脂糖凝胶电泳检测 MnCI。对 PC细胞基因组 DNA的影响。western七lot法检测 ERKI厘和 p38蛋白磷酸化水平实验结果 MTT和平板克隆形成实验检测结果显示200｛00pmol／L MnCI。作用1、2、3、4天均对 PC细胞株有显着的抑制作用，且呈剂量和时间依赖效应关系而且600卜mol／L MnClz作用 4天对PC12的抑制率可达50％以上。流式细胞仪检测结果表明：600pmol／L MnCI。作用4大可将PC12细胞生长周期阻滞在S期，并且诱导细胞凋亡，与电镜结果表现一致，同样条件下 PC细胞出现了 DNA碎片化，这是凋亡的生化特征。Western七lot结果显示 600pmol几 MnC12作用 1，2，3，4天可见 EIUCZ磷酸化水平呈逐渐降低趋势，其中作用2天时较对照明降低了75％…－3，P＜0刀5X －3－ 第回旱巨大学项士学位论文一200，400，600pmol几 MnClz分别作用4天时，ERKZ磷酸化水平亦逐渐降低，当400卜＜of几MnO2作用4天时较对照明降低了78Wn一，p＜0刀1卜使用ERK通路MEKI／2特异性阻制剂PD98059实验结果表明：锰是通过MEKI0磷酸化下游的ERKI／2，下调ERKI／2的磷酸化水平。600pmol／LMnC12作用1，2，3，4天可见p38磷酸化水平逐渐升高，其中作用3天时较对照组增加 6石倍（n＝3，p＜0刀5），200，400，600pmow MnCI。分别作用 4天时，p38磷酸化水平也是逐渐升高的，当 400pmoMi MnCI。作用 4天时较对照组升高了4、7倍（n＝3 3p仍刀5卜使用p38通路的特异性阻断剂SB203580实验结果表明锰是通过MEK3历磷酸化下游的p38，上调p38的磷酸化，诱导细胞凋亡。实验表明细胞内信号转导通路激活作用先于形态学改变，ERK磷酸化水平的降低和p38磷酸化水平的增高共同作用导致细胞增殖抑制引发凋亡，并且呈剂量和时间依赖效应。结论 锰对 PC细胞增殖具有显着的抑制作用，诱导凋亡可能是锰的神经毒作用机理之一。凋亡的分子机制可能是通过MAPKS信号转导通路的协调反应实现的。随着锰作用浓度的增高、作用时间的延长，PC细胞MAPKS信号转导通路中 EIUCZ的磷酸化逐渐丧失、p3 8活化表达水平逐渐升高，实验表明细胞内信号转导通路激活作用先于形态学改变，ERKZ磷酸化降低和 p3 8磷酸化增高共同作用导致细胞增殖抑制引发凋亡，并且呈剂量和时间依赖效应。 由于MAPKS信号通路是个庞大的网络系统，我们有必要进一步对锰作用下ERKo及p38上游和下游的信号分子做更为深入的研究工作。
徐文, 陈景元, 王枫, 陈耀明, 赵芳[2]2004年在《锰对PC12细胞的增殖抑制及其MAPKs活化表达的实验研究》文中提出目的 筛选锰对PC12细胞增殖抑制作用的时间及剂量效应关系 ,观察在此条件下细胞MAPKs信号通路活化表达的特点 ,探讨锰作为PD相关危险因子神经毒性作用的分子机制。方法 取对数生长期PC12细胞株 ,用 2 0 0、4 0 0、6 0 0、80 0 μmol LMnCl2 培养液分别培养 1、2、3、4天 ,噻唑蓝 (MTT)比色试验和平板集落形成实验筛选锰的毒性剂量 ,台盼蓝染色法绘制细胞生长曲线 ;western blot法检测p Erk ,p p38。结果 MTT和平板克隆结果显示 2 0 0～ 80 0 μmol LMnCl2 作用 1、2、3、4天对PC12细胞有抑制作用 ,且呈剂量和时间依赖趋势 ,6 0 0 μmol LMnCl2 作用 4天对PC12细胞的抑制率达 5 0 %以上。Western blot结果显示 6 0 0 μmol LMnCl2 作用 1～ 4天 ,p Erk2逐渐降低 ,作用 2天时较对照降低了 75 % (n =3,P <0 .0 5 ) ,2 0 0、4 0 0、6 0 0 μmol LMnCl2 分别作用 4天时 ,p Erk逐渐降低 ,4 0 0 μmol LMnCl2 作用 4天较对照降低了 78% (n =3,P <0 .0 1) ;6 0 0 μmol LMnCl2 作用 1～ 4天可见p p38逐渐升高 ,作用 3天时较对照组增加 6 .6倍 (n =3,P <0 .0 5 ) ,2 0 0、4 0 0、6 0 0 μmol LMnCl2 分别作用 4d时 ,p p38逐渐升高 ,当 4 0 0 μmol LMnCl2 作用 4天时较对照组升高了 4 .7倍(n =3,P <0 .0 5 )。
刘楠楠[3]2011年在《牛磺酸拮抗锰致海马神经元损伤中ERK1/2变化的实验研究》文中研究指明【目的】应用新生大鼠海马神经元细胞原代培养的方法,探讨ERK 1/2在介导牛磺酸保护锰诱导海马神经元细胞氧化损伤的机制。【方法】取SPF级新生24h以内的Wistar大鼠脑部海马组织进行海马神经元细胞原代培养,培养至最佳状态后,用于实验。用于培养的海马神经元细胞分组为:①空白对照组;②牛磺酸对照组(Tau:4mmol/L);③低浓度染锰组(Mn:0.2mmol/L);④中浓度染锰组(Mn:0.8mmol/L);⑤高浓度染锰组(Mn:1.2mmol/L);⑥低浓度干预组(Tau:4mmol/L,Mn:0.2mmol/L);⑦中浓度干预组(Tau:4mmol/L,Mn:0.8mmol/L);⑧高浓度干预组(Tau: 4mmol/L,Mn:1.2mmol/L)。各处理组在加以处理因素24小时后终止培养,在普通光学显微镜下观察后进行以下检测:MTT实验测试细胞活力、荧光测定法检测细胞内活性氧族的生成和增加、Western Blot法检测ERK 1/2蛋白表达、实时荧光定量PCR检测ERK1/2蛋白mRNA的相对表达。【结果】①锰可致海马神经元细胞形态学改变,细胞形态改变随着染锰浓度的增加而增大,对应染锰浓度的牛磺酸干预组细胞形态较为完整,存活细胞量较多;②MTT结果显示:海马神经元细胞经锰损伤后,细胞活力明显下降,与空白对照组和牛磺酸对照组比较,有显着性差异(P<0.01)。使用牛磺酸干预后,低、中、高浓度的牛磺酸干预组的活力与对应浓度的低、中、高染锰组对比,具有显着性差异(P<0.01),活力均比后者提高;③ROS检测显示:与空白组和牛磺酸对照组比较,锰损伤后各组ROS均明显增高。空白对照组与牛磺酸对照组比较,无统计学意义。牛磺酸干预各组细胞ROS降低,与同等浓度的染锰组对比,均有显着性差异(P值均<0.01)。4个时间点测量ROS含量存在显着性差异,F= 18.107,P<0.01;④低浓度干预组ERK1/2蛋白表达量与空白对照组、牛磺酸对照组无差别;在低浓度染锰组、中浓度染锰组的ERK1/2蛋白表达量均高于对应同等染锰浓度的干预组;在高浓度染锰组与高浓度干预组的ERK1/2蛋白表达量相比无差别;⑤低浓度干预组ERK1/2的mRNA相对表达量与空白对照组、牛磺酸对照组无差别,在低浓度染锰组、中浓度染锰组和高浓度的染锰组的ERK1/2mRNA相对表达量均低于对应同等染锰浓度的干预组。【结论】锰可致海马神经元细胞氧化应激损伤,牛磺酸可拮抗锰致海马神经元氧化应激损伤,ERK1/2在牛磺酸拮抗锰致海马神经元细胞氧化应急损伤保护作用中起到重要作用。
参考文献：
[1]. 锰对PC12细胞的增殖抑制及其MAPKs活化表达的实验研究[D]. 徐文. 中国人民解放军第四军医大学. 2003
[2]. 锰对PC12细胞的增殖抑制及其MAPKs活化表达的实验研究[J]. 徐文, 陈景元, 王枫, 陈耀明, 赵芳. 卫生研究. 2004
[3]. 牛磺酸拮抗锰致海马神经元损伤中ERK1/2变化的实验研究[D]. 刘楠楠. 广西医科大学. 2011