王勤[1]2004年在《人OX40L转基因细胞的构建与单克隆抗体的研制及其生物学功能的研究》文中研究指明人OX40配体(OX40L或CD134L)属TNF超家族成员，为Ⅱ型跨膜糖蛋白，Mr约34～40kD，编码183个氨基酸。人OX40L由Miura等于1991年克隆，最初命名为gp34，基因长约1kb，定位于人染色体1q25。人OX40L具有广泛的表达谱，主要表达于成熟的树突状细胞(DC)、活化的B细胞、血管内皮细胞(ECV)、人脐带静脉血管内皮细胞(HUVEC)、巨噬细胞以及心、骨骼肌、睾丸和肺等组织器官。在机体的免疫应答过程中，OX40／OX40L作为一对重要的共刺激分子，为T、B细胞的激活提供了重要的共刺激信号。它们的相互作用能促进CD4~+T细胞的活化、增殖、迁移并延长其寿命，能促进生发中心(GC)的形成，还能促进DC分化成熟及细胞粘附。近年研究表明，在肿瘤免疫应答的介导和自身免疫性疾病的发生发展中，OX40／OX40L发挥了重要作用，且OX40只在炎症和肿瘤浸润部位的抗原特异性T细胞上特异高表达，使其成为一个理想的免疫干预靶分子。因此，OX40L转基因细胞的构建、OX40L分子的激动剂或拮抗剂的研制及其在OX40／OX40L信号传导和调节中的作用的研究将在肿瘤、移植排斥反应、自身免疫性疾病中具有重要的理论研究和临床应用价值。 1．人OX40L基因的克隆及转基因细胞的构建 本研究通过RT-PCR方法，从成熟DC的总RNA中扩增出编码人OX40L全长的cDNA片段，通过基因克隆技术，将其插入逆转录病毒载体pEGZ-Term。进一步通过脂质体转染技术将重组表达载体与辅助病毒载体共转染包装细胞293T，用其培养上清感染L929细胞72h后，经Zeocin筛选出稳定表达OX40L分子的L929细胞株(L929／OX40L)。经体外长期传代和液氮反复冻存和复苏，转基因细胞生长良好，OX40L的表达稳定在95％以上。 2．L929／OX40L转基因细胞对T细胞的共刺激作用人OX4OL转基因细胞的构建与单克隆抗体的研制及其生物学功能的研究摘要 将反应T细胞用抗人CD3激发型单抗或联合CD3和抗CD28单抗激发Zd后，加入刺激细胞L929/o x40L或L929/m ock，共培养3d。3H一TdR掺入法显示，L929/o X4OL细胞能有效地促进T细胞增殖，而联合抗CD28单抗，促增殖效应则更为显着。细胞表型分析L929/OX4OL能促进CD4+T细胞活化。同样，细胞周期及凋亡检测表明，该转基因细胞能促进T细胞增殖抗凋亡。ELIsA法检测培养上清细胞因子表明，L929/O X40L能明显促进T细胞对几一2、几一10和环N邓的分泌。3.分泌鼠抗人0X40L单抗的杂交瘤细胞株的制备 利用上述构建的转基因细胞L929/OX40L为免疫原，免疫BALB/c小鼠，采用B淋巴细胞融合技术，将反复免疫后的小鼠的脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞SPZ/0进行细胞融合，以此转基因细胞作为阳性筛选细胞，以转空质粒的对照细胞L929/mock作为阴性对照细胞，经免疫荧光标记分析及抗体分泌阳性孔内杂交瘤细胞的反复筛选，并经多次克隆化培养，最终获得6株持续、稳定分泌鼠抗人OX40L单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为gH10、4C12、IE7、SD10、4H4和IGI。经快速定性试纸法分析鉴定，gH 10、1 E7、4H4和1 Gz的重链均为IgGI;4C12的重链为IgOZb:8D10为IgGZa，而轻链均为K。经体外连续传代(40代)培养，液氮冻存半年后复苏，仍生长良好，稳定分泌抗体。 继而采用本室建立的腹水诱生和纯化方案，腹水形成阳性率为95%以上，腹水的产量平均约为5，oml/只小鼠。经ProteinG亲和层析柱分离纯化，腹水型单抗纯化后蛋白含量在0.8一10mg/ml之间。纯化后单抗的效价为卜1000以上，抗体蛋白用于间接免疫荧光分析的用量为。.2一2林留1、1护细胞。4.鼠抗人0x40L单克隆抗体的体外生物学特性研究 以L929/OX40L为竞争靶细胞，经间接免疫荧光标记的竞争抑制试验，结果显示，SD10与gH10识别OX4OL分子的抗原位点完全相同，4C12与4H4也能识别另一相同的0X40L分子的抗原位点，而IE7和IGI则识别其他不同的抗原位点。另外，经间接免疫荧光标记显示，9H10、4C12和IE7能特异性识别活化的B细胞及成熟DC所表达的OX40L分子。 生物学功能的研究结果表明，5株单抗均能抑制单向和双向混合淋巴细胞反应，而另一株单抗IE7作用则相反，它能联合激发型 CD3单抗促进T细胞增殖。提示这人OX4OL转基因细胞的构建与单克隆抗体的研制及其生物学功能的研究摘要6株单抗均为功能性抗体，它们在器官移植的排斥反应、自身免疫性疾病及肿瘤等的防治中可能具有潜在的应用价值。5.抗人0X40L单抗介导的逆向信号对B细胞和DC的作用 经ELISA法分析，在T细胞依赖的PWM激发的B细胞培养体系中，抗人0X40L单抗gH 10、4C12和1 E7均能促进T细胞依赖性B细胞分泌抗体。经流式细胞仪对DC表型分析，在抗CD40单抗激发的基础上，抗人上调DC上CD80、CD86、CD83和CXCR4的表达，OX40L单抗(9H10)能进一步促进DC且ELISA法分析显示，联合单抗gHID泌更多IL一2和IFN一7，而IL一4和IL一10和抗CD40单抗刺激的进一步分化成熟。而DC能促进T细胞分则无明显变化。说明联合抗人OX40L单抗(gH10)和抗CD40单题咖‘bC综上所述，本研究成功克隆了人能进一步促进T细胞向Thl方向分化。OX40L基因、构建了转OX40L的转基因细胞并研制了6株能稳定分泌特
孙建军[2]2004年在《OX40转基因细胞的构建及鼠抗人OX40激发型单克隆抗体的研制》文中认为OX40(CD134)是分子量为50kD的Ⅰ型跨膜糖蛋白，属TNFR超家族成员，主要表达于活化的CD4~+T细胞表面，CD8~+T表面也有少量表达，如ConA和PHA激活的CD4~+和CD8~+T细胞，人、鼠炎症部位的CD4~+T细胞，成人T细胞白血病(ATL)细胞，人HTLV-1病毒感染的建株T细胞HuT102和MT-2。编码人OX40的基因位于1p36，长约1.4kb，编码277个氨基酸。其配体OX40L(CD134L)为TNF超家族成员，分子量为34～40kD的Ⅱ型跨膜糖蛋白。人OX40L主要表达于成熟的树突状细胞(DC)、活化的B细胞、血管内皮细胞(VEC)、脐带静脉血管内皮细胞(HUVEC)、巨噬细胞以及某些组织器官包括心、骨骼肌、睾丸和肺等。OX40／OX40L介导的共刺激信号，参与了T细胞的活化、增殖和迁移，维持T细胞的长期生成，以及协同CD28信号促进生发中心的形成。CD28／B7主要在初次免疫应答中起作用，而OX40／OX40L信号在初次免疫的后期，二次免疫应答及免疫记忆中发挥重要的调节效应。同时OX40L还能介导逆向共刺激信号，协同CD40信号诱导DC进一步分化成熟；在内皮细胞上，OX40L逆向信号能上调表达趋化因子RANTES／CCL5。由于OX40主要表达在炎症部位的抗原特异性T细胞上，使其成为一个理想的免疫干预的靶分子，有望通过在体内阻断OX40／OX40L的相互作用或消除OX40~+T细胞来减弱自身免疫性疾病及移植排斥反应，而应用激发型抗OX40的单抗来增强OX40信号、促进细胞因子的分泌和增加抗原特异性记忆细胞的数量，从而提高机体抗肿瘤的能力。 1．人OX40 cDNA的克隆及转基因细胞的构建。本研究通过RT-PCR方法，从PHA活化的扁桃体T细胞的总RNA中扩增获得编码人OX40的cDNA片段，通过基因克隆技术，将其插入真核表达载体pcDNA3.1。进一步通过脂质体转染技术将此重组表达载体导入小鼠成纤维细胞L929中，G418抗性筛选获得能稳定表达人OX40转基因细胞及鼠抗人OX40激发型单克隆抗体的研制摘要OX40的转基因细胞L929一OX40。经体外长期传代和液氮反复冻存复苏，转基因细胞生长良好，0X40的表达稳定在80%以上。2.L929一OX40转基因细胞对DC的促分化作用。据文献报道，OX40L能介导逆向共刺激信号，促进DC的分化成熟。因此利用上述构建的转基因细胞初步探讨了转基因细胞对DC的刺激作用。按照本科室建立的DC诱导方案，将新鲜分离获得的人外周血单个核细胞(PBMC)在GM一CSF和几一条件下培养6d后，添加可溶性CD40L(sCD40L)并与L929一0X40共育，48h后，流式细胞术检测到CD40、CD86、CD83进一步上调表达。3.鼠抗人0x40杂交瘤细胞株的研制。利用上述构建的转基因细胞L929.OX40为免疫原，免疫BALB/c小鼠，采用B淋巴细胞融合技术，将免疫后小鼠的脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞SPZ/0进行细胞融合，以此转基因细胞以及PHA活化的T细胞作为阳性筛选细胞，以转空质粒的对照细胞L929一Mock作为阴性对照细胞，经免疫荧光标记分析及抗体分泌阳性孔内细胞的反复筛选，并经多次克隆化培养，最终获得2株持续、稳定分泌鼠抗人ox40单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为7Ell和5HI。经快速定性试纸法分析鉴定，7Ell的Ig类别为IgGZb，而5HI则为IgM。经体外连续传代(4。代)培养，液氮冻存半年后复苏，仍生长良好，稳定分泌抗体。4.单抗7En的生产和纯化。采用本室建立的小鼠体内诱生腹水方案诱生腹水，腹水形成的阳性率为95%，腹水的产量平均为6mU只小鼠。腹水的纯化通过ProteinG亲和层析法实现。腹水型单抗经纯化后，单抗蛋白含量在0.8~1.2mg/ml之间。经免疫荧光标记分析表明，腹水型单抗的效价为1:10万以上，纯化后抗体蛋白用于间接免疫荧光标记的用量为1.0-2.0，创5XI护细胞。5.单抗7En识别位点研究。通过与BD PharMingen公司鼠抗人Ox40-FITC单抗(克隆号ACT35)的竞争抑制试验，单抗7Ell完全不能阻断OX4压F仃C单抗与相应抗原的结合，提示该单抗与上述商品化的单抗识别不同的抗原位点。6.单抗7En对活化的T细胞促增殖作用及细胞因子分泌的影响。取正常人新鲜外周血，通过常规的Ficoll密度梯度分离法，获得PBMC，再通过绵羊红细胞E花环形成试验，获得纯度较高的T细胞(CD3阳性率90%以上)。经过激发型鼠抗人子OX40转荃因细胞及鼠抗人OX40橄发型单克隆抗体的研制摘要CD3和CD28单抗刺檄1~2d后，加入7Ell单抗继续培养，发现该单抗能够明显促进活化的T细胞进一步增殖(2~3倍)，上调表达IL一2和IFN一Y，下调IL-10。因此单抗7Ell属于激发型的单克隆抗体，对体外扩增活化的T细胞具有很明显的作用，并且能促使T细胞向Thl方向分化，在肿瘤免疫治疗中具有潜在的临床应用价值，值得进一步深入研究。 综上所述，本研究成功克隆了编码人OX40分子的cDNA片断，构建了能稳定表达人OX4O分子的转基因细胞，初步探讨了该转基因细胞对DC的促分化作用，证明了表达在DC表面的OX4OL分子能介导逆向共刺激信号:成功研制出能稳定和特异分泌抗人OX40激发型单克隆抗体的杂交瘤细胞株，初步探讨了该单抗对活化T细胞的刺激作用，证明该单抗在体外可进一步扩增活化的T细胞，这可能是通过上调表达IL一2而起作用。并且该单抗能促进T细胞上调表达IFN一Y，下调表达
施勤[3]2003年在《共刺激分子CD40/CD40L和OX40/OX40L在乳腺癌中的表达及其生物学意义》文中提出TNF／TNFR超家族成员中的CD40／CD40L、OX40／OX40L分子因其在特异性免疫应答中的重要作用和与疾病的密切关系而备受瞩目，成为免疫学中的热点研究领域。本课题以乳腺癌为研究对象，探讨CD40、OX40、OX40L等相关分子在乳腺癌细胞上的表达及其临床意义，并在体外以rhCD40L为激动剂研究CD40信号对乳腺癌细胞株生物学行为的影响，为临床的运用提供实验依据和理论基础；并对OX40L进行了基因克隆、表达和生物学特性研究，为研制具有自身知识产权的鼠抗人单克隆抗体和开展相关研究提供了实验手段。一、CD40及相关分子在乳腺癌中的表达及其生物学意义本研究采用了免疫组织化学方法对58例乳腺癌石蜡切片CD40分子的表达进行检测，发现正常乳腺组织不表达或弱表达CD40分子，而在乳腺癌细胞中均有一定程度的表达，阳性表达率分别为37.9％，与正常乳腺组织的表达有显着性差异(p＜0.01)。由于使用抗体的识别位点不同和检测的样本数量差异，使得CD40在石蜡切片(37.9％)和新鲜标本(50％)中的阳性表达率尽管不同，但都显示CD40的表达与局部淋巴结的转移有关；新鲜肿瘤标本中CD40的表达结果还显示CD40表达与瘤块大小、远处转移有关(p＜0.05)，与皮肤粘连无关(p＞0.05)；在已建株的乳腺癌细胞上CD40表达强阳性(＞90％)。上述结果均表明CD40分子在乳腺癌中的表达，可能参与肿瘤的发生、发展和转移，其临床意义有待进一步研究。组化结果还显示，58例乳腺癌有21例P53阳性表达(36.2％)，与乳腺癌肿瘤分化程度、瘤块大小有关(p＜0.05)，与局部淋巴结转移无关(p＞0.05)。VEGF分子在各种病理类型肿瘤中高表达(81％)，其表达与乳腺癌肿瘤瘤块大小有关(P<0.05)，与分化程度、局部淋巴结转移无关伽>0.05)，同时也与CD4O、P53分子表达无明显相关性。进一步分析，发现乳腺癌中CD40与P53的表达存在一定的相关性(p<0.01，厂0.52)，提示两者在肿瘤的发生、发展中有密切的关系，两者的表达对于乳腺癌的临床评估具有重要的诊断价值，同时在进行以CD40分子为靶分子的生物治疗中要充分考虑到P53基因功能状态。二、CD40信号对乳腺癌细胞株生物学行为的影响 两株高表达CD40的乳腺癌细胞MDA一MB一231、MDA一MB一435细胞，经thCD40L激发后，其HLA一DR分子有不同程度的上调，肿瘤细胞自身高表达CD44和CD54可通过与各自相应配体结合，稳定细胞间接触，增强免疫原性和促进T细胞活化。同时，Rl’- PCR结果显示肿瘤上皮细胞经CD40激发后T细胞活化和趋化因子RANTES的转录水平上调，推测其编码的蛋白可能参与了对T细胞的趋化和活化。因此，肿瘤细胞CD40分子的激发可以促使机体产生有效的抗肿瘤免疫应答，通过粘附分子/共刺激分子上调，改善或纠正T细胞对肿瘤细胞的免疫无能，可以认为这是CD4O信号作用于肿瘤细胞和扩大抗肿瘤效应的间接机制。 我们的实验结果显示rhCD40L影响MDA一MB一231、MDA一MB一35生长抑制和/或凋亡，同时thCD40L可提高肿瘤细胞对化疗药物(阿霉素、轻基喜树碱)和细胞因子(IFN一Y)的敏感性。在本实验中，单用thCD40L、化疗药物、IFN-Y仅导致肿瘤细胞的部分生长抑制，而thCD40L联合化疗药物或IFN一Y则导致更有效的肿瘤生长抑制。细胞周期的检测结果显示MDA一MB一435、MDA一MB一231分别在CD40激发后48、72hr进入Gl期阻滞，不同的细胞周期阻滞的机制尚不完全清楚，推测与细胞生长周期或不同的细胞周期蛋白激酶有关。thCD40L对MDA一MB一231、MDA一MB一35的生长抑制随着thCD40L剂量的增加而增加，这种抑制作用不仅与细胞周期阻滞有关，还与细胞凋亡有关。Pl一A刀nexinV荧光标记方法的结果表明，MDA一MB一35、MDA一MB一231在CD40激发后48hr即出现不同程度的凋亡，MDA一MB一435比MDA一MB一231凋亡显着，这与MDA一MB一35、MDA一MB一231分别在CD40激发后48、72hr进入Gl期阻滞结果相一致，正是Gl期阻滞使得肿瘤细胞不能进入正常的细胞周期而发生细胞凋亡。在基因转录水平上，CD40分子激发使得MDA一MB一435、MDA一MB一231中B瓦习BCL一XL的比率提高。这与早先的研究结果相一致，亦即相对于单独BAX和BCL一XL，B瓦X/BCL一XL的比率与细胞的存活或凋亡更直接相关。CD40分子的激发或配基化可增强肿瘤细胞对化疗药物和细胞因子的敏感性，这为在针对CD40分子靶向治疗肿瘤时，降低临床用药剂量，避免由于大量运用化疗药物而带来的毒副作用提供了实验依据。同时thCD40L分子与化疗药物、细胞因子的协同作.用也为降低rhCD40L的使用剂量避免rhCD40L对相应的全身影响提供了理论基础。 MDA一MB一435细胞高表达CD95分子，CD40信号活化后，尽管没有检测到膜型TNF的改变，但CD120a(TNF甩)、CD95L表达增加，提示该细胞凋亡可能通过CD95(Fas)路径介导凋亡信号，从而引起B瓦X/BCL~XL的比率改变参与对肿瘤细胞生长抑制的调控。MDA一MB一231没有明显的细胞表型改变，我们推测与CD4O信号活化激发的TRAFs谱改变有关。这也表明尽管同属乳腺癌细胞，但不同的细胞对
参考文献：
[1]. 人OX40L转基因细胞的构建与单克隆抗体的研制及其生物学功能的研究[D]. 王勤. 苏州大学. 2004
[2]. OX40转基因细胞的构建及鼠抗人OX40激发型单克隆抗体的研制[D]. 孙建军. 苏州大学. 2004
[3]. 共刺激分子CD40/CD40L和OX40/OX40L在乳腺癌中的表达及其生物学意义[D]. 施勤. 苏州大学. 2003