关于肺泡Ⅱ型上皮细胞参与肺间质纤维化的探讨

高圣堂^[1]1996年在《关于肺泡Ⅱ型上皮细胞参与肺间质纤维化的探讨》文中进行了进一步梳理特发性肺间质纤维化(IPF)表现为肺间质的弥漫性纤维化及肺组织正常结构的破坏，病因不明，发病机理尚未清楚。研究表明肺内的巨噬细胞及淋巴细胞的浸润为其炎症过程中的特点之一，而对肺泡上皮细胞在此过程中的作用较少涉及。本课题通过对博莱霉素、肺泡巨噬细胞条件培养基(AMCM)及博莱霉素刺激的肺泡巨噬细胞条件培养基(BMCM)，对肺泡Ⅱ型上皮细胞表达单核细胞趋化蛋白—1(MCP—1)影响的观察，以期对IPF病程中肺泡Ⅱ型上皮细胞的作用进行探讨。同时为了模拟体内多种产物共同作用的情况，进一步观察了上述不同条件下肺泡Ⅱ型上皮细胞培养上清对单核细胞的趋化作用，以更好地了解在IPF时，肺泡Ⅱ型上皮细胞产物对肺泡巨噬细胞聚集的影响。通过研究发现，肺泡Ⅱ型上皮细胞有基础量的MCP—1mRNA表达，在博莱霉素刺激后，表达增加约46％，在AMCM刺激后，表达增加约260％，在BMCM刺激后，表达增加最多，约为307％。在正常情况下，肺泡Ⅱ型上皮细胞培养上清对单核细胞有一定趋化作用，在博莱霉素刺激后，趋化作用增加约60％，在AMCM刺激后，趋化作用约增加143％，而在BMCM刺激后，趋化作用增加232％。以上结果说明，肺泡Ⅱ型上皮细胞参与了炎症过程的调节。通过细胞产物的相互作用，肺泡Ⅱ型上皮细胞与

许朝霞^[2]2007年在《化纤汤对博莱霉素致大鼠肺纤维化干预作用的实验研究》文中研究说明目的：肺间质纤维化是以弥漫性肺泡炎和肺泡结构紊乱最终导致肺间质纤维化为主要特征的疾病。目前其发病机制尚未完全阐明，又无确切有效的药物治疗。探讨中医药对肺纤维化的防治具有广阔的前景和深远的意义。本课题采用大鼠一次性气管内滴注博莱霉素法造模，通过观察大鼠肺组织的形态学变化、肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡率变化、血清中IL-6和TNF-α的表达水平、肺组织中CTGF的表达、肺组织匀浆中SOD和GSH-PX的活性及MDA的含量，来探讨肺间质纤维化的发病机制，并观察具有“益气通阳、行气活血化痰”功效的化纤汤对这些指标的影响，以探讨化纤汤对大鼠肺纤维化的保护作用及可能机制，为寻求中医中药对肺纤维化的防治进行实验研究。方法：健康Wistar大鼠240只，体重180-220克，随机分为正常对照组(A组)、模型组(B组)、强的松干预组(C组)、化纤汤大剂量(D组)、中剂量组(E组)、小剂量(F组)干预组共6组。A、B、C、D四组每组各48只(其中24只用于肺泡Ⅱ型上皮细胞的提取)，E、F组各24只。采用一次性气管内滴注博莱霉素(5mg／kg·bw)法造模，各组均于造模后第二天开始灌胃给药。C组每日一次给予醋酸强的松混悬液(0.32mg／ml)灌胃，D、E、F组每日一次给予化纤汤(浓度分别是2g／ml、1g／ml、0.5g／ml)灌胃，A、B组每日给予一次等容积的生理盐水灌胃，其中强的松和化纤汤用量相当于成人常用量，按体表面积折算。分别于第7、14、28天随机处死A、B、C、D四组的大鼠各8只，取材用于肺泡Ⅱ型上皮细胞的分离和纯化；其余各组大鼠亦于第7、14、28天随机处死8只，用于形态学观察及血清、组织匀浆的制备。①在光镜及电镜下观察肺组织病理形态学的变化及超微结构的改变；②用流式细胞仪检测肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡率的变化情况。③用ELISA法检测血清中IL-6、TNF-α表达水平的变化；④用免疫组化SABC法检测肺组织中CTGF的表达；⑤分别用TBA法和比色法检测肺组织匀浆中SOD和GSH-PX的活性及MDA的含量。结果：①肺大体形态改变：各时间点，A组大鼠双肺呈粉红色，表面光滑，弹性好。B组，第7天，双肺见密集的点状出血灶样瘀斑，肺体积增大；第14天，双肺呈灰白色，局部可见大小不等的结节样改变及陈旧性出血点，肺组织较硬；第28天，双肺苍白，体积缩小，触及较硬，表面结节样改变及条索状凹沟。与B组比较，第7天时，C、D、E、F组两肺外观病理变化明显好于B组，两肺稍暗红，弹性可，其中D、C、E组明显好于F组；第14-28天，D、E组大部分动物两肺颜色稍暗，弹性尚可，偶可见部分肺叶有散在的点状灰色斑块，F、C与B组病变相近。②形态学改变：第7天，B组大鼠肺泡壁增厚，伴有炎性细胞浸润，间质内成纤维细胞增多，病灶内肺泡萎缩，肺泡内大量炎性细胞浸润；第14天，肺泡间隔明显增宽，成纤维化和胶原基质明显增多；第28天，肺泡结构破坏，肺泡壁显著增厚，肺间质纤维化瘢痕形成，毛细血管腔闭塞。超微病理示：B组大鼠第7天，肺泡Ⅱ型上皮细胞增生、肿胀，线粒体肿胀，嵴缩短、断裂或消失，甚至空泡样变性，板层小体数量增多，但是多呈空泡样，细胞微绒毛破坏、稀少或消失；第14-28天，肺泡Ⅱ型细胞数量较第7天减少，核形态不规则，线粒体嵴断裂或消失，大多呈空泡样变性，数量明显减少，板层小体量也减少，大多呈空泡样变。与B组比较，这些病理变化，第7天，D组改善最明显，其次为C、E、F组；第14天，D组改善最明显，其次为E、C、F组；第28天，D组改善最明显，其次为E、F、C组，其中第7天、28天肺泡炎、肺纤维化Szapiel分级比较具有显著性差异(P＜0.01或0.05)。③与A组比较，各时间点，各组大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡率显著升高(P＜0.05)。与B组比较，第7天时，C、D两组凋亡率均有显著降低(P＜0.05)；第14-28天，C组肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡率有所下降，但统计学无显著差异(P＞0.05)，D组肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡率有显著减少(P＜0.05)。④与A组比较，各时间点各组大鼠血清中TNF-α、IL-6水平明显增高。与B组比较，第7天，C、D、E、F各组大鼠血清中TNF-α、IL-6的水平显著降低(P＜0.01或0.05)；第14-28天，D、E组大鼠血清中TNF-α、IL-6水平明显降低(P＜0.01或0.05)，C、F组虽有降低，但比较差异无统计学意义(P＞0.05)。⑤与A组比较，各时间点各组大鼠肺组织中CTGF的表达明显增高(P＜0.01)。与B组比较，各时间点，C、D、E各组CTGF表达均低于B组(P＜0.01或0.05)，F组低于B组，但比较差异无统计学意义(P＞0.05)。⑥与A组比较，各时间点，B、C、D、E、F各组大鼠肺组织中GSH-PX、SOD的活性均降低，MDA的含量均增高，存在显著差异(P＜0.01或0.05)。与B组比较，各时间点，D、E组大鼠GSH-PX与SOD的活性均升高，MDA含量均降低，存在显著差异(P＜0.01或0.05)；第7-14天，C组大鼠GSH-PX与SOD的活性均升高，MDA含量均降低，存在明显差异(P＜0.05)，第28天，C组与B组无明显差异(P＞0.05)。各时间点，F组与B组比较无明显差异(P＞0.05)。结论：①模型组病理特征变化与文献报道一致，说明造模成功；化纤汤对肺纤维化发展各个阶段的病理变化有明显的改善作用，且大、中剂量组明显优于小剂量组。②ATⅡ细胞过度凋亡可能促进肺泡炎症反应并导致炎症后纤维增生；化纤汤对ATⅡ细胞可能有抗凋亡作用，可能通过抑制ATⅡ细胞的过度凋亡而起到保护和修复肺泡结构及功能的作用，从而减轻BLM对大鼠肺组织的损伤，延缓并减轻肺纤维化的发生发展。③化纤汤能降低肺纤维化大鼠血清中TNF-α、IL-6水平，可能通过下调上述细胞因子水平而对博莱霉素致大鼠的肺损伤起保护作用，减轻肺纤维化形成的程度，化纤汤大、中剂量组疗效优于小剂量组。④CTGF可能在肺泡炎、肺纤维化的发生发展过程中起着重要的作用，其表达程度与肺纤维化的程度密切相关；化纤汤可能通过抑制CTGF的表达对肺组织起着修复及保护作用。⑤化纤汤能调节肺纤维化大鼠体内自由基水平，减轻自由基对肺组织结构的氧化损伤，而且化纤汤大、中剂量组的作用优于小剂量组。

刁瑞英^[3]2008年在《Ⅳ型胶原基因高表达在放射性肺损伤组织重塑中的作用及肺纤维化防治研究》文中认为目的放射性肺纤维化是肺组织遭受放射损伤后继发引起的肺泡结构无效重建的终末阶段,其详细的启动机制至今未明。在放射性肺损伤早期,Ⅳ型胶原表达增加与肺纤维化启动过程似有一定的联系。本研究拟探讨放射性肺损伤后,Ⅳ型胶原、MMPs及TIMPs参与肺损伤重建过程以及与早期肺纤维化启动之间的内在联系,阐明放射性肺纤维化启动的机制;并应用PPAR-γ激动剂Rosiglitazone和Pioglitazone探讨其对放射性肺损伤早期肺重塑的干预。方法采用广谱基因芯片筛选放射性肺损伤早期相关基因;通过实时荧光定量PCR和免疫组织化学方法检测Ⅳ型胶原、MMP-2、MMP-9及TIMP-1、TIMP-2在mRNA和蛋白水平的表达;应用MTT、ELISA、明胶酶谱分析和免疫细胞化学检测60Coγ射线、照后大鼠血清、巨噬细胞条件培养液(CMAM)促肺成纤维细胞(Fb)增殖和表达IV型胶原和MMP-9蛋白的能力,以及Pioglitazone对60Coγ射线照射和TGF-β1促Fb增殖的拮抗作用;原代分离经照射和Rosiglitazone处理的大鼠肺泡Ⅱ型细胞(AT-Ⅱ)、间质细胞(MA和Fb);收集肺泡灌洗液(BALF)中的AM;应用酶谱分析法、RT-PCR、免疫组化和Western Blot分别检测肺组织中IV型胶原、MMP-9、MMP-2、α-SMA和TIMP-1的表达变化。结果(1)基因芯片筛选发现:C57小鼠肺内IV型胶原基因在照后1～4w呈现明显高表达;(2)实时定量PCR基因检测:Wistar大鼠Ⅳ型胶原表达于照射后1w时升高,2w时下降;MMP-2在2w时达高峰,与IV型胶原成相反变化趋势;MMP-9呈明显的升高、下降、再升高趋势,与IV型胶原变化趋势相同;TIMP-1表达较低,各时间点之间无明显差异;TIMP-2呈现升高、降低、升高趋势,与MMP-2表达相反;(3)免疫组化-图像分析:肺组织Ⅳ型胶原含量于1w即明显增加,2w开始下降;MMP-2含量变化呈现由低至高,变化趋势与IV型胶原呈相反关系;MMP-9变化趋势同IV型胶原,但程度明显高于后者;TIMP-1于2w时轻度升高,与MMP-9趋势相反。(4)1～7Gy照射能促进肺Fb增生;5和7Gy照射能促进Fb合成MMP-9,但不能促进IV型胶原合成;照后大鼠血清和CMAM不但能促进Fb增生和MMP-9合成,也能促进Fb合成和释放IV型胶原;受照后1w大鼠肺组织出现IV型胶原沉积;Ⅳ胶原可促AM合成分泌具有活性的明胶酶;(5)在细胞水平上,Pioglitazone呈剂量依赖性抑制照射对Fb的促增殖作用,抑制其转化为肌成纤维细胞(MFb),并诱导Fb凋亡,细胞培养上清中明胶酶活性增强;在动物水平上,Rosiglitazone能明显减轻照后肺组织的实变程度,抑制肺Fb增殖和转化,下调IV型胶原和TIMP-1表达,上调MMP-2和MMP-9表达。结论放射性肺损伤的结局是形成肺纤维化,在纤维化形成之前,受损的肺组织经历了一个损伤-修复-损伤的无效性重建阶段,由于此过程伴随着细胞生长因子和其它生物活性物质参与,使得此种修复失去应有的意义反而对肺组织造成进一步的损害,启动了肺纤维化的发生。Ⅳ型胶原、MMP-2和MMP-9及其抑制物TIMPs参与放射性肺损伤早期的无效重建过程,MMP-2和MMP-9具有降解IV型胶原作用;IV型胶原降解障碍与肺纤维化启动有一定关系;AM因其能释放多种肺损伤相关因子而在早期肺重塑中具有重要作用。PPARγ有望成为放射性肺纤维化机理研究的一个新靶点,而其人工配体噻唑烷二酮类药物-Rosiglitazone和Pioglitazone有可能成为一种新的对抗和防治放射性肺纤维化的药物,本探索为临床有效防治放射性肺损伤及肺纤维化提供了新的理论依据和措施

钱力^[4]2018年在《特发性肺纤维化中TGF-β1介导的DNA甲基转移酶致端粒酶活性异常及其干预研究》文中研究说明特发性肺纤维化(Idiopathic pulmonary fibrosis,IPF)是一种以进行性呼吸困难、运动耐力下降、肺实质的间质性浸润及肺限制性肺通气功能障碍为主要特征的慢性进展性纤维化性间质性肺炎,呼吸衰竭是IPF患者死亡的根本原因,确诊后的平均中位生存期3-5年,目前除了肺移植以外尚无任何有效的治疗方法。该病主要是老年人的疾病,好发于成年男性,确诊时年龄多为65岁以上。目前已有证据表明,IPF和衰老之间存在相关性,是一种多种原因及途径共同作用的衰老相关性疾病,端粒酶及DNA甲基化均作为细胞衰老相关因素,参与了IPF的发生发展。IPF病情的发生发展中,TGF-β可以导致端粒酶异常,而DNA甲基化可能参与其中。TGF-β和端粒酶作为重要的分子共同参与了IPF的进程,可能使细胞不断发生细胞复制性衰老的恶性循环。研究表明TERT和DNMT3a、DNMT3b分别被认为是端粒酶活性及DNA甲基化的关键限速因子,可以分别作为反映端粒酶活性及DNA甲基化水平的指标对端粒酶和DNA甲基化进行研究。那么在IPF中TGF-β1是否可以导致端粒酶活性及DNA甲基转移酶发生改变?如何发生变化?有无相关干预措施?本课题以IPF中TGF-β1引起端粒酶活性与DNA甲基转移酶的变化及两者的相互关系为研究切入点,探讨其在IPF发病中的作用及干预措施。首先研究IPF患者和正常人群外周血中TERT、DNMT3a、DNMT3b及TGF-β1的表达情况,证实IPF患者和正常人群中TERT、DNMT3a、DNMT3b及TGF-β1的表达存在差异;之后在动物实验中进一步研究年龄因素对肺纤维化小鼠TERT、DNMT3a、DNMT3b及TGF-β1表达的影响,证实上述指标的变化及动物模型病变程度与年龄因素相关;最后进行细胞实验验证,研究TGF-β1诱导的A549人肺泡Ⅱ型上皮细胞TERT及DNMT3a、DNMT3b的表达异常、相互作用及干预措施。证实TGF-β1通过DNA甲基化调控TERT表达并提出相关干预措施。共分为三个部分,六个实验。第一部分IPF患者外周血TERT、DNMT3a、DNMT3b及TGF-β1表达研究实验一IPF患者外周血TERT、DNMT3a、DNMT3b及TGF-β1表达研究目的:研究IPF患者中外周血白细胞TERT及外周血血清中DNMT3a、DNMT3b及TGF-β1的表达情况。方法:选择不合并有其他疾病的年龄≧60岁男性IPF患者10名为IPF组,选择没有基础疾病的年龄≧60岁男性10名为对照组,收集临床基本数据,ELISA检测对照组及IPF组血清TGF-β1、IL-1β、IL-6及DNMT3a、DNMT3b蛋白表达的影响;Western Blot法检测对照组及IPF组外周血白细胞TERT蛋白表达的影响。结果:1.IPF组血清TGF-β1、IL-1β、IL-6及DNMT3a、DNMT3b蛋白的表达与对照组相应指标比较均表达升高,P<0.05,差异有统计学意义。IPF组血清IL-1β、IL-6及DNMT3a、DNMT3b的表达与TGF-β1的表达均呈正相关。2.实验组外周血白细胞TERT蛋白相对表达量与对照组相比表达升高,P<0.05,差异有统计学意义。结论:IPF患者外周血血清中TGF-β1、IL-1β、IL-6及DNMT3a、DNMT3b的含量及外周血白细胞TERT的含量均高于正常对照组健康人群。第二部分年龄因素对小鼠肺纤维化模型TERT、DNMT3a、DNMT3b及TGF-β1表达影响的研究实验二年龄因素对小鼠肺纤维化模型中TERT及TGF-β1表达影响的研究目的:研究小鼠肺纤维化过程中年龄因素对TERT活性变化的影响,探讨TGF-β1、IL-1β及IL-6在IPF过程中的变化规律及意义。方法:128只10-12周龄雄性C57BL/6小鼠,无特殊病原体SPF级,饲养至20周龄时,随机分为青年肺纤维化模型组(A组),青年正常对照组(B组),老年肺纤维化模型组(C组),老年正常对照组(D组),每组32只。A组小鼠气管内注入博莱霉素(5mg/kg)制造肺纤维化模型;B组气管内注入同等剂量生理盐水进行对照,C组和D组饲养至26周龄后分别对应使用A组和B组的造模方法制造老年肺纤维化组模型和老年正常对照组模型。造模后的第7、14、21、28天分别在A组、B组、C组和D组中每组随机抽取8只小鼠,用腹主动脉采血法处死后,留取肺组织标本及血液标本待测。小鼠肺组织HE染色及Ashcroft评分评定肺纤维化程度;Masson染色观察小鼠肺组织胶原分布;小鼠肺组织E-Cad、Vimentin、α-SMA免疫组化及灰度值检测;ELISA法检测小鼠血浆中TGF-β1、IL-1β、IL-6蛋白的含量;Western Blot法检测小鼠肺组织TERT蛋白含量。结果:1.向小鼠气管注入BLM(5mg/kg)制造小鼠肺纤维化模型造模成功。与青年肺纤维化小鼠相比,老年肺纤维化模型组小鼠纤维化程度更加严重,P<0.05,差异有统计学意义。2.与对照组小鼠相比,模型组小鼠E-Cad表达降低,α-SMA及Vimentin表达增高,P<0.05,差异有统计学意义,三者随病程进展而变化明显,三者各自差异在对照组28天、模型组14天、模型组28天较为显著;与青年模型组小鼠相比,老年模型组小鼠各相同造模时间点E-Cad阳性率低,α-SMA及Vimentin阳性率高,P<0.05,差异有统计学意义。3.A组与C组血清中TGF-β1、IL-1β及IL-6含量高于B组和D组,三者在A组与B组、C组与D组同一时间点两两比较P<0.05,差异具有统计学意义;但在A组与C组、B组与D组同一时间点两两比较P>0.05,差异不具有统计学意义。4.与对应时间点B组与D组相比,A组与C组第7天、第14天、第21天和第28天肺组织TERT蛋白相对表达量升高,P<0.05,差异具有统计学意义;与各自第7天、第21天和第28天表达量相比,A组与C组第14天肺组织TERT蛋白相对表达量升高,P<0.05,差异具有统计学意义。5.与对应时间点B组和A组相比,D组和C组第14天和第28天肺组织TERT蛋白相对表达量升高,P<0.05,差异具有统计学意义。B组第14天肺组织TERT蛋白相对表达量与其第28天相比表达升高,D组第14天肺组织TERT蛋白相对表达量与其第28天相比表达升高,P>0.05,差异无统计学意义。6.A组第14天肺组织TERT蛋白相对表达量、A组第28天肺组织TERT蛋白相对表达量、B组第14天或28天肺组织TERT蛋白相对表达量之间三者两两比较,P<0.05,差异具有统计学意义;C组第14天肺组织TERT蛋白相对表达量、C组第28天肺组织TERT蛋白相对表达量、D组第14天或28天肺组织TERT蛋白相对表达量之间三者两两比较,P<0.05,差异具有统计学意义。7.C组和A组肺组织TERT蛋白相对表达量均在第14天达到高峰,第28天明显下降。但与A组相比,C组TERT蛋白相对表达量变化波动大。结论:1.小鼠肺纤维化过程中,肺组织E-Cad含量减少,α-SMA及Vimentin含量升高;老年小鼠肺纤维化程度更严重;肺纤维化小鼠血清中TGF-β1、IL-1β及IL-6含量明显升高,TGF-β1、IL-1β及IL-6参与了肺纤维化的发生发展。2.肺纤维化小鼠肺组织TERT的活性变化是先升高再降低,老年肺纤维化小鼠肺组织TERT变化波动程度大,年龄因素可能通过影响小鼠肺纤维化模型中肺组织TERT的活性来改变小鼠肺纤维化病变程度。实验三年龄因素对小鼠肺纤维化模型中DNMT3a、DNMT3b及CDH1表达影响的研究目的:研究小鼠肺纤维化过程中年龄因素对DNMT3a、DNMT3b及CDH1表达的影响。方法:32只10-12周龄雄性C57BL/6小鼠,无特殊病原体SPF级,饲养至20周龄时,随机分为青年肺纤维化模型组(A组),青年正常对照组(B组),老年肺纤维化模型组(C组),老年正常对照组(D组),每组8只,A组小鼠气管内注入博莱霉素稀释液制造肺纤维化模型;B组气管内注入同等剂量生理盐水进行对照,C组和D组饲养至26周龄后分别对应使用A组和B组的造模方法制造老年肺纤维化组模型和老年正常对照组模型。麻醉和造模方法与实验二中小鼠麻醉和造模方法相同;C组和D组饲养至26周龄后分别对应使用A组和B组的造模方法制造老年肺纤维化组模型和老年正常对照组模型。A组、B组、C组和D组每组小鼠于造模后的第28天分别采用腹主动脉采血法处死,留取肺组织标本待测。小鼠肺组织HE染色及Ashcroft评分评定肺纤维化程度;小鼠肺组织Masson染色观察胶原分布;Western Blot法检测小鼠肺组织DNMT3a、DNMT3b和CDH1的蛋白含量。结果:1.与B组相比,A组DNMT3a、DNMT3b蛋白表达明显升高,P<0.05,差异有统计学意义;与D组相比,C组DNMT3a、DNMT3b蛋白表达明显升高,P<0.05,差异有统计学意义;与A组相比,C组DNMT3a、DNMT3b蛋白表达明显升高,P<0.05,差异有统计学意义;与B组相比,D组DNMT3a、DNMT3b蛋白表达无明显变化,P>0.05,差异无统计学意义。2.与B组相比,A组CDH1蛋白表达明显降低,P<0.05,差异有统计学意义;与D组相比,C组CDH1蛋白表达明显降低,P<0.05,差异有统计学意义;与A组相比,C组CDH1蛋白表达明显降低,P<0.05,差异有统计学意义;与B组相比,D组CDH1蛋白表达无明显变化,P>0.05,差异无统计学意义。结论:肺纤维化小鼠肺组织DNMT3a、DNMT3b的表达升高,CDH1表达降低,老年肺纤维化小鼠较青年肺纤维化小鼠更明显。年龄因素可能通过影响小鼠肺纤维化模型中肺组织DNMT3a、DNMT3b及CDH1的表达来改变肺纤维化病变程度。第三部分TGF-β1诱导的A549人肺泡Ⅱ型上皮细胞TERT及DNMT3a、DNMT3b的表达异常及干预措施的研究实验四TGF-β1对A549人肺泡Ⅱ型上皮细胞DNMT3a、DNMT3b、CDH1、TERT表达影响的研究目的:研究TGF-β1对A549人肺泡Ⅱ型上皮细胞DNMT3a、DNMT3b、CDH1、TERT及IL-1β和IL-6表达的影响。方法:培养A549人肺泡Ⅱ型上皮细胞,分为对照组、TGF-β1 2μmol/L干预组、TGF-β1 5μmol/L干预组和TGF-β1 10μmol/L干预组。β-gal染色法检测TGF-β1梯度刺激对A549人肺泡Ⅱ型上皮细胞衰老的影响;ELISA检测TGF-β1梯度刺激对A549人肺泡Ⅱ型上皮细胞IL-1β、IL-6蛋白表达;Quantitative Real-time PCR检测TGF-β1梯度刺激对A549人肺泡Ⅱ型上皮细胞IL-1β、IL-6 m RNA的表达;观察TGF-β1对A549人肺泡Ⅱ型上皮细胞细胞形态和胶原蛋白表达的影响;Quantitative Real-time PCR检测TGF-β1对A549人肺泡Ⅱ型上皮细胞COL-I、FN1、Tensin-C m RNA的表达;Quantitative Real-time PCR检测TGF-β1对A549人肺泡Ⅱ型上皮细胞DNMT3a、DNMT3b、CDH1及TERT m RNA的表达;Western Blot法检测TGF-β1对A549人肺泡Ⅱ型上皮细胞TERT蛋白表达的影响。结果:1.正常对照组几乎未出现衰老细胞,干预组细胞衰老百分比随TGF-β1浓度升高而升高。2.TGF-β1 2μmol/L干预组、TGF-β1 5μmol/L干预组及TGF-β1 10μmol/L干预组与对照组相比,A549人肺泡Ⅱ型上皮细胞IL-1β和IL6蛋白及m RNA的表达明显升高,P<0.05,差异有统计学意义;两者随着TGF-β1浓度的升高,表达也进一步升高,TGF-β1 5μmol/L干预组、TGF-β1 10μmol/L干预组与TGF-β1 2μmol/L干预组相比,A549人肺泡Ⅱ型上皮细胞IL-1β和IL6蛋白及m RNA的表达明显升高,P<0.05,差异有统计学意义;但TGF-β1 5μmol/L干预组与TGF-β1 10μmol/L干预组作用相当,P>0.05,差异无统计学意义。3.光镜下观察对照组细胞形态呈典型的上皮细胞样形态,TGF-β1 10μmol/L干预组细胞出现典型的间质细胞样形态,Masson染色后光镜下观察对照组细胞几乎未见蓝色胶原蛋白表达,而TGF-β1 10μmol/L干预组细胞蓝染胶原蛋白表达明显增多,表达范围明显增加。4.TGF-β1 10μmol/L干预组与对照组相比,A549人肺泡Ⅱ型上皮细胞COL-I、FN1、Tensin-C m RNA表达明显升高,P<0.05,差异有统计学意义。5.TGF-β1 10μmol/L干预组与对照组相比,A549人肺泡Ⅱ型上皮细胞DNMT3a和DNMT3b m RNA的表达明显升高,TERT和CHD1基因m RNA的表达明显降低,P<0.05,差异有统计学意义。TGF-β1 10μmol/L干预组与对照组相比,A549人肺泡Ⅱ型上皮细胞TERT蛋白表达明显降低,P<0.05,差异有统计学意义。结论:1.TGF-β1可导致A549人肺泡Ⅱ型上皮细胞发生衰老,促进A549人肺泡Ⅱ型上皮细胞IL-1β、IL6、COL-I、FN1和Tensin-C的表达。2.TGF-β1促进了A549人肺泡Ⅱ型上皮细胞DNMT3a和DNMT3b的表达,抑制TERT和CHD1的表达。实验五TGF-β1对A549人肺泡Ⅱ型上皮细胞TERT启动子活性及DNMT3a、DNMT3b转录因子与TERT启动子结合影响的研究目的:研究TGF-β1对A549人肺泡Ⅱ型上皮细胞TERT启动子活性及DNMT3a、DNMT3b转录因子与TERT启动子结合的影响。方法:培养A549人肺泡Ⅱ型上皮细胞,分为对照组、TGF-β1 10μmol/L干预组。荧光素酶法检测TGF-β1对A549人肺泡Ⅱ型上皮细胞TERT启动子活性的影响;染色质免疫共沉淀法检测TGF-β1对A549人肺泡Ⅱ型上皮细胞DNMT3a和DNMT3b与TERT启动子结合的影响。结果:1.TGF-β1 10μmol/L干预组与对照组相比,A549人肺泡Ⅱ型上皮细胞TERT启动子活性下降,P<0.05,差异有统计学意义。2.TGF-β1 10μmol/L干预组与对照组相比,A549人肺泡Ⅱ型上皮细胞DNMT3a和DNMT3b转录因子与TERT启动子的相对结合量增大,P<0.05,差异有统计学意义。进一步比较DNMT3a和DNMT3b转录因子的富集情况,DNMT3a转录因子的富集比DNMT3b转录因子的富集多,P<0.05,差异有统计学意义。结论:TGF-β1促进了DNMT3a,DNMT3b转录因子与TERT启动子的结合,DNMT3a转录因子与TERT启动子的结合起较大作用。对TERT启动子甲基化水平产生一定影响,进而使TERT启动子活性下降。实验六DNMT3a si RNA干扰与TERT过表达对TGF-β1诱导的A549人肺泡Ⅱ型上皮细胞纤维化及衰老干预作用的研究目的:研究DNMT3a si RNA干扰与TERT过表达对TGF-β1诱导的A549人肺泡Ⅱ型上皮细胞纤维化及衰老的干预作用。方法:培养A549人肺泡Ⅱ型上皮细胞,分为对照组、TGF-β1干预组、TGF-β1干预+DNMT3a si RNA干扰组、TGF-β1干预+TERT过表达组及TGF-β1干预+DNMT3a si RNA干扰+TERT过表达组,对DNMT3a行si RNA干扰;选择慢病毒为载体,进行质粒慢病毒转染对TERT进行过表达处理,TGF-β1干预+TERT过表达组与TGF-β1干预+DNMT3a si RNA干扰+TERT过表达组为质粒慢病毒转染,对照组、TGF-β1干预组与TGF-β1干预+DNMT3a si RNA干扰组行LV-GFP质粒慢病毒空载对照。共聚焦激光扫描荧光显微镜检测各组A549人肺泡Ⅱ型上皮细胞荧光;Masson染色检测各组A549人肺泡Ⅱ型上皮细胞胶原蛋白的表达;Quantitative Real-time PCR检测各组A549人肺泡Ⅱ型上皮细胞COL-I、FN1、Tensin-C m RNA表达的影响;Western Blot法检测各组A549人肺泡Ⅱ型上皮细胞TERT、DNMT3a、DNMT3b和CDH1蛋白表达的影响;β-gal染色法检测各组A549人肺泡Ⅱ型上皮细胞的衰老情况。结果:1.DNMT3a si RNA干扰和TERT过表达成功。2.Masson染色后对照组细胞几乎未见蓝色胶原蛋白表达,而TGF-β1干预组细胞出现大量蓝染胶原蛋白,其表达量及表达范围均明显增加,与对照组相比,P<0.05,差异有统计学意义。TGF-β1干预+DNMT3a si RNA干扰组、TGF-β1干预+TERT过表达组与TGF-β1干预+DNMT3a si RNA干扰+TERT过表达组均有蓝染胶原蛋白表达,三组表达无差别,三组分别与对照组相比,蓝染胶原蛋白表达量及表达范围增加,P<0.05,差异有统计学意义;三组分别与TGF-β1干预组相比,蓝染胶原蛋白表达量及表达范围均较减少,P<0.05,差异有统计学意义。3.TGF-β1干预组与对照组相比,A549人肺泡Ⅱ型上皮细胞COL-I,FN1,Tensin-C m RNA表达明显升高,P<0.05,差异有统计学意义。TGF-β1干预+DNMT3a si RNA干扰组、TGF-β1干预+TERT过表达组与TGF-β1干预+DNMT3a si RNA干扰+TERT过表达组三组的A549人肺泡Ⅱ型上皮细胞COL-I、FN1、Tensin-C m RNA表达升高,三组分别与对照组相比,COL-I、FN1、Tensin-C m RNA表达升高,P<0.05,差异有统计学意义;三组分别与TGF-β1干预组相比,COL-I、FN1、Tensin-C m RNA表达降低,P<0.05,差异有统计学意义。4.TGF-β1干预组与对照组相比,A549人肺泡Ⅱ型上皮细胞DNMT3a、DNMT3b蛋白表达明显升高,TERT、CDH1蛋白表达明显降低,P<0.05,差异有统计学意义。TGF-β1干预+DNMT3a si RNA干扰组、TGF-β1干预+TERT过表达组与TGF-β1干预+DNMT3a si RNA干扰+TERT过表达组三组的A549人肺泡Ⅱ型上皮细DNMT3a、DNMT3b蛋白表达升高,TERT、CDH1蛋白表达降低,三组表达无差别;但分别与TGF-β1干预组相比,三组的A549人肺泡Ⅱ型上皮细胞DNMT3a、DNMT3b蛋白表达降低,TERT、CDH1蛋白表达升高,P<0.05,差异有统计学意义。5.对照组几乎未出现衰老细胞,而TGF-β1干预组出现大量衰老细胞,且衰老细胞的比例最大,而TGF-β1干预+DNMT3a si RNA干扰组、TGF-β1干预+TERT过表达组与TGF-β1干预+DNMT3a si RNA干扰+TERT过表达组这三组均有衰老细胞表达,衰老细胞的比例三组表达无差别,但三组分别与对照组相比,衰老细胞增多及比例增大,P<0.05,差异有统计学意义;三组分别与TGF-β1干预组相比,衰老细胞减少及比例降低,P<0.05,差异有统计学意义。结论:干扰DNMT3a si RNA与过表达TERT均可以减轻TGF-β1对A549人肺泡Ⅱ型上皮细胞致纤维化作用和A549人肺泡Ⅱ型上皮细胞发生衰老的程度。但DNMT3a si RNA干扰与TERT过表达之间没有叠加作用。

杨毅^[5]2009年在《苈桃抗纤方对肺泡Ⅱ型上皮细胞转化的影响及作用机制》文中研究指明研究背景:肺纤维化(pulmonary fibrosis,PF)是以运动性呼吸困难进行性加重,以喘息、气短、干咳、喘憋为临床表现,以限制性通气功能障碍、低氧血症、慢性进行性弥漫性肺间质纤维化为特点的肺间质性疾病。肺纤维化既是多种肺疾病、多种系统性疾病的共同结局,又有无原发疾病的特发性肺间质纤维化。近年来,随着细胞和分子生物学等生命科学理论研究,多种研究手段的应用,从器官、组织、细胞、分子的不同层次,对肺纤维化的发生、诊断、防治的研究不断深入,取得极大的进展。研究表明,肺纤维化是由早期组织损伤、炎症变化发展而来,而肺部受感染或损伤后,肺泡上皮细胞和是最早受到损伤的靶细胞。由于肺泡表面约93-97%的肺泡Ⅰ型上皮细胞为终末细胞,不能进行分裂增殖,故具有增殖分化能力的肺泡Ⅱ型上皮细胞(Alveolar typeⅡcell,ATⅡ)是参与组织损伤修复的主要细胞,所以,最初肺损伤后发生于组织修复时的肺泡Ⅱ型上皮细胞向间质细胞转化(epithelial to mesenchymaltransition,EMT)在肺纤维化发生发展过程中发挥着极其重要的作用。近年来随着对肺纤维化的发病机理的深入研究,无论中、西医均在治疗上取得相当进展。导师在长期的临床实践中,依照经验创立苈桃抗纤方,对肺间质纤维化患者进行雾化治疗,取得了一定的疗效。为了提高它的可信度和可重复性,为临床实践提供更好生命科学理论基础,在本实验中,我们主要研究苈桃抗纤方对肺泡Ⅱ型上皮细胞向问质细胞转化、EMT转化率以及对肺泡Ⅱ型上皮细胞转化过程中相关细胞转导通路的影响,在细胞及分子水平上探讨苈桃抗纤方抗肺纤维化的生物学基础。目的:由于肺泡Ⅱ型上皮细胞向间质细胞转化(EMT)是发生肺纤维化的重要因素,故在本次实验中,我们应用转化生长因子(transforminggrowth factor TGF-β1)诱导人肺上皮细胞系(A549)EMT发生,观察TGF-β1对A549增殖及形态变化的影响,研究苈桃抗纤方雾滴干预后对肺泡Ⅱ型上皮细胞向间质细胞转化的影响,从基于雾化中药制剂影响EMT发生的角度,初步探讨苈桃抗纤方防治肺纤维化的生物学基础。方法:使用不同浓度苈桃抗纤方体外干预A549细胞。免疫组化法检测细胞内TGF-β1的相对含量;通过TGF-β1体外诱导细胞EMT的发生,ELISA法检测细胞角蛋白(cytokeratin)及波形蛋白(Vimentin)表达,计算细胞EMT转化率;Real-time PCR法检测苈桃抗纤方对细胞内Ⅰ型胶原及Ⅲ型胶原mRNA表达的影响;Western Blot检测细胞磷酸化(phosphorylation)Erk1/2的表达。结果:不同浓度苈桃抗纤方体外作用A549细胞48h后,胞内TGF-β1的定量表达,相较正常对照组明显减少(40.35±1.65,37.84±0.95,37.45±0.78 VS 45.13±2.01),(P<0.01)具有显著差异性。TGF-β1体外诱导A549细胞EMT发生后,ELISA检测细胞cytokeratin和vimentin表达显示,相较正常对照组,vimentin阳性表达明显增强,而cytokeratin阳性表达相对减弱;RT-PCR检测表明,A549细胞内Ⅰ型胶原及Ⅲ型胶原mRNA表达显著增强。经不同浓度苈桃抗纤方体外作用诱导EMT成功的A549细胞48h后,与模型组相比,vimentin阳性表达出现不同程度的减弱,而cytokeratin阳性表达则出现不同程度增强;Ⅰ型胶原及Ⅲ型胶原mRNA表达均出现不同程度下调;phosphorylation Erk1/2的表达减弱。结论:苈桃抗纤方可以降低TGF-β1诱导的A549细胞EMT转化率,阻断肺泡Ⅱ型上皮细胞向间质细胞转化,减少肺成纤维细胞的产生,从而抑制肺纤维化的发生,达到抗肺纤维化的作用。其可能机制是通过降低细胞内转化生长因子(transforming growth factor TGF-β1)的释放,干预Ⅰ型及Ⅲ型胶原mRNA表达,影响细胞磷酸化Erk1/2的表达。

谷雨^[6]2013年在《川芎嗪对IPF大鼠脆性位点基因WWOX、FHIT影响的研究》文中提出目的：本研究采用目前较为通用的博莱霉素气管内注射制作的大鼠肺纤维化模型，分离培养肺纤维化大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞，借助于细胞学、分子生物学、免疫组织化学等实验方法，研究该细胞内染色体脆性位点基因WWOX、FHIT表达的改变，为今后开展肺间质纤维化的基因治疗提供理论依据。方法：健康清洁级SD雄性大鼠18只随机分为假手术组、模型组及川芎嗪预防用药组。各组动物适应性喂养一周后分别进行手术。假手术组暴露气管后即缝合切口，模型组及川芎嗪组则经气管缓慢注入博莱霉素（5mg/kg）后同样缝合切口。川芎嗪组于术后第2天开始灌胃给药，给药剂量为20mg·kg~(-1)·d~(-1)。实验期间，大鼠自由饮水和进食，并分别于给药后7d、14d和28d，每组随机取2只大鼠处死，提取肺泡Ⅱ型上皮细胞进行原代培养。对体外培养72h后的肺泡Ⅱ型上皮细胞利用免疫组织化学方法分析WWOX和FHIT蛋白的表达, RT-PCR技术检测WWOX、FHIT基因的改变情况。结果：1、假手术组大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞内WWOX和FHIT蛋白表达均呈现强阳性。与假手术组比较，造模7d后模型组大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞内WWOX和FHIT蛋白表达无显著变化(P＞0.05)。而用药14、28d后，WWOX和FHIT蛋白表达则明显下降(P＜0.05)。川芎嗪组与模型组相比有显著上调(P＜0.05)。2、用药7d后，模型组、川芎嗪组与假手术组WWOX和FHIT基因mRNA表达无明显差异(P＞0.05)，模型组与川芎嗪组相比亦无明显差异(P＞0.05)；用药14d后，模型组WWOX和FHIT基因mRNA表达比假手术组明显降低(P＜0.05)，川芎嗪组比模型组则显著升高(P＜0.05)；用药28d后的结果与用药14d后的结果相似。结论：1、在肺间质纤维化过程中存在着染色体脆性位点基因WWOX和FHIT的改变。2、川芎嗪可以在一定程度上抑制染色体脆性位点基因WWOX和FHIT的改变，从而可以起到一定的防治肺间质纤维化的作用。

李银生^[7]2007年在《姜黄素对大鼠肺纤维化防治作用的实验研究》文中提出研究背景及目的肺纤维化(pulmonary fibrosis，PF)是指由多种病因引起的具有相似病理过程的一类弥漫性肺间质疾病，其病理特征是早期有肺泡结构破坏和弥漫性肺泡炎，继后出现细胞外基质过度沉积，并逐渐演变为弥漫性肺间质纤维化，从而造成肺功能障碍，病人多死于进行性加重的肺纤维化所致的呼吸衰竭。由于发病率逐年增加，发病机制尚未完全明了，缺乏有效的治疗药物，死亡率高。传统的糖皮质激素和细胞毒药物疗效不能令人满意。故寻找行之有效的治疗药物是目前医疗界迫切需要解决的问题。最近研究表明，姜黄素具有广泛的药理作用，如抗炎、抗氧化、抗缺血、抗癌和抗肝纤维化等。为了探讨姜黄素对大鼠肺纤维化的防治作用，本实验采用博莱霉素诱导的大鼠肺纤维化模型，从整体、细胞与分子水平研究其防治肺纤维化的疗效和作用机制，为临床治疗提供实验基础。研究方法及结果1整体动物实验1．1方法SD雄性大鼠144只，体重(198±7)g，分为假手术组，模型组，姜黄素高、中、低剂量组，醋酸泼尼松组，每组24只，共6组。除假手术组外其余各组大鼠气管内一次性滴注盐酸博莱霉素，假手术组大鼠气管内一次性滴注等体积的生理盐水。造模后第1天开始灌胃给药，持续到处死动物的前一天。姜黄素高、中、低剂量组分别为200、100、50mg·kg~(-1)·d~(-1)，醋酸泼尼松组(阳性药物对照组)剂量为0.56 mg·kg~(-1)·d~(-1)，假手术组，模型组分别灌服等体积的生理盐水。各组动物于实验第7，14，28d分三批处死，每组6只常规制成光镜标本，HE和Mallory染色，2只麻醉后快速开胸取肺组织，迅速投入液氮冷冻，以备免疫组化、western blot以及电镜标本的制作。免疫组化载玻片用DEPC处理后备用。普通透射电镜标本常规制作。钌红特殊染色透射电镜标本的制作，使用钌红前固定液和后固定液特殊固定处理，其余包埋，超薄切片制作同透射电镜。将肺组织分为无染色区、深染色区和浅染色区，计算机图像分析，采用美国Image-Pro Plus 5.0图像分析系统，自动测出各部分所占面积，取其平均值(mm~2)，用SPSS11.5软件进行统计学处理。1．2结果HE染色结果：7d、14d、28d时假手术组肺组织结构未见异常。7d时，模型组大鼠肺毛细血管充血，肺泡隔增宽且水肿，有大量中性粒细胞和单核巨噬细胞浸润，可见散在的位于肺间隔和细小支气管周围的纤维增生灶；醋酸泼尼松组肺泡腔有炎性细胞渗出，可见胸膜有渗出和增厚，其余各组未见此变化；姜黄素高、中、低剂量组都表现出不同程度的炎症。14d时除模型组外各组炎症减轻和出现不同程度的纤维化灶。28d时，各组炎症明显消退，个别区域仍有极少量炎症细胞存留。模型组大鼠纤维化程度明显，有大片实变区，呈中重度肺纤维化改变，表明动物模型复制成功。阳性药物组情况略好，肺泡隔部分纤维化。姜黄素高、中、低剂量组情况明显好转，肺泡隔纤维增生灶较少，肺泡内未见明显的炎性细胞。细小支气管周围的纤维化程度明显低于模型组及醋酸泼尼松组，其中姜黄素高、中剂量组更轻，以中剂量组效果最佳，仅存有极少量的小纤维灶，肺泡结构已经基本修复。表明姜黄素在一定程度上有减轻大鼠肺损伤性肺泡炎或阻抑肺纤维化的作用。Mallory染色结果证实：姜黄素高、中、低剂量组在14d和28d时肺泡隔增生不明显，纤维化程度轻微。特别是中剂量组病变程度较轻，纤维化程度轻，胶原总含量明显少。形态定量分析结果显示：模型组与假手术组相比，形态定量分析结果与组织病理学检查一致。姜黄素中、低剂量组在7d时有一定的抗炎作用，14d、28d时有明显抑制盐酸博莱霉素所致大鼠肺纤维形成作用，中剂量组效果最佳(p＜0.01)。超微结构观察发现：姜黄素各组肺组织结构较模型组完整，大部分上皮细胞的基膜完整，成纤维细胞增生、间质胶原纤维沉积范围及程度均较模型组减轻。用western-blot和免疫组化的方法，研究姜黄素对肺组织TNF-a的影响。结果显示：姜黄素能降低肺纤维化大鼠肺组织TNF-a的含量。对肺外因素——循环纤维细胞(circulating fibrocyte)的初步研究采用免疫组化双标法观察大鼠肺组织内CD45和colⅠ的表达，结果发现：博来霉素组肺纤维化灶内的循环纤维细胞明显比正常对照组数量多，表明循环纤维细胞在博莱霉素诱导大鼠所致肺纤维化形成过程中起重要作用。2体外实验研究2．1方法建立肺纤维化模型同前，采用组织块培养法原代培养肺间质成纤维细胞，反复贴壁纯化。以传代5-8代的成纤维细胞为实验对象，直接观察不同浓度的姜黄素(10、20、40、80、160μmol／L)观察姜黄素对大鼠肺成纤维细胞(LFb)增殖及分泌细胞外基质的影响。MTT法检测姜黄素对肺成纤维细胞增殖的影响，ELLISA法检测细胞培养上清中胶原Ⅰ、透明质酸，层粘连蛋白和纤维粘连蛋白的含量。2．2结果姜黄素在(10-160μmol／L浓度范围内，对肺成纤维细胞无细胞毒性作用，却剂量依赖地抑制肺成纤维细胞的增殖，并不同程度抑制Ⅰ型胶原、透明质酸、层粘连蛋白和纤维粘连蛋白的分泌，尤以80μmol／L姜黄素效果最好。结论1姜黄素能降低博莱霉素诱导的大鼠肺纤维化细胞外基质的含量，减轻纤维化的程度，从而发挥预防和治疗肺纤维化的作用。2姜黄素能抑制博莱霉素诱导的大鼠肺纤维化肺泡细胞和间质细胞中TNF-a蛋白活性，从而减轻肺组织炎症反应，减少纤维的集聚和纤维化形成。3肺成纤维细胞是肺纤维化发生与发展的关键环节，姜黄素在体外能显著抑制成纤维细胞的增殖和细胞外基质的合成，从而起到抗肺纤维化的作用。4骨髓来源的循环纤维细胞，在博莱霉素诱导的大鼠肺纤维化形成过程中起着重要作用，为临床治疗肺纤维化提供新思路。

李娟^[8]2017年在《循环纤维细胞在实验性矽肺发生发展中的作用与机制》文中进行了进一步梳理背景和目的矽肺是由于吸入游离二氧化硅(SiO_2)粉尘引起的以肺组织慢性炎症和进展性纤维化为特征的全身性疾病,发病机制尚不明确。国内外研究发现,矽肺的发生发展是一个涉及多种细胞参与、多因子调控的复杂过程。大量研究结果证实活化的成纤维细胞/肌成纤维细胞是分泌胶原蛋白、最终导致肺组织广泛纤维化的主要终端效应细胞。既往矽肺研究中主要关注肺成纤维细胞,近年来研究发现循环纤维细胞(circulating fibrocyte,CF)具有炎症趋化、类干细胞分化的特性,可能是成纤维细胞/肌成纤维细胞的又一主要来源。研究证实CF参与特发性肺纤维化等疾病发病过程,但其是否参与矽肺纤维化的发生发展,尚未见报道。因此,通过建立大鼠矽肺模型,辅以体外实验,采用流式细胞术、免疫荧光、电子显微镜观察等实验技术,系统研究循环纤维细胞在矽肺炎症与纤维化形成期动态变化及可能作用与机制,进一步深化对矽肺发病机制的认识,寻找矽肺潜在的生物学标志及可能的关键靶点,为矽肺的预防、早发现及有效干预提供新的思路和理论依据。材料和方法1.二氧化硅诱导循环纤维细胞转分化的体外研究取SPF级雄性SD大鼠分离大鼠外周血单个核细胞,以含20%胎牛血清的DMEM调整细胞浓度2.5×106/ml,接种于6孔板后持续培养12 d,获得CF。大鼠肺泡巨噬细胞(alveolar macrophage,AM)的获取采用支气管肺泡灌洗法。免疫荧光双染法观察不同培养天数CF,流式细胞术检测不同培养天数CF的比例。RT-PCR半定量法检测Collagen I、Collagen III和α-SMA mRNA表达,酶联免疫吸附测定法检测TGF-β1细胞因子分泌。免疫组织化学法检测纯化后继续培养至第20 d的CFα-SMA蛋白表达。CCK8法测定不同浓度SiO_2粉尘在不同暴露时间下对AM和CF存活率的影响,确定后续染毒浓度。建立AM和培养6 d的外周血单个核细胞共培养模型探讨SiO_2粉尘暴露对其向CF转分化的影响,染毒24 h、48 h后流式细胞术检测CF比例;qRT-PCR和免疫荧光法检测SiO_2粉尘暴露后CF的Collagen I、Collagen III和α-SMA m RNA和蛋白表达;酶联免疫吸附法检测SiO_2暴露后CF培养上清中Collagen I、Collagen III和TGF-β1蛋白分泌水平。建立AM和纯化后培养至20 d的CF共培养模型,染毒48 h,免疫组织化学法检测CFα-SMA蛋白表达。2.实验性矽肺大鼠循环纤维细胞分布规律和趋化行为的动态观察随机将72只SD雄性大鼠分为矽肺组和对照组。非暴露气管滴注染尘法建立大鼠矽肺模型。建模后1、2、3、6、9、12周处死大鼠(矽肺组和对照组各6只),收集外周血、肺泡灌洗液和肺组织。HE和Masson染色观察不同时段大鼠肺组织形态学变化和胶原沉积情况,鉴定大鼠矽肺模型。流式细胞术检测大鼠外周血、肺组织中CF比例;免疫荧光双染法检测肺组织中CF分布及CF来源Collagen I分泌细胞所占比例及CF来源肌成纤维细胞比例和肺泡II型上皮细胞来源的肌成纤维细胞比例;免疫组织化学法检测肺组织中CXCR4表达,ELISA法测定肺组织中CXCR4的配体CXCL12表达;Western blot检测肺组织p-PI3K、p-Ser473-Akt、p-mTOR的蛋白表达;流式细胞术检测肺泡灌洗液中Th1、Th2细胞数量变化,ELISA测定肺组织中Th1、Th2型细胞因子IFN-γ和IL-4及TGF-β1和IL-1β的表达。另选10只SD雄性大鼠观察CF从外周血向肺内迁移情况,CFSE活细胞荧光染料标记CF,尾静脉注射入大鼠体内,立即对大鼠进行SiO_2染毒处理。1周后处死大鼠,免疫荧光法观察肺组织中是否存在荧光标记的CF及其分布,流式细胞术检测肺组织中CF所占比例。3.统计学分析运用SPSS17.0对实验数据进行统计学分析,分析结果以c±s表示,两组独立样本间均数比较采用Student’s t检验,多组独立样本间比较采用ANOVA,LSD检验用于进一步进行两两比较,相关分析采用Pearson相关分析,检验水准α=0.05。结果1.CF原代培养、鉴定及转分化特性的观察体外培养外周血单个核细胞,显微镜下可见淋巴样圆形细胞减少,6 d后梭形及不规则样细胞增多并开始增殖,12 d体积明显增大呈典型的成纤维样;随着培养天数增加,CF细胞比例明显升高,12 d后可以达到74.25%。随着体外培养时间的延长,Collagen I、Collagen III的m RNA表达升高,9d和12 d最高,差异均有统计学意义(P<0.05),α-SMA mRNA表达则呈初期高后期低趋势;纯化后的CF培养至第20 d开始表达α-SMA蛋白。2.SiO_2粉尘暴露对CF转分化的观察SiO_2粉尘染毒可以抑制AM和CF的活性。在相同染毒时间下,AM和CF的存活率均随着SiO_2染毒浓度的升高而下降,差异具有统计学意义(P<0.05)。对照组和染尘组CF比例均随培养时间的延长而升高(与0 h组相比,P<0.05);而相同时间段内,染尘组CF比例明显高于对照组,差异具有统计学意义(与同时段对照组相比,P<0.05)。与对照组和0 h组相比,48 h染尘组Collagen I和Collagen III mRNA表达和细胞培养上清中Collagen I和Collagen III分泌均明显升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。同时观察到Collagen I和Collagen III定位于CF细胞质中,未观察到α-SMA蛋白表达。染尘组和对照组细胞培养上清中TGF-β1的表达均随培养时间延长而升高,48 h组均达到最高,且染尘组比对照组明显升高,差异具有统计学意义(P<0.05)。纯化后的CF培养至20 d与AM建立共培养体系,染尘组与对照组相比,α-SMA蛋白表达明显升高,差异具有统计学意义(P<0.05)。3.大鼠肺组织形态学及纤维化程度观察染尘1、2周后肺泡壁明显增宽,小气道周围及肺泡腔出现大量炎性细胞浸润;染尘3周后可见肺泡腔出现明显的细胞性结节,以炎性细胞聚集为主;6周后可见细胞性结节和纤维性结节形成,并出现结节融合现象;9、12周后可见大量纤维性结节出现,肺泡结构破坏,间隔断裂及融合。矽肺大鼠肺组织胶原沉积面积百分比均高于对照组,且随染尘时间的增加呈升高趋势,差异具有统计学意义(P<0.05)。4.大鼠外周血和肺组织中CF比例及其来源的Collagen I分泌细胞比例和分布与对照组相比,染尘2周至12周矽肺大鼠外周血中CF的比例均明显升高,差异具有统计学意义(P<0.05)。与对照组相比,不同染尘时段矽肺大鼠肺组织单细胞悬液中CF的比例均明显升高,差异具有统计学意义(P<0.05)。与对照组相比,不同染尘时段矽肺大鼠肺组织中CF占Collagen I分泌细胞比例均显著升高(10%~16%),差异具有统计学意义(P<0.05)。并且染尘初期CF主要位于血管和炎细胞聚集处,纤维化期可见CF存在于纤维结节内。5.三种不同来源的肌成纤维细胞权重及变化趋势与对照组相比,不同染尘时段矽肺大鼠肺组织中CF和II型肺泡上皮细胞来源的肌成纤维细胞均显著升高,差异均具有统计学意义(P<0.05)。染尘不同时段,CF来源的肌成纤维细胞比例约15%~35%,而II型肺泡上皮细胞来源的肌成纤维细胞约9%~21%,计算肺成纤维细胞来源肌成纤维细胞的比例约为40%~65%。循环纤维细胞和肺泡II型上皮细胞来源肌成纤维细胞在染尘初期(1周、2周、3周)呈升高趋势,染尘后期(6周、9周、12周)呈下降趋势,肺成纤维细胞来源的肌成纤维细胞与上两者趋势相反。6.SiO_2粉尘暴露对CF体内迁移及肺组织中CXCR4、CXCL12和PI3K/AKT/mTOR信号通路蛋白表达的影响染尘1周,CF可以从外周血迁移至肺内,与对照组相比,矽肺组大鼠肺组织中CFSE+CF占肺总细胞比例明显升高,差异具有统计意义(P<0.05),并且CF主要分布于血管周围。与对照组相比,不同染尘时段矽肺大鼠肺组织中CXCR4的表达均明显升高,1周至9周差异具有统计学意义(P<0.05),并且1周最高。与对照组相比,1周、2周和3周矽肺组大鼠肺组织中CXCL12表达均升高,差异具有统计学意义(P<0.05)。与对照组相比,矽肺组大鼠肺组织中p-PI3K、p-Ser473-Akt、p-m TOR的蛋白表达在均在1周和2周明显升高,差异均具有统计学意义(P<0.05)。7.大鼠肺泡灌洗液Th1、Th2细胞数量及肺组织中相关细胞因子的变化随着染尘时间的延长,不同时段矽肺组大鼠肺泡灌洗液中Th1细胞比例呈下降趋势,Th2细胞呈升高趋势,Th1/Th2比值逐渐下降,差异具有统计学意义(P<0.05)。与对照组相比,Th1细胞比例1、2、3周升高,Th2细胞比例1、2周下降、9周和12周升高,Th1/Th2比值1、2、3周升高,12周下降,差异均具有统计学意义(P<0.05)。与对照组相比,矽肺组大鼠肺组织中INF-γ表达在1周明显升高,差异具有统计学意义(P<0.05);IL-4表达水平1周降低,12周升高,差异均具有统计学意义(P<0.05)。与对照组相比,矽肺组大鼠肺组织中TGF-β1表达在2周明显升高,而IL-1β表达在染尘1到9周均显著升高,差异具有统计学意义(P<0.05)。8.CF与Th1/Th2及相关细胞因子的关联性分析染尘1周,CF来源Collagen I分泌细胞比例与Th1/Th2比值和肺内INF-γ的水平均呈显著正相关(r=0.879,P=0.021;r=0.942,P=0.005)。结论1.CF具有类干细胞分化特性,SiO_2体外和体内暴露均促进外周血单个核细胞向CF转分化,并促进CF向肌成纤维细胞转分化。2.在实验性矽肺的发生发展过程中,CF可以由外周血迁移至肺部,炎症反应期肺内CF来源的肌成纤维细胞增多最明显,比例最高可达35%,是肌成纤维细胞的重要来源。

刘泽鑫^[9]2014年在《香烟提取物对人肺泡Ⅱ型上皮细胞MMP-9、TIMP-1分泌的影响及意义》文中认为目的：研究表明，香烟烟雾中的有害毒性物质多达上千种，是多种肺部疾病的共同危险因素。也有研究提出，吸烟可能与特发性肺纤维化(IPF)的发病有着密切的关联，但其具体作用机制尚不完全清楚。香烟烟雾中含有多种炎症介质，包括氧化剂(coxidant)和朊酶类(proteases)等，最终可导致蛋白酶/抗蛋白酶失衡参与众多肺部疾病的发病。近年，在肺间质纤维化的形成机制中，MMPs/TIMPs（金属蛋白酶/金属蛋白酶组织抑制剂）比例失衡逐渐成为研究的热点和重点。其中，MMP-9（基质金属蛋白酶-9）作为一种重要的基质金属蛋白酶，在细胞外基质降解、肺组织结构重塑等多种生理病理过程中发挥重要作用，参与多种肺部疾病的发生，其活性受特异性抑制剂，即基质金属蛋白酶抑制剂-1(TIMP-1)的调节。在各种外界刺激因素的作用下，二者比例及相互作用发生紊乱，可导致细胞外基质降解受阻、细胞外蛋白沉积、肺组织重构等病理改变，从而参与肺间质纤维化(pulmonary interstitial fiberosis)的发病。本实验旨在通过研究香烟提取物(cigerette smoking extract，CSE)对体外培养的肺泡Ⅱ型上皮细胞来源的人A549细胞分泌基质金属蛋白酶9(matrixMetalloproteinase-9，MMP-9)及其组织抑制因子(tissue inhibitorofmetal loproteinase-l，TIMP-1)的影响，探讨吸烟作为一种危险因素参与肺间质纤维化过程的可能机制。方法：体外培养人A549细胞，取指数生长期细胞用于实验。两支去过滤嘴香烟由经改造的50ml注射器负压吸引装置连续匀速抽吸燃烧着，将烟雾经另一出口入20ml1640培养基中制成悬液。15分钟内将2支香烟燃尽。充分摇动使其溶解，用氢氧化钠（NAOH）将pH调至7.4左右，0.22um孔径的滤器过滤，除去细菌和杂质，所得溶液在30分钟内用于实验。将原液配成不同浓度干预人A549细胞24小时，并依据浓度的不同将实验分为四组：对照组、 A组（2.5％CSE干预组）、B（5％CSE干预组）、C（10％CSE干预组）。并分别收集C组干预A549细胞0h，3h，6h，9h，12h，48h的培养上清液。光学倒置电子显微镜分别观察四组细胞干预24小时后的形态学变化；酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测上清液中MMP-9、TIMP-1的浓度；分别收集干预24h后各组培养细胞，提取细胞中的蛋白质， BCA法测定蛋白浓度，Western Blot法检测细胞中MMP-9、TIMP-1蛋白的表达。结果：1、细胞形态学变化倒置显微镜观察各组培养24小时后的细胞形态。对照组细胞表现为贴壁、扁平梭形生长，细胞形态规则，细胞生长旺盛。在经过不同CSE浓度干预后的A（2.5％CSE干预组）、B（5％CSE干预组）、C（10％CSE干预组）三组细胞形态较对照组差异较大，且呈现出干预浓度越高，细胞生长情况越差的特点。主要表现为细胞数量减少、体积缩小，细胞贴壁能力下降，细胞之间空间增大。而C组细胞形态变化较对照组更为显著。大部分细胞已回缩变圆且细胞密度明显减低，胞内颗粒状物质明显增多，细胞贴壁能力大大减低。2、CSE干预后A549细胞分泌MMP-9的变化ELISA结果显示，对照组MMP-9含量为（1.70±0.12ng/ml），A、B、C三组浓度呈现逐渐升高趋势，三组与对照组相比差异均有统计学意义(P<0.05)，且A、B、C三组之间相互比较差异也具有统计学意义(P<0.05)。同时，观察C组作用不同时间MMP-9的表达我们可以发现，随着作用时间的延长，其表达呈不断升高趋势。0h时其浓度为（1.76±0.31ng/ml），48h时其浓度最高达到（9.29±0.76ng/ml）。经过统计学分析可以得出结论，3h-48h各组与0h比较差异均具有统计学意义(P<0.05)，9h-48h与3h比较差异具有统计学意义(P<0.05)。3、CSE干预后A549细胞分泌TIMP-1的变化ELISA结果显示，对照组TIMP-1含量为（2.20±0.31ng/ml），A、B、C三组浓度呈现逐渐升高趋势，三组与对照组相比差异均有统计学意义(P<0.05)，且A、B、C三组之间相互比较也具有统计学意义(P<0.05)。同时，观察C组作用不同时间TIMP-1的表达我们可以发现，随着作用时间的延长，其表达呈不断升高趋势。0h时其浓度为（2.52±0.41ng/ml），48h时其浓度最高达到（16.31±0.96ng/ml）。经过统计学分析可以得出结论，3h-48h各组与0h比较差异均具有统计学意义(P<0.05)，9h-48h与3h比较差异具有统计学意义(P<0.05)。4、CSE干预后A549细胞MMP-9/TIMP-1的变化ELISA结果显示在A549细胞培养24小时后，对照组MMP-9/TIMP-1数值为（0.77±0.05），而在经CSE干预后的A、B、C三组数值相比对照组均降低，三组与对照组相比差异均有统计学意义(P<0.05)，但各组间两两比较差异均无统计学意义(P>0.05)。观察C组在干预的不同时间MMP-9/TIMP-1比值的变化发现，12h、24h及48h与0h比较具有统计学意义(P<0.05)，而3h、6h及9h与0h比较无明显统计学意义。0h、6h与3h比较差异无明显统计学意义，而9h、12h、24h、48h与3h比较差异则具有统计学意义(P<0.05)。5、 CSE干预A549细胞24h后MMP-9、TIMP-1蛋白的表达各组细胞干预24小时后Western Blot显示，对照组MMP-9及TIMP-1蛋白表达较少，而A、B、C各组两种蛋白表达均较对照组升高，且随着干预浓度的升高蛋白表达逐渐增加。结论：1、CSE能引起肺泡Ⅱ型上皮细胞分泌MMP-9、TIMP-1增加。2、CSE能引起肺泡Ⅱ型上皮细胞分泌MMP-9、TIMP-1增加，且呈现出时间及浓度依赖性。3、CSE能引起MMP-9/TIMP-1比例失衡，并呈现出先高后低的趋势。4、CSE能引起肺泡Ⅱ型上皮细胞产生MMP-9/TIMP-1比例失衡，其作为危险因素可能通过这一机制参与吸烟相关性肺间质纤维化的形成过程。

姜巍^[10]2013年在《组蛋白去乙酰化酶1、8在肺泡Ⅱ型上皮细胞间质转化中的表达及意义》文中提出【背景与目的】随着近年来人们平均寿命的延长以及治疗肿瘤过程中放化疗的应用，肺间质弥漫性纤维化的发病率逐年上升。临床上传统的治疗药物对于阻抑纤维化的进展虽有一定疗效，但副作用大，应用受限。与其他器官纤维化一样，肺纤维化（Pulmonary fibrosis，PF）涉及到细胞、细胞因子、上皮细胞间质转化（Epithelial-Mesenchymal Transition，EMT）等的共同参与，其中EMT参与了调控器官纤维化的发生和其它生理病理过程，而组蛋白去乙酰化酶（Histone deacetylase，HDACs）也在这些相关的过程中起着重要作用。HDACs是平衡染色质重塑中组蛋白乙酰转移酶（Histone acetyltransferase，HAT）乙酰化活动的酶类，如果两种酶之间的平衡在特定条件下被破坏，就会导致基因转录的失调及信号转导改变，从而引起基因表达异常，这种异常在纤维化以及癌症的发生和发展中都起着重要作用。HDACs共分为四类，其中HDAC1、8属于Ⅰ类HDAC。近年来的研究表明，HDAC1在TGF-β1诱导的肝细胞EMT过程中发挥重要作用，而且组蛋白去乙酰化酶抑制剂（Histone deacetylase inhibitor，HDACi）-TrichostatinA（TSA）可以有效抑制Ⅰ类及Ⅱ类HDAC，在四氯化碳诱导的慢性肝损伤中预防纤维化，改善心肌纤维化，还可以抑制肾小管上皮细胞EMT及减轻皮肤癌放疗后的纤维化。但是HDACs是否参与了肺泡上皮细胞EMT进程目前尚不清楚，所以本研究通过在体外培养大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞中加入TGF-β1，观察HDAC1、8和E-cad、α-SMA的表达情况，然后加入TSA，观察其对TGF-β1诱导的肺泡Ⅱ型上皮细胞EMT的影响，探讨HDAC1、8在肺泡上皮细胞EMT过程中的作用及其机制。【材料与方法】将TGF-β1加入到体外培养的大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞系（RLE-6TN）中，并于不同时间收取细胞，采用Real-time RT-PCR及Western Blot检测HDAC1、HDAC8、上皮细胞特异性标志物（E-cad）及间质细胞特异性标志物（α-SMA）的表达情况。然后将TGF-β1加入经过TSA预处理的细胞中，于不同时间收取细胞，采用Real-time RT-PCR及Western Blot检测E-cad、α-SMA及HDAC1、8的表达情况。【结果】与对照组相比，加入TGF-β1后，E-cad mRNA的表达下调，α-SMA及HDAC8的mRNA均于12h表达上调，6h、24h表达下调， HDAC1mRNA的表达于6h下调，24h上调；E-cad蛋白表达下调，α-SMA、HDAC1及HDAC8蛋白表达上调。与单用TGF-β1组相比，加入TSA后，E-cad mRNA的表达上调，α-SMAmRNA的表达于6h、12h上调，24h下调，HDAC1mRNA表达下调，HDAC8mRNA表达上调；E-cad蛋白表达上调，α-SMA、HDAC1及HDAC8蛋白的表达均下调。【结论】1. HDAC1参与了TGF-β1诱导的肺泡Ⅱ型上皮细胞间质转变过程；2.TGF-β1体外诱导的肺泡Ⅱ型上皮细胞EMT，可以通过应用TSA抑制其获得α-SMA表型、失去E-cad表型，从而部分逆转TGF-β1诱导的肺泡Ⅱ型上皮细胞EMT。

参考文献：

[1]. 关于肺泡Ⅱ型上皮细胞参与肺间质纤维化的探讨[D]. 高圣堂. 中国协和医科大学. 1996

[2]. 化纤汤对博莱霉素致大鼠肺纤维化干预作用的实验研究[D]. 许朝霞. 湖北中医学院. 2007

[3]. Ⅳ型胶原基因高表达在放射性肺损伤组织重塑中的作用及肺纤维化防治研究[D]. 刁瑞英. 中国人民解放军军事医学科学院. 2008

[4]. 特发性肺纤维化中TGF-β1介导的DNA甲基转移酶致端粒酶活性异常及其干预研究[D]. 钱力. 山西医科大学. 2018

[5]. 苈桃抗纤方对肺泡Ⅱ型上皮细胞转化的影响及作用机制[D]. 杨毅. 湖北中医学院. 2009

[6]. 川芎嗪对IPF大鼠脆性位点基因WWOX、FHIT影响的研究[D]. 谷雨. 河北大学. 2013

[7]. 姜黄素对大鼠肺纤维化防治作用的实验研究[D]. 李银生. 北京中医药大学. 2007

[8]. 循环纤维细胞在实验性矽肺发生发展中的作用与机制[D]. 李娟. 郑州大学. 2017

[9]. 香烟提取物对人肺泡Ⅱ型上皮细胞MMP-9、TIMP-1分泌的影响及意义[D]. 刘泽鑫. 河北医科大学. 2014

[10]. 组蛋白去乙酰化酶1、8在肺泡Ⅱ型上皮细胞间质转化中的表达及意义[D]. 姜巍. 大理学院. 2013

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