【摘 要】目的 探讨葡萄糖调节蛋白78（GRP78）在子宫内膜癌组织中的表达及意义。方法 用免疫组织化学方法检测GRP78在81例子宫内膜癌组织、10例正常子宫内膜组织中的表达情况。结果 GRP78在子宫内膜癌组织中表达高于正常子宫内膜组织（P＜0.05）；GRP78在有子宫外转移（Ⅲ、Ⅳ期）患者组织中表达高于无子宫外转移（Ⅰ、Ⅱ期）患者（P＜0.05）。结论：GRP78在子宫内膜癌组织的表达呈增高趋势，提示GRP78参与了子宫内膜癌的发生、发展过程。GRP78高表达与子宫内膜癌子宫外转移有关。检测GRP78的表达可能有助于子宫内膜癌的预防、早期诊断及预后判断，同时也为子宫内膜癌的治疗提供新的靶点。
【关键词】葡萄糖调节蛋白78；子宫内膜癌
葡萄糖调节蛋白78（glucose regulated protein 78kD，GRP78）又名免疫球蛋白重链结合蛋白（the immunoglobulin heavy chain binding protein，Bip），是热休克蛋白70（Hsp70）家族的成员之一。目前多项研究结果显示，GRP78在多种肿瘤组织中呈高表达，与肿瘤的发生发展有关。本研究用免疫组织化学方法检测GRP78在子宫内膜癌组织中的表达情况，从而探讨其在子宫内膜癌组织中表达的意义。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 标本来源 收取湖南省妇幼保健院病理科在2007年至2013年期间子宫内膜癌组织标本81例，患者年龄27～89岁，平均为57岁；正常内膜组织10例做对照，患者年龄26-45岁，平均年龄40岁。
1.1.2 入选标准（1）子宫内膜癌为首发肿瘤；（2）子宫内膜癌患者至少接受全子宫+双附件切除+盆腔淋巴结清扫手术，术前未接受化疗或放疗等辅助治疗；（3）每例肿瘤组织均经病理科证实为子宫内膜腺癌；每例正常组织经病理科证实为正常分泌期或增生期子宫内膜。
1.1.3 诊断标准 子宫内膜癌的手术病理分期参照FIGO2009制定的标准。
1.2 实验方法
1.2.1 免疫组织化学过程（1）脱蜡：依次将载玻片放入二甲苯-二甲苯-100%酒精-100%酒精-95%酒精-90%酒精-80%酒精-70%酒精，在每个试剂中放10min；（2）抗原修复：脱蜡后在清水中冲洗一段时间，加入50ul3%H2O2浸泡10min，除去内源性的过氧化氢酶，然后倒掉H2O2，在清水中洗两次，再加入PH 6.0的柠檬酸缓冲液，放入微波炉中蒸煮3min（中火），冷却至室温，然后再蒸煮一次，冷却至室温，使抗原的位点暴露出来；（3）血清封闭：冷却至室温后，将柠檬酸缓冲液倒掉，水洗2次，并将载玻片置于PBS中5min，洗2次，擦干组织周围的PBS液，马上加上血清，使一些非特异性的位点封闭起来，然后放入37°C温箱中半小时；（4）加一抗：将温箱中的载玻片取出，用吸水纸擦干载玻片反面和正面组织周围的血清，加兔抗人Bip（C50B12）单克隆抗体（Cell Signaling公司），抗体工作浓度为1：200，于4°C箱中保存过夜；（5）加二抗：将载玻片从冰箱中取出，放入PBS中洗3次，每次5min，擦干组织周围的PBS后加上二抗，然后置于37°C温箱中半小时；（6）DAB显色：将片子从温箱中取出，放入PBS中洗3次，每次5min，擦干组织周围的PBS后加上DAB显色剂；（7）复染：将显色后的片子用清水冲洗一段时间后，浸泡于苏木精中染色半分钟；（8）脱水：将复染后的片子置于水中冲洗后，依次将载玻片放入70%酒精-80%酒精-90%酒精-95%酒精-100%酒精-100%酒精-二甲苯-二甲苯。每个试剂中放置2min，最后浸泡在二甲苯中，置于通风柜中；（9）封片：用中性树胶滴在组织旁边，再用盖玻片盖上，要先放平一侧，然后轻轻放下另一侧，以免产生气泡，封好片子后置于通风柜中晾干；（10）拍照：在光学显微镜下观察染色情况，并用显微摄像仪拍照。
1.2.2 结果判定标准 应用显微摄像仪对标本进行拍照，在Olympus 光学显微镜下观察标本组织中GRP78的显色情况，其结果判定标准采用半定量方法：GRP78主要表达在细胞质内，呈棕黄色颗粒。每个视野至少观察100个细胞，总分计算公式为A×B，A代表细胞染色百分比（≤5%评0分，6-25%评1分，26-50%评2分，51-75%评3分，>75%评4分），B为染色强度（未着色评0分，弱评1分，中评2分，强评3分）。故总分分级：9-12分（+++），5-8分（++），1-4分（+），0分（-）。
1.3 实验材料 二甲苯；梯度酒精；PBS缓冲液（配置：PH7.4PBS 1L配方：磷酸二氢钾0.27g，磷酸氢二钠1.42g，氯化钠8g，氯化钾0.2g）；3%过氧化氢（H2O2）；PH6.0柠檬酸缓冲液；4%羊血清；兔抗人Bip（C50B12）单克隆抗体（Cell Signaling），抗体工作浓度：1：200；羊抗兔二抗；DAB显色剂（配置：在1ml水中加1滴显色剂A，摇匀，然后加1滴显色剂B，摇匀，再加1滴显色剂C，摇匀。A：DAB，B：H2O2，C：磷酸缓冲液）；苏木精。
1.4 实验仪器 微波炉；37°C温箱；4℃湿化箱；Olympus 光学显微镜；显微摄像仪。
1.5 统计学分析方法 由于两样本量相差大，故两组之间GRP78蛋白表达水平及不同分类的子宫内膜癌组织中GRP78蛋白表达水平均采用非参数Ridit检验。采用SAS V8.0统计分析软件包对数据进行统计学分析。
2 结果
2.1 GRP78在两组样本中的免疫组化表达情况 采用半定量方法对子宫内膜癌组织及正常内膜组织标本进行打分，得出染色强度为—～+++。子宫内膜癌组织大多数表达在++～+++，正常组织大多表达在-～++，两者表达程度差异有显著统计学意义（P ＜0.05）。见图1、图2、表1。
注：非参数Ridit检验。
3.讨论
子宫内膜癌的病因和发病机制尚不清楚，特别是有关分子水平的研究报道很少。目前多项研究结果显示，葡萄糖调节蛋白78（GRP78）与肿瘤的发生发展有关。内质网腔内含有大量的可溶性分子伴侣及折叠酶，GRP78则是内质网中第一个被发现的分子伴侣，它是通过多肽结合域和ATP酶功能域之间的协同作用，辅助内质网中新生肽组成正确构象，维持内质网稳态及内环境的稳定。不仅如此，GRP78的功能很多，能促进正常生长状态下细胞蛋白质成熟，它的高表达能够抑制内质网应激对肿瘤细胞的损伤，对肿瘤细胞起到保护的作用，能促进肿瘤细胞增生和肿瘤血管生成，能够降低作用于G1期和S期化疗药物的毒性，从而使肿瘤细胞对一些化疗药物产生耐药性，还能作为早期诊断及监测肿瘤预后的生物学指标。Zheng等发现，在胃癌患者中，GRP78表达与肿瘤的分期有关（UICC分期），GRP78高表达患者的生存期较低表达患者短，GRP78在乳腺癌、结肠癌、肺癌等呈高表达。Guzel等最新研究显示，在人类子宫内膜上，GRP78的表达为月经周期依赖性，且与雌激素（E2）水平呈负相关，即在增生早期及分泌晚期，E2水平下降时，GRP78呈高表达；相反，在增生中晚期及分泌早中期，E2水平上升时，GRP78呈低表达，其机制可能与雌激素信号通路之间的交互应答（cross—talk）有关。但是，目前尚少有研究GRP78在子宫内膜癌中的表达规律及临床意义。
本研究结果显示，GRP78在子宫内膜癌组织中表达高于正常子宫内膜组织（P＜0.05）；GRP78在有子宫外转移（Ⅲ、Ⅳ期）患者组织中表达高于无子宫外转移（Ⅰ、Ⅱ期）患者（P＜0.05）。机体在肿瘤的作用之下，诱发内质网应激，促使体内GRP78大量的表达，也因此在肿瘤组织中，GRP78呈现高表达率。与GRP78在子宫内膜癌中间的表达和胃癌、乳腺癌的结果一致。但是，本研究也存在着一些不足之处。首先，由于一定的限制，仅搜集到当地医院的 81 例子宫内膜癌组织，样本量有一定的局限性。其次，尚未完善对其他子宫内膜癌其他病理类型的研究，也没有进一步探讨GRP78的机制等。
总之，GRP78在子宫内膜癌组织的表达呈增高趋势，提示GRP78参与了子宫内膜癌的发生、发展过程，GRP78高表达与子宫内膜癌子宫外转移有关，检测GRP78的表达可能有助于子宫内膜癌的预防、早期诊断及预后判断。应用基因手段抑制Grp78的表达可能抑制子宫内膜癌细胞的生长、增加子宫内膜癌细胞对化疗药物的敏感性等，利用Grp78为靶点或介质进行子宫内膜癌基因治疗具有广泛的应用前景，为子宫内膜癌的治疗提供新的靶点。
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基金项目：湖南省科技厅课题项目（2013SK3210）
论文作者:周绍明,舒楚强,胡赛男,张璞
论文发表刊物:《航空军医》2017年第3期
论文发表时间:2017/4/11
标签：子宫内膜论文; 组织论文; 肿瘤论文; 显色论文; 酒精论文; 内质网论文; 载玻片论文; 《航空军医》2017年第3期论文;