摘要：目的 探讨愈痫灵颗粒对致痫大鼠海马神经元细胞凋亡及其调控蛋白（Bcl-2、Bax、C-fos）表达的影响。方法 建立癫痫大鼠模型，以丙戊酸钠为西药对照，愈痫灵颗粒为中药对照，免疫组化法检测海马神经元细胞Bcl-2、Bax、C-fos的表达，HE染色法检测凋亡细胞。结果 造模后致痫大鼠海马神经元细胞凋亡增加，Bcl-2、Bax、C-fos基因蛋白在大鼠海马区的表达增加，差异有统计学意义（P<0.01）；药物干预后，与模型组比较，愈痫灵颗粒组神经元细胞凋亡减轻，Bcl-2表达增加，Bax、C-fos的表达降低。结论 愈痫灵颗粒对癫痫大鼠的治疗作用与其减轻神经元细胞凋亡、调节海马神经元细胞Bcl-2、Bax、C-fos的表达有关。
关键词：愈痫灵颗粒；癫痫；海马神经元细胞；细胞凋亡；细胞凋亡调控蛋白
Effect of Yuxianling Granules on the Nerve cell apoptosis and its Regulatory proteins in the hippocampus of Epilepsy Model Rat
Liu Ye-hui1，Li Zhi-xiong2，Shi Xue-hui1，YANG Tao2，Wang Jing-jing2。
（1.The Second Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine，Changsha，Hunan 410005，2. Hunan University of Chinese Medicine，Changsha，Hunan 410208）
[Abstract]Objective To investigate the effect of Yuxianling Granules on the Nerve cell apoptosis and its Regulatory proteins in the hippocampus of Epilepsy Model Rat.Methods.Methods The epilepsy model Rat were prepared，valprote sodium as the control of Western medicine and Yuxianling as the control of Chinese medicine.The expression of Bcl-2、Bax、C-fos was tested by immuohistochemisty. Cell apoptosis was tested by HE colouration.Results After the modeling，the Nerve cell apoptosis
Increased，The expression of Bcl-2、Bax、C-fos were higher，the difference has statistical significance（P<0.01）；After the medicine intervention，compared with model group，Yuxianling Granules could reduced the Nerve cell apoptosis，the expression of Bcl-2 increased and the expression of Bax、C-fos reduced.Conclusion Yuxianling Granules in the treatment of epilepsy Model Rat is related with its reducing the Nerve cell apoptosis，and regulating the expression of Bcl-2、Bax、C-fos.
[Keywords] Yuxianling Granules；Epilepsy；hippocampus；Nerve cell apoptosis；Regulatory proteins
癫痫是一种发病率很高的神经系统疾患，其特点是持续存在能产生癫痫发作的易感性而致癫痫反复发作，并可以出现相应的神经生物学、认知、心理学以及社会等方面等严重后果[1]。目前全球有超过5000万的癫痫患者，其终生患病率接近1%，可累及各年龄段人群，且其患病无关性别与社会经济状况[2]。癫痫在发达国家总的发病率为20～70/10万/年；发展中国家在100/10万/年以上，我国在1982年进行的6城市癫痫流行病学调查结果是37/10万/年，其中以1～10岁发病率最高[3]。目前的抗癫痫药都只是控制癫痫症状的发作，而无法从根本上控制癫痫的发展进程。抗癫痫药物对行为和认知存在的潜在风险早已成为共识[4]。因此，进一步了解癫痫的发病机制以及抗癫痫药物作用机理，探索治疗癫痫的新方法，是医学工作者必须共同努力的方向。临床工作中不断有深层次问题需要探索，如何规范、合理运用各种先进的检查方法，进一步明确疾病的性质对癫痫的基础研究和临床实践都非常重要[5]。研究表明，癫痫发作时脑部神经元高度同步化异常放电，造成神经元凋亡[6]。癫痫的发生与脑内多种凋亡基因的功能失调密切相关，因此探讨细胞凋亡与癫痫发病的相关性，以及癫痫发作的调控机制，是当前癫痫研究的主要方向之一。
愈痫灵颗粒是由愈痫灵方（经验方）所组成，依托现代生物萃取技术制备的中成药制剂，多年来应用于临床取得可靠疗效。本实验从细胞凋亡及其调控基因蛋白角度来阐释愈痫灵颗粒治疗癫痫的作用机制。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 动物
SPF级雄性大鼠Sprague-Dawley（SD）大鼠，年龄3个月，体重300-350g，由湖南中医药大学实验动物中心提供。
1.1.2 药物
愈痫灵颗粒（由川芎、丹皮、石菖蒲、全蝎、蜈蚣、冰片等 13味组成，以下简称愈痫灵）由湖南中医药大学第一附属 医院药剂科制备成每克颗粒剂含生药 4 g；丙戊酸钠片（VPA），湖南省湘中制药有限公司，国药准字H43020874，批号：140521。
1.1.2 仪器
Eclipse生物显微镜（Nikon，日本）；图像采集分析系统（NIS-Elements Basic Research，日本）；Centrifuge 5810R高速冰冻离心机（Eppendort，美国）。
1.1.4试剂
免疫组化检测试剂盒及HE细胞凋亡检测试剂盒（购自武汉博士德生物工程有限公司）。
1.2 方法
1.2.1 动物模型制备
以新鲜超纯水配制浓度为1.75%PTZ溶液，每天同一时间准时给予35mg/kg（即2ml/kg）腹腔注射，诱发SD大鼠全身强直一阵挛发作（GTCS），并在注射PTZ后观察l小时内动物反应，连续观察28天。
1.2.2癫痫模型判定标准
致痫大鼠常规分为0-6级进行评判，0级：无惊厥发作；1级：可见点头或头部抽搐；2级：全身肌阵挛；3级：头部抽搐加前肢阵挛；4级：阵挛惊厥加后腿站立；5级：跌倒发作；6级：全身强直—阵挛性惊厥发作。凡连续5次记录2级或2级以上的大鼠为癫痫模型。凡连续5天发作程度达到4级以上的动物，暂停药一周，再次予相同剂量PTZ测试，如仍保持评分在4级以上发作认为造模成功。
1.2.3分组方法、给药方法
分组方法：选取100只清洁级SD大鼠，从中随机选取20只作为正常对照组。其余动物用戊四氮（PTZ）造模，根据预实验造模成功率约为75%左右，将符合模型标准的大鼠按随机区组设计方法，随机分为癫痫模型组、愈痫灵颗粒干预组、丙戊酸钠干预组共3组，每组20只。造模成功后第二天开始给药，连续7天，正常对照组灌胃0.9％氯化钠注射液，每日2mI/kg给药结束后次日，癫痫模型组、愈痫灵颗粒干预组、丙戊酸钠干预组再予PTZ55 mg/kg腹腔注射．正常对照组腹腔注射等量0.9％氯化钠注射液，然后观察大鼠痫性发作的潜伏期（即给药到首次发作的时间）进行行为学检测。于行为学观察24h后断头取脑组，将含有海马的脑组织进行检测指标。
1.2.4指标检测方法
Bcl-2、Bax、C-fos蛋白基因检测采用免疫组化法检测。
凋亡细胞检测采用HE染色法检测。
癫痫大鼠行为学观察。
1.2.5统计学处理
采用SPSS17.0统计软件进行统计分析，计量资料以“均数±标准差”（ ±s）表示，两组样本均数间比较，符合正态性、方差齐性用t检验，方差不齐者用t’检验，组内比较采用配对t检验；多组样本均数间比较，采用方差分析。非正态分布、方差不齐的计量资料以及等级资料采用秩和检验，相关分析采用一元相关与回归分析，图像分析数据进行单因素方差分析。P＜0.05，为差异有统计学意义。
2 结果
2.1行为学观察
正常对照组未出现癫痫发作。实验组大鼠在每天给予由新鲜超纯水配制成浓度为1.75%PTZ溶液35mg/kg（即2ml/kg）腹腔注射后1小时，连续28天惊厥程度达到4级以上的动物，停药一周后用相同剂量PTZ测试。5次记录连续2级或2级以上惊厥的大鼠为癫痫模型。5天惊厥程度连续达到4级以上的动物，停药一周，再次用相同剂量PTZ腹腔注射，如注射后惊厥发作Racine评分[7]保持在4级以上的大鼠视为造模成功。实验组大鼠造模成功62只，将符合模型标准的大鼠按随机区组设计方法，随机分为癫痫模型组、愈痫灵颗粒干预组、丙戊酸钠干预组共3组。每组20只。造模成功后第二天开始给药，连续7天，正常对照组灌胃0.9％氯化钠注射液，每日2mI/kg给药结束后次日，癫痫模型组、愈痫灵颗粒干预组、丙戊酸钠干预组再予PTZ55ms/ks腹腔注射。正常对照组腹腔注射等量0.9％氯化钠注射液，然后观察大鼠痫性发作的潜伏期（即给药到首次发作时间）进行行为学检测，结果见表1。结果显示，VPA组、YXL组与模型组比较，其潜伏期明显延长，差异明显（P<0.05），而VPA组与YXL组之间相比，差异无统计学意义（P> 0.05）。
表1 各组发作级别结果比较（ ±s，秒）
注：◇表示与正常对照组比较，P<0.01；*表示与模型组比较，P<0.01；#两治疗组比较P＞0.05。
2.4愈痫灵对戊四氮致痫大鼠海马Bax蛋白表达的影响 见表4。
采用免疫组化检测法，在Eclipse显微镜下，计数海马区Bax染色阳性细胞数，以断面上有细胞核数为准。结果显示：正常对照组中Bax蛋白染色阳性细胞表达较高，与其余各组相比，差异明显（P<0.01）；愈痫灵组及丙戊酸钠组Bax蛋白染色阳性细胞减少，与模型组相比，差异有统计学意义（P<0.05），愈痫灵组及丙戊酸钠组两组之间比较差异无统计学意义（P>0.05）。
表4 各组大鼠海马CA1区、CA3区Bax阳性细胞数比较（x±s）
注：◇表示与模型组比较P＞0.05；*表示与模型组比较P<0.01；#表示与正常对照组比较P<0.01；两治疗组比较P＞0.05。
3 讨论
细胞凋亡现象普遍存在于各种生物机体之中，细胞凋亡与神经系统疾病同样密切相关，如脑卒中、癫痫、神经系统肿瘤、神经系统自身免疫性疾病等。研究表明，癫痫发作后常常可导致神经细胞的死亡，包括坏死和细胞凋亡两种形式。张淑琴等[8]通过大鼠杏仁核点燃癫痫模型进行观察，发现凋亡细胞在癫痫发作1d后就已经有所增加，到第7周仍明显高于对照组。这表明凋亡现象长期存在，贯穿于癫痫大鼠发病的整个过程。吴原等[9]向大鼠侧脑室注射红藻氨酸后，发现凋亡细胞在癫痫发作后1d、1周和4周明显增多，同时观察到海马齿状回、丘脑区的神经元细胞存在凋亡现象。孙涛等[10]探讨神经元凋亡现象是否存在于颞叶癫痫海马硬化患者，发现神经元凋亡是癫痫患者海马硬化的形成原因之一。
Bcl-2、Bax、C-fos基因蛋白在神经元凋亡的调控基因，其中Bax、c-fos基因蛋白为促凋亡基因，Bcl-2基因蛋白是Bcl-2家族中抗凋亡的代表，为抑制凋亡基因，Bcl-2基因作为细胞凋亡的一个潜在抑制因子能够调节细胞的程序化死亡，其过度表达可抑制各种刺激如放射线、化疗、自由基等各种原因导致的细胞凋亡现象[11]。Bax基因蛋白能使细胞色素C得以穿过线粒体膜，激活Caspase-9以及Caspase-3，最终导致细胞凋亡。由此可见bax在线粒体依赖性凋亡途径中发挥着非常重要的作用。正常细胞内c-fosmRNA和fos蛋白的表达均很低[12]，而在活动性癫痫的机体中却出现c-fos在犁状区皮质、齿状回、海马快速的高表达[13、14]。Ismail等[15]在颞叶癫痫模型中发现海马CA1、CA3及内嗅皮质区出现细胞凋亡，同时发现c-fos在海马区、端脑中表达于癫痫大鼠成功点燃后4h开始增加，点燃后24h c-fos达高峰。郑金瓯[16]等采用在海马CA3区注射红藻氨酸成功建立癫痫模型，在癫痫发作后发现大鼠海马星形胶质细胞c-fos基因的表达于1h，3h，6h，c-fos基因表达明显升高，到12h有所下降，24h逐渐降至对照组水平。陈功等[17]用尼氏染色和TUNEL染色观察l4例海马硬化型颞叶癫痫患者的颞叶和海马标本制成脑片神经细胞变性和凋亡，观察c-fos表达水平。结果显示颞叶皮层与海马有较多凋亡细胞的表达，且正常神经细胞数量明显减少、形态异常，同时可见c-fos大量表达，与对照组进行比较有显著性差异。
“愈痫灵方”为第五批全国老中医药专家学术经验继承工作指导王净净老师的经验方，组方立意于中医经典名方礞石滚痰丸，并得到全国名老中医、著名中医内科学家欧阳琦研究员的指点，由金礞石、石菖蒲、竹茹、川芎、红花、熊胆粉、黄芩、全蝎、蜈蚣、僵蚕、地龙、刺五加、冰片共13味中药组成。全方合用，共奏活血祛瘀、化痰开窍、熄风通络之功效。经过20余年临床应用及试验研究证明其安全有效。近10年来已完成湖南省自然科学基金、湖南省教育厅重点相关课题等多个临床及动物试验研究研究，证实了其具有从多个靶点抗癫痫及改善癫痫认知功能障碍的作用。
本研究结果显示实验大鼠愈痫灵组、丙戊酸钠组的发作次数与模型组比较减少；模型组海马区神经元变性及坏死显著，表现为损伤细胞深染、固缩、核碎裂样改变，细胞间隙增大，细胞脱失明显，变性神经元呈现胞质和胞核水肿，体积增大。VPA组和YXL组海马神经元变性坏死和缺失的数量和程度均较其他两组组减轻。VPA组和YXL组能增加Bcl-2基因蛋白在海马区的表达，同时能减少Bax、C-fos促凋亡基因蛋白在实验大鼠在海马区的表达。
由此可得出结论 愈痫灵方能减轻癫痫大鼠发作次数，改变细胞凋亡基因在大鼠海马区的表达，从而对癫痫大鼠的大脑起到保护作用，值得临床推广应用及进一步深入研究。
参考文献
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基金项目：湖南省自然科学基金（2015JJ6086）；王净净全国名老中医药专家传承工作室建设项目（国中医药人教发[2016]42号）
作者简介：刘叶辉，男，医学博士，副主任医师。研究方向：中西医结合脑病研究。
通讯作者：王净净＊，男，教授，博士研究生导师。
论文作者:刘叶辉1,李智雄2,石学慧1,王净净2＊
论文发表刊物:《航空军医》2017年第20期
论文发表时间:2017/12/18
标签：癫痫论文; 细胞论文; 凋亡论文; 大鼠论文; 神经元论文; 模型论文; 基因论文; 《航空军医》2017年第20期论文;