廖婧[1]2013年在《华南地区常见药用蛇类的DNA条形码研究及其在金钱白花蛇鉴定上的应用》文中指出中药是中华民族的一大宝藏,在中国用于治疗疾病的历史已有数千年。中药来源于植物、动物、矿物三大类。动物药是中国医药宝库中重要的组成部分,具有悠久的应用历史。《中国药典》2005年版一部共收载药材553种,其中动物药53种,占9.6%,占可供药用动物资源的3.2%。我国利用蛇类的历史源远流长,可追溯至春秋战国时期。蛇类主要的利用方式为药用、食用和制革等。常见的药用种类有滑鼠蛇Ptyas mucosus、乌梢蛇Zaocys dhumnades、银环蛇Bungarus multicinctus、尖吻蝮Deinagkistrodon acutus等,食用的主要有灰鼠蛇Ptyas korros、滑鼠蛇、舟山眼镜蛇Naja atra等,用于制革的有王锦蛇Elaphe carinata等。而乌梢蛇、银环蛇和尖吻蝮蛇分别是药典收载的生药乌梢蛇、金钱白花蛇、蕲蛇的原动物,具有祛风、通络、止痉之功效,临床应用比较普遍。近年来,蛇的药用价值和经济价值明显提高,社会需求持续上升。随着蛇类野生资源逐渐匮乏,加上价格昂贵,药材市场上出现伪品及混淆品的数量甚多,质量问题严重,仅根据外部形态特征很难进行准确地鉴别。此外由于蛇类本身繁殖能力不强,加之生态环境易遭破坏,偷猎、走私与滥用导致多种蛇类特别是濒危蛇类的生存受到威胁。对蛇的准确鉴定,不仅能准确的鉴别药材正品来源与混伪品,保证用药的安全有效,也是加强蛇类资源保护与管理的首要环节。因此,建立快速、准确的鉴定方法具有重要意义。蛇类药材的混淆品屡见不鲜,鉴别方法也不断发展,除了传统的四大鉴别方法(基源鉴别、性状鉴别、显微鉴别和理化鉴别),许多新的鉴别技术和先进仪器被引入蛇类药材的鉴别之中。DNA条形码(DNA barcoding)技术是分子鉴定的最新发展,近年来在物种鉴定方面得到了迅速的发展和应用。DNA条形码技术简便高效,操作流程简单,而且不受样品的形态性状以及研究者的专业水平限制,尤其适用于来源于生物体部分组织或器官的中药材的真伪鉴定。中药DNA条形码分子鉴定在近几年得到快速发展,加快了中药鉴定标准化的进程。目前,动物DNA条形码技术最常用的基因片段是COI基因。国内已有用基于COI片段的DNA条形码对动物药鳖甲、鹿茸的鉴别应用进行了探索,均表明了其有效性。因此,我们收集了国内常见药用蛇类,探讨应用COI条形码对蛇类识别鉴定的可行性,并分析物种间的亲缘关系。一.华南地区常见药用蛇类的DNA条形码研究1.目的本文拟收集华南地区常见药用蛇类20余种,建立华南地区常见药用蛇类的DNA条形码数据库,用于生药样品鉴定并分析物种间的亲缘关系。2.方法2.1标本采集从广东、广西、湖南等地采集和收集蛇类物种共3科23种蛇44个样品。经华南濒危动物研究所张亮鉴定,所有蛇类标本均固定保存在95%酒精中,组织置于-20。冰箱保存。本研究结合实验样本及GenBank数据进行分析。2.2引物设计采用引物设计软件Primer Premier5,设计对蛇类物种COI序列能有效扩增的引物。2.3DNA的提取及COI序列扩增1)采用动物基因组提取试剂盒对采集的动物标本提取总DNA,用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测模板质量；2)对所提取的DNA的COI序列进行扩增,引物采用自行设计的双引物扩增。引物序列为：DK1-CO1:5-'CAACTAACCACAAAGACATCGG'-3; DK1-CO2:5-'CTTCTGGGTGGCCGAAAAATCA'-3.反应体系25μl：包括模板DNA、正反引物(20umol/l)各1μl, mix酶12.5μl,双蒸水9.5μl。扩增程序：93℃预变性5min,53℃2min,循环35次,依次为93℃变性30s,53℃退火45s,70℃延伸45s,最后在70℃延伸补齐5min。2.4PCR扩增产物回收纯化及测序PCR产物用1.2%琼脂糖电泳检测后,置于紫外灯下进行呈像,然后用琼脂糖凝胶回收试剂盒(Axygen)回收。PCR产物经纯化后,由上海英俊工程有限公司测序,各样品均采用正向和反向双向测序。2.5序列比对及分析利用BioEdit and Clustal X等软件对测序所得序列进行排序比对并辅以手工校正,获得长度为658bp的样品序列,在GenBank中进行相似性检索。排序后的序列使用MEGA5.0分子进化遗传分析软件,采用K-2p (Kimura2-parameter)计算遗传距离,用邻接法(neighbor joining method)构建系统聚类树,系统树各分支的置信度用自举检验法(bootstrap test),检验各分支的支持率,共进行1000次循环。3.结果3.1碱基组成与变异位点结果显示,51条蛇类编码的658个排列位点中,变异位点277个,A、T、C、G碱基平均含量分别为26.7%、28.1%、29.1%、16.1%。其中A+T含量(54.8%)明显高于G+C含量(45.2%)。3.2物种遗传距离分析种内遗传距离值范围为0-0.0409,最大的种内遗传距离值出现在乌梢蛇,其次是黄链蛇,为0.0377。种间遗传距离值范围为0.0850-0.2568。种间差异净值的最小值出现在东川白环蛇与黑背白环蛇之间,为8.5%,最大值出现在舟山眼镜蛇与三索锦蛇之间,达到了25.68%。最小种间遗传距离为0.0850,种间平均遗传距离为0.1943。银环蛇的种内遗传距离最大值为0.0185,乌梢蛇为0.0409,尖吻蝮蛇为0.0232。银环蛇与其余物种的种间遗传距离值范围为0.1797-0.2488,乌梢蛇为0.1581-0.2375,尖吻蝮蛇为0.1528-0.2488。其种间距离最小值均远远大于其种内遗传距离最大值。3.3系统发生树的构建基于COI序列,通过邻接法(NJ)所构建的系统聚类树图可以看出同属序列聚在一起,同种个体的聚集趋势十分显著,相同物种相应分支的支持值均为100。所研究的3个科51个个体分成3个支系。游蛇科Colubridae的31个个体构成了第一个支系,后与第二支系眼镜蛇科Elapidae聚类；第二支系眼镜蛇科由舟山眼镜蛇,银环蛇与眼镜王蛇3种蛇构建,自举检验置信度为77；第三支系为蝰科Viperinae6种蛇,自举检验置信度为98。4.结论4.1本文采用自行设计的引物扩增蛇类各物种,均得到了100%的扩增效率与测序效率。4.2COI作为DNA条形码对文中20余种常见药用蛇类具有较好的鉴别能力,并精确至物种的划分。4.3本研究为蛇类物种间亲缘关系提供了新的参考信息,利用DNA条形码技术能对物种进行分类、鉴别,为物种保护提供了重要的技术手段。二.金钱白花蛇及常见混伪品的DNA条形码鉴定1.目的本文拟收集了金钱白花蛇及其常见混伪品,扩增其COI序列,利用DNA条形码技术对金钱白花蛇及其混伪品进行鉴别研究。2.方法2.1标本采集收集和采集金钱白花蛇及其常见混伪品共9种蛇的原动物标本39份,经鉴定后,置95%酒精中,保存于标本馆；从市场上购买金钱白花蛇生药10份。2.2DNA的提取及COI序列扩增、PCR扩增产物回收纯化及测序、序列比对及分析。方法同“华南地区常见药用蛇类DNA条形码研究”所述。对所提取的DNA的COI序列进行扩增,引物采用LC01490和HC02198双引物扩增,引物序列分别为：LCO1490:5'-GGT CAA CAA ATC ATA AAG ATA TTG G'-3,HCO2198:5'-TAAACT TCA GGG TGA CCAAAAAAT CA'-3。3.结果3.1碱基组成与变异位点银环蛇与其主要混伪品的COI序列存在较多变异位点,有255个变异位点,403个保守位点；A、T、C、G碱基平均含量分别为26.5%、29.2%、28.6%、15.8%；GC含量范围为40.1%-47.4%,平均GC含量为44.3%。各物种种内GC含量变化较小,15条银环蛇中有10条GC含量均为43.3%,2条为43.2%,2条为42.9%；4条赤链蛇中2条GC含量为46.8%,另外2条分别为46.4%和47.0%；4条铅色水蛇中2条GC含量为44.5%,另外两条分别为44.7%和44.8%；4条黄斑渔游蛇Xenochrophis flavipunctatus中2条GC含量为44.1,另两条为44.2%；其余各物种种内GC含量均相等,金环蛇B. fasciatus2条均为40.1%,尖吻蝮蛇3条均为46.0%,赤链华游蛇Sinonatrix annularis2条均为45.9%,舟山眼镜蛇3条均为47.4%,百花锦蛇E. moellendorffi2条均为42.6%。3.2种内变异银环蛇的15条种内序列,主要变异位点有14处,其转换／颠换值为6；转换总数为12,在5、214、268、298、318、500、622的位置进行T-C转换,在181、184、499、517、628的位置进行A-G转换；颠换总数为2,分别在217的位置G-C颠换,562的位置A-T颠换。银环蛇种内平均K2P距离为0.0103,种内最大K2P为0.0201,种内COI序列变异较小。赤链蛇的种内K2P距离范围为0.0030-0.0361,平均种内K2P距离为0.0195；铅色水蛇种内K2P距离范围为0.0015-0.0030,平均值为0.0023；黄斑渔游蛇的种内K2P距离为0-0.0015,平均值为0.0010；舟山眼镜蛇、尖吻蝮蛇、金环蛇、百花锦蛇和赤链华游蛇的种内K2P距离值均为0。3.3种间变异种间平均K2P距离为0.2178,最小种间平均K2P距离值出现在金环蛇与银环蛇之间为0.1557,远大于Hebert所推荐的物种鉴定最小种间遗传距离0.027；最大种间变异为0.2578,出现在金环蛇与尖吻蝮蛇之间。银环蛇与金环蛇的种间遗传距离最小,与尖吻蝮蛇的种间遗传距离最大。3.4金钱白花蛇及其混伪品的NJ树基于9种蛇的39个COI序列,通过邻接法(NJ)所构建的系统聚类树图同属序列聚在一起,且各物种又形成相对独立的枝,其支持率均为100。从基于COI序列的NJ树中明显地看到,银环蛇与其混伪品能够很好地区分开。3.5动物饮片序列比对及检索结果从广东市场上收集金钱白花蛇药材10份,获得其COI条形码,在BOLD系统中进行检索,利用BOLD系统中的鉴定引擎,能迅速准确地鉴定出金钱白花蛇的真伪,并确认其物种信息,物种相似度达到99.08%-100%。4.结论4.1基于COI序列的DNA条形码鉴别金钱白花蛇及其混伪品的方法切实可行,弥补传统形态学方法的不足,可以推广应用于实际；4.2在BOLD平台上建立了金钱白花蛇及其混伪品数据库,将金钱白花蛇生药样品的COI序列用BOLD鉴定引擎进行鉴定,可以快速明确其真伪,并确认其物种信息。
王义权[2]1995年在《蛇类药材的系统研究》文中进行了进一步梳理蛇类药材是常用中药，具有祛风通络、止痉的功能。以蛇入药用于治病在我国历史悠久，《中国药典》(1990年版)分别规定乌梢蛇为乌梢蛇Zaocys dhumndaes、蕲蛇为尖吻蝮Agkistrodon ocutus、金钱白花蛇为银环蛇Bungarus multicincius的干燥体。据商品鉴定，市售以上3种蛇类药材中常混有其它种蛇加工而成的混淆品或伪品，生药鉴定困难。我们在文献查考、药源调查的基础上，对蛇类药材原动物的分类学、生药性状、微皮纹鉴定、商品药材鉴定、理化分析及分子遗传标记鉴定等方面进行了研究。 通过对历代本草的考证得如下结论：1．乌梢蛇药材即古代本草中的乌蛇，其原动物种名为乌梢蛇。作为药用以乌蛇为名始载于南朝刘宋时期(公元420～479年)的《雷公炮炙论》。“乌梢蛇”一名最早出现于《本草纲目》中乌蛇条下的释名中。2．蕲蛇药材即古代本草中的白花蛇，其原动物种名为尖吻蝮，其拉丁学名应订正为Deinagkistrodon acutua。作为药用也是首载于刘宋时代的《雷公炮炙论》。3．金钱白花蛇药材古代本草中无记载，现代文献均认为始载于《饮片新参》。经文献查考发现，在《饮片新参》前，Read译《本草纲目》时即在其评论中提及，因此金钱白花蛇作为药用首载应早于《饮片新参》。其原动物种名为银环蛇。 药源调查表明，乌梢蛇的主产区为江苏、浙江、安徽、江西、湖南、湖北和四川等省。蕲蛇主产区为浙江、江西、湖南、福建等省。金钱白花蛇主产区为广东、湖南、江西等省。目前蛇类药材直接或间接来自野生蛇类，在人工养殖条件下尚未实现蛇类的大规模繁殖和生长。 在查看原动物标本的基础上，对乌梢蛇及其混淆品的原动物共8个种，蕲蛇及其混淆品的原动物共3个种，金钱白花蛇及其伪品的原动物共3个种进行了分类鉴定形态描述，并分别编制了原动物检索表。 对收集刭的乌梢蛇药材及其混淆品6种58件，蕲蛇药材及其混淆品4种15件，金钱白花蛇药材及其伪品4种190件进行了生药性状描述，编制了蛇类药材生药性状检索表。 蛇类药材及其原动物鳞片的扫描电镜观察表明，蛇类鳞片的微皮纹特征具有
曹树萍[3]2014年在《淫羊藿类及蛇类药材的鉴定和质量评价研究》文中研究说明目的：2010版药典收载的植物药材淫羊藿基源复杂,动物药材蛇类混伪品多,现行药典方法难以对其进行全面、有效、客观的质量评价。因此本文选取这两种药材分别作为药典植物类药材和动物类药材的代表进行多维化研究,为药典植物药和动物药的鉴定和质量评价模式提供参考,同时也为提高药典标准提供实验依据。方法：本研究首先选取了含药典淫羊藿药材5种植物基源在内的18个品种120份淫羊藿类植物与药材样本和20个品种79份蛇类药材样本作为研究对象,从外观形状鉴别、分子生物学鉴定、化学鉴定及质量控制等方面进行质量评价研究。分别采用BLAST.遗传距离分析、系统发育树(NJ、MP和ML)树和‘'barcoding gap”检验4种方法对DNA条形码技术在药典淫羊藿类药材鉴定领域应用的可行性进行了详细的分析和探讨。采用RRLC-DAD-ESI-MSn釉UPLC-Q-TOF-HDMS法对淫羊藿属18个种的样本(含药典5种基源)进行化学成分分析。建立了18种113份淫羊藿类药材样本(含药典5种基源)的指纹图谱,结合化学计量学(相似度分析、聚类分析、PCA主成分分析)对其进行分析。同时结合5种主要黄酮类成分(朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷和宝藿苷I)的含量测定,对药典品种和非药典品种进行了质量评价的比较研究。并采用QAMS法对淫羊藿中的朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C和宝藿苷I四种成分进行了含量测定。在国家药典品种乌梢蛇检品的PCR检验过程中发现存在鉴定方法的缺陷,为规避其出现的假阳性结果,采用BLAST、系统发育树(NJ)、遗传距离分析和“barcoding gap'检验4种方法对线粒体DNA条形码技术在药典中蛇类药材鉴定领域应用的可行性进行了详细的探讨。结果：从ITS、psbA-trnH、rbcL、matK和rpoCl五个基因片段中筛选出鉴定成功率最高的条形码psbA-trnH基因片段。其中基于ITS、psbA-trnH釉matK序列的条形码能够实现朝鲜淫羊藿的完全鉴定。通过高分辨质谱得到化合物精确分子量、多级质谱串联提供的碎片离子信息,与标准品或文献比对后,共鉴定出23个化合物,包括22个黄酮苷类成分和1个生物碱类成分。化学实验表明,柔毛淫羊藿和心叶淫羊藿药材质量最好,其5种黄酮类成分含量黄酮类有效成分总和要高于朝鲜淫羊藿。朝鲜淫羊藿品质稳定,但是有效成分含量相对较低,药典达标率仅为5.88%,远低于其他药典淫羊藿。说明朝鲜淫羊藿品种稳定但质量欠佳。箭叶淫羊藿分布范围虽广,但质量参差不齐,特别是资源量较大的安徽省,其部分地区淫羊藿苷类成分含量低微。按照相似度值的高低对5个药典淫羊藿的野生产地进行排序比较,为选择优质种质作为人工栽培的种源提供依据。基于淫羊藿化学成分为基础建立的聚类分析和基于ITS、psbA-trnH和matK DNA序列的条形码聚类分析,均显示朝鲜淫羊藿可以实现完全聚类,易于其它药典品种的淫羊藿区分开。黄酮类含量测定结果和指纹图相似度评价显示朝鲜淫羊藿化学成分和含量稳定,相似度高,而其他淫羊藿品种内部差异分化较大,种间种内区分不明显。对一测多评法应用于药典淫羊藿样品的测定结果进行考察,药典淫羊藿样品不同种种间差异较大,其中巫山和箭叶淫羊藿部分样本由于内参物(淫羊藿苷)含量普遍过低,或不含有其他黄酮类成分,不适宜用QAMS法进行含量测定。建立了基于16S、Cytb和COI的药典蛇类药材(乌梢蛇、金钱白花蛇和蕲蛇)的线粒体DNA条形码检验平台。首次提出以16S基因片段作为药典蛇类药材检验的最佳DNA条形码候选序列,建议以此作为蛇类药材快速检验的首选序列。结论：本文对淫羊藿和蛇类药材进行了多维化研究,为药典植物药和动物药的鉴定和质量评价模式提供参考,同时也为提高药典标准提供实验依据。
张乐, 陶明宝, 陈鸿平, 刘友平[4]2017年在《常用蛇类药材鉴别研究进展》文中研究表明蛇是人类宝贵的野生动物资源,也是我国重要的蛇类药材来源。它具有祛风、通络、定惊止痉等功效,在风湿痹证方面具有良好的治疗效果。近年来,在经济利益驱使下,加上我国蛇种类繁多,现有蛇类多达241种,且各自形态特征差异不明显,使得准确鉴定药材困难,容易导致市场用药品种混乱。文章就近10年来用于常用蛇类药材(主要以《中国药典》收载品种乌梢蛇、金钱白花蛇、蕲蛇为例)及其混伪品的鉴别方法进行了整理研究,综述了各类鉴别方法在蛇类药材中的研究进展,包括传统的性状鉴别、显微鉴别、理化鉴别及近年来发展的微性状鉴别、色谱质谱技术和一些现代的分子鉴别方法如DNA条形码技术,并阐述了各种鉴别方法的适用对象及其优缺点,以期为蛇类药材或者动物类药材的鉴别研究提供思路和参考。发现目前药用蛇在现场快检、中成药的鉴别和优劣鉴别方面仍然面临着一些困难,提示对药用蛇品质进行客观评价时,还需将传统与现代鉴别方法相结合、真伪与优劣鉴别技术相联系。
王义权, 周开亚[5]1997年在《蛇类药材分子遗传标记鉴别的初步研究》文中指出蛇类药材分子遗传标记鉴别的初步研究王义权周开亚（南京师范大学生物系，南京２１００９７）蛇类药材的鉴别，目前主要是根据其外部形态特征［１，２］和骨骼、鳞片的形态特征［３～５］。随机扩增多态ＤＮＡ（ＲａｎｄｏｍｌｙＡｍｐｌｉｆｉｅｄＰｏｌｙｍｏｒｐｈ...
周小江[6]1995年在《蛇类药材鉴别方法概述》文中提出概述了近10年来蛇类药材的鉴别方法,包括鳞片鉴别法、骨骼鉴别法、显微鉴别法和理化鉴别法。
王义权, 周开亚[7]1998年在《蛇类药材的性状鉴别》文中研究指明鉴于目前流通领域中蛇类药材的品种混乱情况比较严重,缺少简便而有效的鉴别手段,本文对收集自全国10个省区的263件蛇类药材及其伪、混品标本共14种进行了生药性状描述,归纳了《中国药典》(1995年版)所载三种正品蛇类药材的鉴别要点,并编制了蛇类药材及其常见伪、混品的性状鉴定检索表。
王义权, 周开亚[8]1996年在《蛇类药材的商品调查及鉴定》文中研究说明1993年对全国10个省区的蛇类药材商品进行了调查,共收集蛇类药材263件,鉴定出商品乌梢蛇药材原动物6种,商品金钱白花蛇药材原动物4种(其中广西产白花蛇1种),商品蕲蛇药材原动物4种。商品药材中金钱白花蛇伪品数量最多,乌梢蛇也时有混淆品可见,蕲蛇的混淆品较少。鉴于商品“白花蛇”一名十分混乱,建议将白花蛇名称规范化。
陈梦, 方昀, 程汝滨, 黄真, 张光霁[9]2018年在《线粒体DNA标记在动物类药材分子鉴定中的应用进展》文中认为动物类中药材是中华医药宝库中重要的组成部分,药用历史悠久,功效显著。随着野生动物资源的破坏和日益增长的市场需求,动物类药物中混伪品掺杂现象时有发生,为其临床应用带来了安全隐患。线粒体DNA因其严格的母系遗传特征和丰富的遗传多样性,被广泛应用于动物群体遗传、谱系生物地理和系统发育等研究领域。近年来,线粒体DNA标记在动物类药材分子鉴定中的应用日益广泛,并取得了丰硕的成果,为动物类药物的质量控制提供了技术保障。对COI、Cyt b、12S rRNA等线粒体DNA标记在动物类药材分子鉴定中的应用现状进行总结,结合课题组前期的研究结果,对线粒体DNA分子标记技术在动物类药材鉴定中的后续应用开发进行了展望,以期为我国药用动物资源的合理利用提供参考和借鉴。
张朝晖, 徐珞珊[10]1997年在《我国动物类药材鉴定研究进展》文中提出我国动物类药材鉴定研究进展张朝晖徐珞珊（中国药科大学南京２１０００９）我国使用动物类药材历史悠久，早在《神农本草经》已收载动物药６７种，《本草纲目》收载动物药４４４种，《本草纲目拾遗》又增加１６０种，至今临床和民间使用的动物药已达１５００种左右［１...
参考文献：
[1]. 华南地区常见药用蛇类的DNA条形码研究及其在金钱白花蛇鉴定上的应用[D]. 廖婧. 南方医科大学. 2013
[2]. 蛇类药材的系统研究[D]. 王义权. 南京师范大学. 1995
[3]. 淫羊藿类及蛇类药材的鉴定和质量评价研究[D]. 曹树萍. 北京中医药大学. 2014
[4]. 常用蛇类药材鉴别研究进展[J]. 张乐, 陶明宝, 陈鸿平, 刘友平. 中国实验方剂学杂志. 2017
[5]. 蛇类药材分子遗传标记鉴别的初步研究[J]. 王义权, 周开亚. 药学学报. 1997
[6]. 蛇类药材鉴别方法概述[J]. 周小江. 中药材. 1995
[7]. 蛇类药材的性状鉴别[J]. 王义权, 周开亚. 基层中药杂志. 1998
[8]. 蛇类药材的商品调查及鉴定[J]. 王义权, 周开亚. 中药材. 1996
[9]. 线粒体DNA标记在动物类药材分子鉴定中的应用进展[J]. 陈梦, 方昀, 程汝滨, 黄真, 张光霁. 中草药. 2018
[10]. 我国动物类药材鉴定研究进展[J]. 张朝晖, 徐珞珊. 中国中药杂志. 1997