1南华大学附属第二医院肝胆内科 湖南 衡阳 421001
2南华大学附属第二医院消化内科 湖南 衡阳 421001
衡阳市科技局资助项目，项目基金号：2015KS32。
附第一作者：屈小勇（男，33岁，医学硕士，主治医师，南华大学附属第二医院肝胆外科
通讯作者：谭伟（主治医师、医学硕士，421001、湖南省衡阳市雁峰区雁城路12号、衡阳市中心医院肾内科）
【摘要】：目的 通过细胞生物学等方法深入探讨miR--185在人胃癌细胞的侵袭与转移中的作用，从而为胃癌的防治提供新思路。方法 以人胃癌细胞系SGC--7901细胞株及BGC--803细胞株为研究对象，分别转染miR--185模拟物及抑制物。应用实时荧光定量PCR技术，检测转染后miR--185mRNA的表达水平。通过CCK8方法检测miR--185对胃癌细胞侵袭转移的影响。结果 miR--185在转染miR--185模拟物细胞中的表达水平高于阴性对照，差异有统计学意义(P<0．05)。miR--185在转染miR--185抑制物细胞中的表达水平低于阴性对照，差异有统计学意义(P<0．05)。转染miR--185模拟物的细胞增殖率低于阴性对照(P<0．05)，转染miR--185抑制物的细胞增殖率高于阴性对照(P<0．05)。细胞体外迁移能力检测结果显示，转染miR--185模拟物者穿膜细胞数(68．2±9．9)个，少于阴性对照的(125．4±19．4)个(P<0．05)；细胞体外侵袭能力检测结果显示，转染miR--185模拟物者穿膜细胞数(49．2±8．7)个，少于阴性对照的(109．2±11．3)个，差异有统计学意义(P<0．05)。细胞体外迁移能力检测结果显示，转染miR--185抑制物者穿膜细胞数(75．8±6．8)个，多于阴性对照的(35．4±6．3)个(P<0．05)；细胞体外侵袭能力检测结果显示，转染miR--185抑制物者穿膜细胞数(68．2±6．5)个，多于阴性对照组的(31．7±5．9)个，差异有统计学意义(P<0．05)。结论 miR--185在胃癌细胞中明显低表达，并可能通过下调癌基因Cdc42的表达，抑制肿瘤细胞的增殖，从而发挥抑癌基因的功能。
【关键词】：miR--185；胃癌细胞侵袭转移；侵袭；分子机制
【中图分类号】R715【文献标识码】A【文章编号】1001-5213(2016)08-0441-02
胃癌是人类常见的恶性肿瘤之一，目前已经证实某些癌基因和抑癌基因与其发生、发展密切相关，但目前对胃癌转移的分子机制仍不完全清楚，因此筛选其发生与转移的关键分子，对胃癌的防治具有重要的意义。微小RNA(microRNA，miR-NA)是一种普遍存在于多种细胞生物中的内源性、非编码小RNA分子，长19—22个核苷酸，约占基因总数的2％[1]。近年来研究发现microRNA可作为类似癌基因、抑癌基因或其他方式调控肿瘤的发生、发展和转移过程[2]，这一发现为肿瘤转移的诊断和治疗提供了新的思路和靶点。其中Cdc42基因可能为miR--185的新靶点，miR--185靶向作用于Cdc42基因可能会对胃癌的发生、发展产生重要的影响。miRNA--185是本课题组首次发现的一种从人胃癌细胞株中筛选到的miRNA，前期研究结果表明，miRNA--185在胃癌细胞中表达低下，但其在胃癌细胞中的侵袭与转移作用机制仍不完全明了。本研究拟通过细胞、分子生物学等方法深入探讨miR--185在人胃癌细胞的侵袭与转移中的作用机制，从而为胃癌的防治提供新思路。
1材料与方法
1.1主要试剂和仪器。
1640培养基、胎牛血清FBS及胰蛋白酶(HyClone公司)，人胃癌细胞株SGC--7901及MGC--803(中科院上海细胞库)，TRIzol试剂购自Invitrogen公司公司；miR--185荧光定量PCR试剂盒；逆转录所需的dNTPs及逆转录酶、100bpDNALadderMarker；ABIPrism7000荧光定量PCR仪；Biophotometer生物分光光度计。组织、胃窦溃疡组织、胃窦炎性息肉及其癌旁组织的总RNA，Biophotometer生物分光光度计检测RNA质量和浓度，1.2％的甲醛变性凝胶电泳[3]。
1.2方法
1.2.1总RNA提纯
按TRIzol试剂说明书，采用TRizol一步法提取组织标本和细胞株中总RNA，DEPC水溶解RNA，使用ND--1000紫外／可见光分光光度计测量260nm(A260)和280nm(A280)下吸光度，对总RNA的质量进行鉴定，并调整RNA的浓度。本研究所提取组织和细胞株中总RNA样品的质量和浓度均符合PCR反应要求，提取的RNA分装保存于-80％超低温冰箱，或立即用于逆转录。
1.2.2实时荧光定量PCR检测血清中miR--185含量。
以RNA为模板，分别以miR--185和Cdc42反转录引物行逆转录反应，反转录条件为42℃60min，85℃5s，获得小鼠肝脏组织的miR--185和Cdc42DNA。分别以miR--185和Cdc42为模板，以miR--185和Cdc42的特异性引物实时荧光定量PCR，反应参数为95℃10min预变性，95℃15s，60℃30s荧光检测1次，共40个循环。
1.2.3CCK8检测肿瘤细胞的增殖能力
参照CCK8试剂盒说明书进行。将转染24h的SGC--7901细胞及BGC--823细胞以每孔(1～2)×103个细胞接种于96孔培养板中，每孔体积100μL，设空白对照(仅加培养基)；分别培养1、2、3、4d。每孔加入10μLCCK8，37℃继续培养2h后终止培养，以空白对照孔调零，酶标仪上450nm测定各孔吸光度值(OD值)，以相对应OD比值表示细胞增殖能力的大小。各组取3孔平均值，绘制增殖曲线，实验重复3次。
1.2.4Transwell侵袭实验检测
胃癌细胞的迁移及侵袭能力进行迁移实验时，接种200μL无血清培养基稀释的细胞(1X105·mL-1)，下室加入800μL含10％胎牛血清的1640培养液；37℃、5％CO2条件下培养24h后，取出培养小室，用甲醇固定20min，风干，吉姆萨染色30min，用湿棉签擦去上室底部基质胶及未侵袭细胞，将培养小室倒置，在光学显微镜下观察、照相，并每组随机选取5个视野计数每中倍视野滤膜底面的平均细胞数。进行侵袭实验前，用预冷不含血清的1640培养基稀释Matrigel基质胶，铺于8μL小孔聚碳酸酯滤膜的培养小室内制备好的小室用紫外线照射2h杀菌，使用前加入少量无血清的培养基置于培养箱中孵育1--2h使其水化。后续过程同迁移实验的步骤。
1.3统计学方法
采用SPSS13.0统计软件，每组实验至少重复3次。荧光定量PCR结果、Transwell迁移及侵袭实验检测结果方差齐性时采用两独立样本t检验，方差不齐时采用近似t检验。CCK8体外增殖实验结果采用方差分析。
2结果
2.1miR--185的表达
miR--185在转染miR--185模拟物细胞中的表达水平高于阴性对照，差异有统计学意义(P<0．05)。miR--185在转染miR--185抑制物细胞中的表达水平低于阴性对照，差异有统计学意义(P<0．05)。见图1。
3讨论
胃癌是世界上最常见肿瘤的第4位，恶性肿瘤死亡的第2位[4]。虽然化疗已经显现出了部分生存期的延长，但大多数化疗疗效局限且维持时间短，中位生存期为7-11个月，2年生存率<10％[5]。由于缺乏早期检测和诊断的生物标志物以及传统胃癌治疗的局限性，才导致胃癌的高病死率。因此，寻找胃癌早期诊断的生物标志物以及开发高效低毒药物成为当务之急。近年来，microRNA成为分子生物学研究的焦点。MicroRNA是一类含量丰富且高度保守的非编码内源性d~RNA分子，通过与靶基因mRNA的3’非编码区(UTR)完全或不完全结合，抑制蛋白的合成或者诱导靶基因的降解，从而在转录后水平对靶基因的表达进行负性调控[6]。microRNA对胃癌的发生、发展起着重要的调节作用，并将对胃癌的诊断、预后和化疗做出重要的指导作用。目前，已鉴定出来的人类miRNA约2000余种，调节人体内三分之一基因的mRNA表达。在肿瘤中高表达的miRNA与癌基因样功能类似，促进肿瘤的发生：低表达的miRNA与抑癌基因功能类似。近年来，随着科学家们对miRNA功能研究的进一步深入，发现许多与肿瘤细胞转移相关的基因均被相关miRNA所调控．导致肿瘤转移相关蛋白表达水平增高或下降．也导致肿瘤相关信号通路的改变，从而改变肿瘤的转移能力[7]。
生物信息学软件系统（如：Target Scan、PicTar等）预测Cdc42为许多miRNAs的靶点，如：miR--185、miR-224和 miR-133b等，这些miRNAs靶向于Cdc42可能会对胃癌的发生、发展产生重要的影响。Cdc42全称为细胞分裂周期蛋白42，大小为25×103，又称G25k，其基因定位于1p36.1。Cdc42是Rho家族成员之一，其与肿瘤的发生和转移等密切相关，主要通过调控细胞形态学改变，细胞与基质的黏附以及细胞骨架形成、重组，进而参与细胞的增殖、分化、凋亡的调节。近年来国内外的一些研究中，cdc42在许多恶性肿瘤如结直肠癌、胃癌等有促癌作用。
综上所述，miR--185在胃癌细胞的增殖、迁移、侵袭中发挥了重要的作用，为microRNA作为靶向肿瘤基因治疗的新靶点提供了重要的试验依据。但后续研究还需进一步。
【参考文献】
【1】马文静，李鲁，吕国栋，等．SYBRgreen实时荧光定量PCR检测微小RNA21的方法建立及在食管鳞癌中的应用[J]．生物技术，2010，20(1)：4548．
【2】黄伟，孙岩.MicroRNA与癌症的研究进展[J].天津医药，2009,37（3）：238--240.
【3】张晟春，王燕，张兴毅，等．两种荧光定量聚合酶链反应法检测乳腺癌组织中微小RNA-21的应用分析[J]．中国全科医学，2013，16(20)：624-628．
【4】Wu WK，Lee CW,Cho CH，et a1．MicroRNA dysregulation in gastric cancer：a new player enters the game[J]．Onco gene，2010，29(43)：5761．
【5】Van Cutsem E，Moiseyenko VM，Tjulandins，eta1．Phase III study of docetax elandcis platin plus fluorouracil compare dwimcis platin and fuorouracil a sfirst-line the rapy for advanced gastric cancer：a report of the V325 Study Group[J]．JClinOncol，2006，24(31)：4991--4997．
【6】Bartel DP MicroRNAs：genomics，biogenesis，mechanism，andfunction[J]．Cell，2004，1l6(2)：281-297．
【7】Vefissimo CS，Cheng S，Puigvert JC，et al .Combining double cortin-like kinase silenc in gandvinca alkaloids results in a synergistic apoptotic effect inneuroblastoma cells．J Pharmacol Exp Ther．2012，342(1)：119—130
论文作者:屈小勇1,谭伟*（通讯作者）, 李国庆2, 唐芬芬2
论文发表刊物:《中国医院药学杂志》2016年8月
论文发表时间:2016/10/27
标签：细胞论文; 胃癌论文; 转染论文; 基因论文; 阴性论文; 肿瘤论文; 细胞株论文; 《中国医院药学杂志》2016年8月论文;