燕进松 徐新 通讯作者 张社兵
（广东省韶关市粤北人民医院心内科；广东韶关512025）
摘要：过去十年研究发现，包括凋亡小体、微泡和外泌体在内的细胞外囊泡，作为细胞间通讯的参与者，在生理和病理条件下对细胞间物质和信息的传递发挥着重要作用。细胞外囊泡可以携带和运输各种生物活性分子，通过血液循环和体液运输至相邻靶细胞或远处组织细胞，进而诱导各种信号级联。细胞外囊泡参与了血管发育，生长和成熟，在再生医学和血管新生相关疾病中的潜在价值引起越来越多的关注。来源于各种细胞类型的细胞外囊泡有可能向内皮细胞递送复杂的信息，并诱导促血管新生或抑制血管新生信号。本文对不同细胞来源的细胞外囊泡在血管新生中的作用作一综述，并对其在临床疾病和生物医学研究应用中的先决条件和主要挑战予以探讨。
关键词： 细胞外囊泡 血管新生 内皮细胞 外泌体
1 细胞外囊泡定义分类 细胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）是由脂质双分子层包绕形成的球状膜性囊泡，是细胞自发或在一定条件下释放出的一种亚细胞成份，主要存在于细胞生存的微环境中，如细胞培养上清以及各种体液(血液、淋巴液、唾液、尿液)等，分子直径在4 000nm间[1]。根据不同的形成机制和生理特征，EVs可以分为三种主要类型：外泌体，微囊泡和凋亡小体。
1.1 外泌体 外泌体是多囊泡小体和细胞质膜融合后被细胞释放出来的囊泡状结构，直径在30-120纳米之间，通常呈杯状。细胞通过释放不同大小和组成的外来体的不同亚群发挥不同的分子和生物学特性[2]。外泌体来源于内体系统，由内体腔室的腔内萌芽产生，形成多囊泡胞内体或多泡小体（ILV）。ILV的形成是外泌体生物发生过程的起点。[3] ILV形成的主要机制是由运输机械所需的内体分选复合物介导的。此外，ILV内陷和外泌体分泌也受到内体排序复合物的调节，需要四次跨膜蛋白微区和脂筏运输非依赖性方式。[4,5] ILV与母细胞胞膜特定部位融合后，胞内体中的微小囊泡朝向内体囊腔的内部形成芽泡，继而以外泌的形式释放到细胞外环境中。由于外泌体特殊的分泌方式，其所含蛋白组分不含有内质网内的蛋白质，而高表达四分子交联体超蛋白家族，如CD9， CD81， CD63以及热休克蛋白等，低表达磷脂酰丝氨酸。
1.2 微囊泡 与外泌体相比，微囊泡直径大小为100 -1000纳米，形成过程相对简单，直接通过出芽方式从母细胞膜表面脱落产生，刺激后几秒钟就被释放[6]。微囊泡对刺激的反应表现不同，可能依赖于各种酶、线粒体和钙信号。在出芽过程中，细胞骨架重组以及磷脂对称性发生改变[7]，这些变化促进了氨基磷脂（主要是磷脂酰丝氨酸）向质膜外的重新分配。研究发现，微囊泡形成选择性地发生在膜的富含脂质的微区中，例如脂筏或小窝区域中[8]。微囊泡产生的分子机制涉及多种途径，可能与起始刺激有关，这些起始刺激包括肌球蛋白轻链和Rho相关激酶I和II，核因子-κB，肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体或p38促分裂原活化蛋白激酶。[9]
1.3 凋亡小体 凋亡小体是细胞程序性死亡或凋亡晚期释放的微粒，直径约500-4 000 nm[10]。凋亡小体富含各种细胞物质，如组蛋白，DNA，细胞器和膜/胞质成分[11]。然而，关于它们的分子组成知之甚少。此外，凋亡小体的被动转运是否涉及细胞间通讯尚不清楚，需要更多的研究。
2 不同细胞来源的血管新生与细胞外囊泡关系
2.1 内皮细胞源性EVs： 血管生成是一个动态的、严密的过程。在这个过程中，内皮细胞通过多种旁分泌因子、细胞与细胞以及细胞与基质的相互作用与环境保持持续的联系。在诸多细胞外影响因子中，内皮细胞释放的囊泡已成为血管新生的重要介质。2002年，研究首次报道由内皮细胞释放囊泡具有促血管生成的能力[12]。最近的一项研究显示，IL-3刺激产生的EVs通过将miR-126-3p和p-STAT5转移至内皮细胞受体中促进血管新生，导致较低的Spred-1水平、增加的ERK1 / 2激活和细胞周期蛋白 D1转录[13]。此外，研究表明，凋亡小体内的miR-126可诱导靶细胞CXCL12的表达，促进祖细胞归巢至小鼠动脉粥样硬化部位，通过增加斑块的稳定性发挥动脉粥样硬化保护作用[14]。
2.2 内皮集落形成细胞源性EVs： 自1997年Asahara[15]等人发现内皮祖细胞（endothelial progenitor cells ,EPCs）以来，关于EPCs的鉴定及其在血管新生中的作用存在较多争论。值得注意的是，体外培养的外周血单核细胞吸收血小板微粒和随后的血小板抗原获取已被认为是循环EPC内皮表型定义中的主要混杂因素[16]。相反，内皮集落形成细胞被认为是真正的EPCs，表现出内皮分化潜能、增殖活性以及血管新生能力[17]。研究发现，内皮集落形成细胞源性EVs可增强新生血管的形成来促进糖尿病大鼠皮肤伤口愈合，其机制可能与内皮细胞Erk1 / 2信号激活有关 [18,19]。
2.3 间充质干细胞源性EVs： 间充质干细胞具有促血管生成特性，主要归因于其分泌旁分泌因子。研究发现，在各种可溶性因子中，细胞外囊泡在细胞间通讯中发挥重要作用并参与血管新生。最新研究表明，小鼠局灶性脑缺血后，从骨髓源性的间充质干细胞中分离出的EVs以类似于间充质干细胞的方式增加了缺血后的神经血管发生[20]。此外，有报道称多潜能干细胞诱导分化的间充质干细胞的外泌体可促进骨质疏松大鼠的血管生成[21]。
2.4 血小板源性EVs： 血小板除了在止血和血栓形成中的关键作用外，还参与一些生物学过程，例如：炎症、血管新生和组织再生。 在过去的12年间，血小板源性EVs在血管生成中的作用已经得到广泛证实。血小板微泡及其蛋白质组的生成量取决于其刺激[22]。因此，不同的病理情况导致具有特定成分的微粒释放，进而递送特定的信息至相邻细胞。此外，血小板EVs可增强内皮细胞迁移、增殖和管腔形成能力，尤其是在体损伤后的内皮再生能力。研究发现，从动脉粥样硬化患者外周血分离的血小板EVs，可促进后肢缺血大鼠的血管新生[23]。
2.5 白细胞源性EVs： 白细胞源性EVs可能来源于淋巴细胞、单核巨噬细胞或嗜中性粒细胞，它们在维持血管稳态方面发挥重要作用。此外，淋巴细胞和单核细胞源性EVs可能参与血管新生过程[24-26]。有研究显示在没有激活信号的情况下，放线菌素D处理淋巴细胞后产生的微粒具有抑制血管生成的效应，可能与活性氧生成增加有关[24]。
2.6 红细胞源性EVs： 红细胞除了运输氧的重要作用之外，还参与血管新生。最近的一项研究表明，红细胞产生的1-磷酸鞘氨醇是胚胎发育过程中血管稳定、成熟和重塑的关键[27]。细胞外囊泡的形成发生在红细胞成熟过程中，并选择性保留质膜中的某些蛋白质和去除有害分子，如氧化蛋白质[28]。尽管红细胞EVs在血管生成中的具体作用尚不清楚，但是，一些研究表明，在某些病理情况下（镰状细胞病和疟疾），红细胞源性EVs可能对内皮细胞具有有害作用。据报道，疟疾病人的红细胞源性EV能改变内皮细胞基因表达和屏障特性[29]。此外，红细胞源性EV在镰状细胞病患者中显着升高，鞘氨醇-1-磷酸比正常志愿者显著升高[30]。
3基于EVs的治疗性血管新生: 尽管已经报道了来自各种来源的EVs的促血管生成和抗血管生成作用，但还需要进一步的体内研究以更好地理解EVs在细胞类型之间交换分子中的具体作用。在治疗性调节血管生成中使用EVs的过程中需要克服若干限制。 尤其是最终产品的标准化，质量控制和相关成本仍然是EVs疗法的主要问题。
3.1 细胞外囊泡生产的细胞来源和条件： 要考虑的关键点之一是细胞来源的选择和适用于临床的EVs生产的条件。 评估病人的病理环境如何影响EV的性能和治疗潜力也很重要。 尽管支持EVs治疗性血管生成能力的大部分临床前研究已经从健康供者的细胞中分离出来，但新兴的数据显示，间充质干细胞来源的EVs的促血管生成能力在心血管风险患者中具有受损因素[31]。因此，供者相关的变异性可能是导致在可比较的EVs组分中观察到的治疗差异的原因，需要定义供体包含/排除标准和有效标志物以能够预期EVs体内的治疗效果。
3.2 细胞外囊泡的浓度： 一个重要的问题是应该用什么浓度的EVs来刺激血管新生而不引起任何副作用？文献综述表明，EVs对血管生成的影响似乎是剂量依赖性的。 例如，少量的细胞外微囊泡（每孔2×10 3个）能够在体外增加管形成，而高浓度具有抑制作用（每孔2×10 5）[32]。另一项研究报道，当使用高于105个细胞外微囊泡/ mL的浓度时，细胞外微囊泡抑制心脏的培养切片中的血管生成[33]。当施用30至100μg蛋白质/ mL的剂量时，血小板衍生的细胞外微囊泡在体外表现出促血管生成作用。然而，当使用血小板微囊泡刺激体内血管化时，需要高得多的浓度（250μg/ mL）来刺激心肌缺血后血管重建[34]。此外，据报道间充质干细胞源性的EV在100μg/ mL的浓度下在体外和体内发挥最有效的血管生成作用[35]。然而，另一项研究表明，低浓度的间充质干细胞EVs（1-10μg/ mL）比高浓度（100μg/ mL）对于管形成更有效[36]。所有这些观察表明，关于EVs集中的问题仍然存在争议。 要解决这个问题并比较所有这些研究的结果是困难的，因为不同的培养条件已经用于EVs的生产。 上述研究表明，用于刺激血管生成的最佳EVs浓度将取决于多种因素，例如EVs的细胞来源，用于诱导EVs释放的刺激，EVs含量，EVs体内递送方式以及病理微环境。 用于刺激血管生成的EVs浓度的测定不仅受到用于EVs定量的各种方法的阻碍，而且受到EVs制剂的不同纯度的影响。最后，有必要进一步研究评估电生理治疗后的不良反应或副作用的风险。
结论 细胞外囊泡除了在各种病理条件下作为有前途的生物标志物的作用之外，EV是正常生理和疾病中细胞间通讯的重要介质。 越来越多的研究已经证实EV可以通过采取关键的血管形成步骤来积极调节EC血管生成的能力。 EV通过各种细胞类型如内皮细胞，内皮集落形成细胞，间充质干细胞，血小板或白细胞释放，并且能够递送强大的促血管生成信号，随后在组织修复中具有有益效果。而且缺氧和血管生长因子刺激等特定条件有利于具有血管新生潜能的EV释放。但是，由内皮细胞，血小板或淋巴细胞产生的一些EV也可以主要通过增加靶细胞中的氧化应激来对血管生长施加抑制活性。 尽管EV在血管新生中的作用已有文献报道，并且确定了主要的潜在机制，但进一步的研究对于确定EV每个亚群的确切作用是必要的。重要的是，因为一些EV既可以促进血管新生也可以抑制血管新生，所以需要动物模型来研究具体参与情况，以描绘EV何时以及如何得到保护。如何更进一步对EV临床等级制作和质量控制的精确技术的验证可以提供更好的效益-风险比率评估，并且能够在再生医学或血管新生相关疾病中的治疗应用中具有更广阔的应用前景。
期刊文章分类查询,尽在期刊图书馆
参考文献
[1]Raposo G, Stoorvogel W. Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends. [J].Cell Biol,2013,200(4):373–383.
[2]Wills E, Johansson HJ, Mäger I,et al.Cells release subpopulations of exosomes with distinct molecular and biological properties.[J].Sci Rep,2016,6:22519.
[3]Colombo M, Moita C, van Niel G,et al.Analysis of ESCRT functions in exosome biogenesis, composition and secretion highlights the heterogeneity of extracellular vesicles. [J ].Cell Sci. 2013,1269(24):5553–5565.
[4]. Andreu Z, Yáñez-Mó M. Tetraspanins in extracellular vesicle formation and function. [J].Front Immunol. 2014,5:442.
[5]. Trajkovic K, Hsu C, Chiantia S, et al. Ceramide triggers budding of exosome vesicles into multivesicular endosomes. [J].Science. 2008,319:1244-1247.
[6]. Cocucci E, Meldolesi .Ectosomes and exosomes: shedding the confusion between extracellular vesicles.[J]. Trends Cell Biol. 2015,25:364–372.
[7].Larson MC, Hillery CA, Hogg N. Circulating membrane-derived microvesicles in redox biology. [J].Free Radic Biol Med. 2014,73:214–228.
[8]. Morel O, Toti F, Morel N, et al.Microparticles in endothelial cell and vascular homeostasis: are they really noxious? [J].Haematologica. 2009,94:313–317.
[9]. Dignat-George F, Boulanger CM. The many faces of endothelial microparticles. [J].Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2011,31:27–33.
[10]. Kalra H, Drummen GP, Mathivanan S. Focus on extracellular vesicles: introducing the next small big thing. [J]. Mol Sci. 2016,17:170.
[11]. Van der Pol E, Böing AN, Harrison P, et al. Classification, functions, and clinical relevance of extracellular vesicles.[J]. Pharmacol Rev. 2012,64:676–705.
[12]. Taraboletti G, D’Ascenzo S, Borsotti P, et al. Shedding of the matrix metalloproteinases MMP-2, MMP-9, and MT1-MMP as membrane vesicle-associated components by endothelial cells.[J]. Am Pathol. 2002,160:673–680.
[13].Lombardo G, Dentelli P, Togliatto G, et al.Activated Stat5 trafficking via endothelial cell-derived extracellular vesicles controls IL-3 pro-angiogenic paracrine action. [J].Sci Rep. 2016,6:25689.
[14].Zernecke A, Bidzhekov K, Noels H, et al. Delivery of microRNA-126 by apoptotic bodies induces CXCL12-dependent vascular protection. [J].Sci Signal. 2009,2:81.
[15].Asahara T, Murohara T, Sullivan A, et al. Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis. [J].Science. 1997,27(5)964–967.
[16].Prokopi M, Pula G, Mayr U, et al. Proteomic analysis reveals presence of platelet microparticles in endothelial progenitor cell cultures. [J].Blood. 2009,114:723–732.
[17].Critser PJ, Yoder MC. Endothelial colony-forming cell role in neoangiogenesis and tissue repair.[J]. Curr Opin Organ Transplant. 2010,15:68–72.
[18].Zhang J, Chen C, Hu B, et al. Exosomes derived from human endothelial progenitor cells accelerate cutaneous wound healing by promoting angiogenesis through Erk1/2 signaling. [J]. Biol Sci. 2016;12:1472–1487.
[19].Li X, Jiang C, Zhao J. Human endothelial progenitor cells-derived exosomes accelerate cutaneous wound healing in diabetic rats by promoting endothelial function. [J].Diabetes Complications. 2016,30:986–992.
[20].Doeppner TR, Herz J, Görgens A, et al. Extracellular vesicles improve post-stroke neuroregeneration and prevent postischemic immunosuppression. [J].Stem Cells Transl Med. 2015,4:1131–1143.
[21].Qi X, Zhang J, Yuan H, et al. Exosomes Secreted by human-induced pluripotent stem cell-derived mesenchymal stem cells repair critical-sized bone defects through enhanced angiogenesis and osteogenesis in osteoporotic rats. [J].Biol Sci. 2016,12:836–849.
[22].Shai E, Rosa I, Parguiña AF, et al. Comparative analysis of platelet-derived microparticles reveals differences in their amount and proteome depending on the platelet stimulus. [J ].Proteomics. 2012,76 :287–296.
[23].Ohtsuka M, Sasaki K, Ueno T, et al.Platelet-derived microparticles augment the adhesion and neovascularization capacities of circulating angiogenic cells obtained from atherosclerotic patients. [J].Atherosclerosis. 2013,227:275–282.
[24].Yang C, Mwaikambo BR, Zhu T, et al. Lymphocytic microparticles inhibit angiogenesis by stimulating oxidative stress and negatively regulating VEGF-induced pathways. [J]. Physiol Regul Integr Comp Physiol. 2008,294:467–476.
[25].Soleti R, Benameur T, Porro C, et al. Microparticles harboring Sonic Hedgehog promote angiogenesis through the upregulation of adhesion proteins and proangiogenic factors. [J].Carcinogenesis. 2009,30:580–588.
[26].Benameur T, Soleti R, Porro C, et al. Microparticles carrying Sonic hedgehog favor neovascularization through the activation of nitric oxide pathway in mice. [J].PLoS One. 2010,5:12688.
[27].Delobel J, Prudent M, Rubin O, et al. Subcellular fractionation of stored red blood cells reveals a compartment-based protein carbonylation evolution. [J]. Proteomics. 2012,76:181–193.
[28].Delobel J, Prudent M, Rubin O, et al.. Subcellular fractionation of stored red blood cells reveals a compartment-based protein carbonylation evolution. [J].Proteomics. 2012,76:181–193. [29].Mantel PY, Hjelmqvist D, Walch M, et al. Infected erythrocyte-derived extracellular vesicles alter vascular function via regulatory Ago2-miRNA complexes in malaria. [J].Commun. 2016,7:12727.
[30].Awojoodu AO, Keegan PM, Lane AR, et al. Acid sphingomyelinase is activated in sickle cell erythrocytes and contributes to inflammatory microparticle generation in SCD.[J].Blood. 2014,124:1941–1950.
[31].Togliatto G, Dentelli P, Gili M, et al.Obesity reduces the pro-angiogenic potential of adipose tissue stem cell-derived extracellular vesicles (EVs) by impairing miR-126 content: impact on clinical applications. [J].Obes (Lond). 2016,40:102–111.
[32].Lacroix R, Sabatier F, Mialhe A, et al. Activation of plasminogen into plasmin at the surface of endothelial microparticles: a mechanism that modulates angiogenic properties of endothelial progenitor cells in vitro. [J].Blood. 2007,110:2432–2439.
[33].Ou ZJ, Chang FJ, Luo D, et al.Endothelium-derived microparticles inhibit angiogenesis in the heart and enhance the inhibitory effects of hypercholesterolemia on angiogenesis. [J].Physiol Endocrinol Metab. 2011,300:661–668.
[34].Brill A, Dashevsky O, Rivo J, et al.. Platelet-derived microparticles induce angiogenesis and stimulate post-ischemic revascularization. [J].Cardiovasc Res. 2005,67:30–38.
[35].Liang X, Zhang L, Wang S, et al. Exosomes secreted by mesenchymal stem cells promote endothelial cell angiogenesis by transferring miR-125a. [J].Cell Sci. 2016,129:2182–2189.
[36].Anderson JD, Johansson HJ, Graham CS, et al. Comprehensive proteomic analysis of mesenchymal stem cell exosomes reveals modulation of angiogenesis via nuclear factor-kappab signaling. [J].Stem Cells. 2016,34:601–613.
论文作者:燕进松, 徐新 通讯作者,张社兵
论文发表刊物:《医师在线》2018年6月下第12期
论文发表时间:2018/9/28
标签：细胞论文; 血管论文; 内皮论文; 新生论文; 血小板论文; 小体论文; 干细胞论文; 《医师在线》2018年6月下第12期论文;