邱勤业 胡汉生 范震波 曾勉东 李远辉 邓星海 广州医科大学附属第三医院 广东 广州 ５１０１５０ 资助课题:广东省自然科学基金项目,项目编号:S２０１３０１００１１５３０;文件编号:粤科基办字(２０１３)３号
【摘要】 目的 检测血中骨转移相关肿瘤标志物,为肺癌骨转移早期诊断提供理想的动物模型.方法:６周龄雄性SD大鼠２０只,随机分为PBS对照组和观察组,在大鼠左后肢胫骨平台下分别注射PBS溶液和人肺腺癌A５４９细胞.造模后第１５天进行影像学测定并取材,评估骨质缺损程度,HE染色观察肿瘤形态,并通过检验学指标评估骨破坏程度.结果:观察组大鼠体质量逐渐下降,对照组大鼠体重均缓慢增加.２周时观察组大鼠左后肢的活动功能已开始受到影响.显微CT和病理染色显示观察组大鼠胫骨平台破坏严重,呈明显的溶骨性表现,而PBS组大鼠未见骨结构改变.与PBS组相比,观察组大鼠血中BGP、ET－１、PGE２含量明显升高(P＜０．０１),有显著统计学差异.结论:利用人肺腺癌A５４９细胞接种于具有正常免疫功能的SD大鼠体内建立肺癌骨转移模型,同时检测血中BGP、ET－１、PGE２含量变化,为肺癌骨转移早期诊断提供支持. 【关键词】 骨转移瘤;非小细胞肺癌;模型/大鼠;肿瘤标志物【中图分类号】R７３【文献标识码】B 【文章编号】１００８－６３１５(２０１５)１２－０５９８－０２
肺癌是目前发病率最高的恶性肿瘤[１－３].骨转移瘤常引起顽固性疼痛、病理性骨折和神经压迫等并发症,严重影响患者的生存和生活质量[４－６].由于肺癌骨转移机制的复杂,临床治疗手段有限疗效不佳动物模型的建立就显得尤为重要.本实验将人肺腺癌A５４９细胞接种于具有正常免疫功能的SD大鼠体内,建立肺癌骨转移模型,同时检测血中骨转移相关肿瘤标志物BGP、ET－１、PGE２,为肺癌骨转移早期诊断提供理想的动物模型.
１ 材料与方法
１．１ 主要试剂和材料 本实验使用了人肺癌细胞系,A５４９细胞,购自中国科学院上海细胞库,用含１０％ 胎牛血清的１６４０培养液(含１００U/ml青霉素,１００Lg/ml链霉素)于３７℃、５％CO２及饱和湿度的培养箱中维持培养.实验动物为SPF级SD大鼠３０只,雄性,６周龄,体重２００±２０g.１．１．２ 仪器设备 C０２培养箱为SANYO 产品,型号为MCO－１８AIC;超净工作台由苏州净化设备有限公司生产,型号为SW －CJ－２G;显微镜为UOLYMPS产品,型号BH２;美国ThermoScientificULT－１３８６－３V 超低温冰箱;小动物气体麻醉机为MatrxVMR 型;microCT为瑞士SCANCOμCT８０ 型;γ放射免疫计数器为安徽中科中佳科学仪器有限公司GC－１２００型等. １．２ 方法
１．２．１ 动物模型建立、分组及给药 取对数生长期的A５４９肺癌细胞,经胰酶消化后,加入不含血清１６４０培养液调整细胞浓度为１×１０７个/ml.６周龄雄性SD大鼠２０只,随机分为PBS对照组和观察组.大鼠经气体麻醉机麻醉后,取仰卧位固定于操作台上,左后肢褪毛,消毒左侧胫骨上皮肤.将胫骨上段皮肤切开lcm 大小口,分离开肌肉暴露出胫骨骨面,同时避免损伤血管神经.用２０ml注射器针头在胫骨骨面穿刺打孔后,用１０ul微量进样器深刺入骨髓腔, 观察组大鼠缓慢注入２００ul含１０７个A５４９肺癌细胞混悬液,对照组大鼠缓慢注入２００ulPBS溶液,然后迅速用无菌骨腊封住针孔,用生理盐水清洗创口缝合皮肤,创口处做防感染处理.待其苏醒后送回笼中.术后３天每天腹腔注射青霉素１万U/只.每天观察小鼠生存状态及接种部位有无变化. １．３ 观察指标１．３．１ 一般观察 观察大鼠进食及精神状态,分组前及实验结束前隔２天称重一次.
１．３．２ 大鼠疼痛行为观察 观察自由行走痛行为评分和丙酮刺激引发缩足反应时间.缩足反应时间的确定[６]:室温保持于(２０＋１)℃,吸取２０ul丙酮,滴于大鼠左侧后肢足掌,记录出现缩足反应的时间,每隔５min进行１次,共５次,取平均值.１．３．３ 显微CT摄片 造模１５天后处死,取各组大鼠的左后肢,置于４％的多聚甲醛中,固定７２h.用水冲洗干净,固定于支架上进行microCT图像采集.１．３．４ 骨组织病理学观察 造模１５天大鼠处死后将取血后的大鼠左侧后肢剪下,将胫骨分离修剪,保留少许肌肉组织.用１０％中性福尔马林固定１周, 流水冲洗１天,再用１０％硝酸脱钙３天,流水冲洗１天,脱水,石蜡包埋常规切片,片厚４~６um,HE染色,光镜下观察肿瘤生长和骨结构的破坏情况. １．４ 肿瘤标志物检测 放射免疫法(RIA)检测大鼠血中BGP、ET－１、PGE２ 含量１．４．１ 血清骨钙(BGP):抽取适量腹腔静脉血,将其注入未加任何抗凝及促凝成分的试管中,静置,待凝固后,４℃３０００rpm 离心,１０min,分离血清,２０℃冰箱保存待测.测定前,使样本置于室温中复融,再次４℃３０００rpm 离心,５min,取上清测定.
１．４．２ 血浆内皮素－１(ET－１):抽取适量腹腔静脉血,将其注入含７．５％EDTA－Na２和抑肽酶的试管中,混匀,４℃ ３０００rpm 离心,１０min,分离血清,２０℃冰箱保存待测.测定前,使样本置于室温中复融,再次４℃３０００rpm 离心,５min,取上清测定.１．４．３ 鼠血浆前列腺素E２(PGE２):抽取适量腹腔静脉血,将其注入含２％EDＧTA－Na２和抑肽酶抗凝管中,４℃ ３０００rpm 离心,１０min,分离血清,２０℃冰箱保存待测.测定前,使样本置于室温中复融,再次４℃３０００rpm 离心,５min,取上清测定. ２ 统计方法采用SPSS１７．０软件对数据进行统计分析,计量资料用x±s表示,采用t 检验比较其间差异,以P＜０．０５为差异有统计学意义.
３ 结果３．１ 荷瘤大鼠生长情况:在肺癌细胞A５４９接种后７d,观察组肉眼可观察大鼠的左后肢接种处肿胀,呈球状或不规则形状,并随时间的延长而逐渐突出增大,至２周时已开始影响左后肢的活动功能(见图１).
４ 讨论
非小细胞肺癌并骨转移临床上多见.肺癌骨转移的防治已成为当前恶性肿瘤治疗的一个重点.如何建立可重复性强、周期短、生长一致性好的肺癌骨转移动物模型便成为了学者们的探索重点.肺癌骨转移性动物模型的制作方法有左心室注射法,细胞系原位接种形成自发性骨转移法和局部注射制作骨转移,模型法.骨钙素由成骨细胞分泌产生,是骨中最丰富的非胶原蛋白,具有骨代谢调节激素作用,在骨转运活动增高时,BGP合成释放增加,能精确反应体内骨的形成过程,是反映骨代谢的重要指标.骨结构的破坏时会产生一些细胞因子如血浆内皮素－１、前列腺素E２,致敏周围神经末梢增加了机体对痛觉刺激的敏感性.肺癌骨转移模中血中BGP、ET－１、PGE２含量的变化, 反映骨代谢异常和骨癌痛发生的致痛物质,加上ECT和X线的联合检测可望早期发现肺癌骨转移,及早指导临床进行针对性治疗,对于提高患者生活质量,延长生存期具有重要意义.参考文献[１] Hanahan D,WeinbergRA．Hallmarksofcancer:thenextgeneration．Cell,２０１１,１４４(５):６４６－６７４．[２] InfanteMV,PedersenJH．Screeningforlungcancer:arewethereyet?[ CurrOpinPulm Med,２０１０,１６(４):３０１－３０６． ３] KatakamiN．Lungcancerwithbonemetastasis．GanToKagakuRyoho．[ ２００６,３３(８):１０４９－１０５３． ４] 赵志勇,周予兰,王伟．血清骨钙素测定在肺癌骨转移诊断中的价值．检验医学,２００７,２２(４):４８４．４８５ [５] WinstonC．V．Parris．天津:天津科学技术出版社,２００３． [６] 谭煌英,于莉莉,高福云,等．大鼠骨癌痛模型的建立及组织学研究．癌症进展杂志,２００５,３(１):７５－７９
论文作者:邱勤业 胡汉生 范震波 曾勉东 李远辉 邓星海
论文发表刊物:《中国综合临床》2015年12月供稿
论文发表时间:2016/3/3
标签：肺癌论文; 大鼠论文; 后肢论文; 骨转移论文; 细胞论文; 胫骨论文; 模型论文; 《中国综合临床》2015年12月供稿论文;