摘要：金黄色葡萄球菌是引起食物中毒的主要病原体之一。它广泛分布于自然环境中，也存在于人体粘膜，鼻咽和皮肤中，因此大多数人携带金黄色葡萄球菌。同时，由于金黄色葡萄球菌对食物的威胁极大，在此阶段，应加强定量检测金黄色葡萄球菌的重要性，并应尽快探索高效，高质量的检测方法。对于相关领域科研工作者和同行业工作人员具有十分重要的参考意义。
关键词：金黄色葡萄球菌；定量检测方法；食品
1 引言
由微生物引起的食源性疾病一直是食品安全的主要问题。近年来，由于食源性致病菌，已经发生了一系列严重的食品安全问题，已有200多种已知疾病通过食物传播，每年造成约8 000例死亡。金黄色葡萄球菌（金黄色葡萄球菌）可以产生肠毒素。一旦食物被金黄色葡萄球菌污染，细菌可能迅速繁殖并产生肠毒素，从而导致食物中毒。据疾病控制中心称，金黄色葡萄球菌引起的食物中毒仅次于大肠杆菌。有必要开发快速有效的食源性致病菌检测方法。免疫测定法是广泛用于检测食品，环境和医药样品中细菌的快速方法之一。大多数免疫学方法基于光学检测酶联吸收剂，或发光产物，或荧光标记分子。用于免疫测定的传统合成荧光染料具有一些局限性。由于它们对光漂白的敏感性，它们不能长时间发荧光，它们广泛的激发和发射光谱常常使来自不同荧光团的信号重叠。如何确保食品安全已成为现阶段社会可持续健康发展道路上亟待解决的问题。根据调查数据，2015年第一季度，在所有食物中毒案例中，微生物食物中毒的人数高达43％，另外四分之一是由金黄色葡萄球菌引起的。的。综上所述，为了尽量减少食品安全事故发生的概率，相关人员需要密切关注金黄色葡萄球菌的定量检测。在实际实验操作的基础上，本文对金黄色葡萄球菌的主要检测方法进行了比较研究，以期对后期检测工作起到指导作用。
2 食品中金黄色葡萄球菌定量检测方法
2.1 Baird-Parker平板法
依据《GB 4789.10-2016 食品安全国家标准 食品微生物学检验 金黄色葡萄球菌检验》标准，Baird-Parker平板法用于从食物中分离和计数凝固酶阳性葡萄球菌。Baird-Parker的现有配方是对Zebovitz，Evan和Niven开发的先前配方的修改。加入丙酮酸钠作为选择性生长刺激剂，加入蛋黄乳液作为分化剂。培养基允许金黄色葡萄球菌的生长 并选择性地抑制大多数其他细菌的生长。选择性抑制被认为是由选择性亚碲酸盐和锂的组合引起的。加入甘氨酸和丙酮酸以增强葡萄球菌的生长。在35-37℃温育24至48小时后，金黄色葡萄球菌的菌落将呈黑色，凸起，有光泽，直径约为1-1.5mm。由金黄色葡萄球菌形成的非常明显的黑色菌落是培养基中亚碲酸盐还原的结果。这些菌落通常被清晰的区域包围，这是蛋白质水解或脂肪分解的结果。不透明区域将在这个透明区域内形成，这是脂肪酶或卵磷脂酶活性的结果。可以在该培养基上生长的其他细菌容易与金黄色葡萄球菌区分开，因为它们不形成黑色菌落。标本采集：传染性材料应立即直接提交给实验室，防止过热和过冷。如果处理有延迟，应将样本接种到适当的运输培养基上并冷藏直至接种。对样品的处理叙述如下：称取25g样品至盛有225mL7.5%氯化钠肉汤的无菌均质杯内，8000r/min~10000r/min均质1min~2min，或放入盛有225mL7.5%氯化钠肉汤无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min~ 2min。若样品为液态，吸取25mL样品至盛有225mL7.5%氯化钠肉汤的无菌锥形瓶（瓶内可预置适当数量的无菌玻璃珠）中，振荡混匀。但是该方法培养基配制工作量大、在试验过程中菌液不易涂抹均匀、不易吸收、不同试验员操作结果会有差异。
2.2 MPN计数法
这种方法适用于检测认为带有大量竞争菌的食品及其原料和未经处理的食品中的少量金黄色葡萄球菌。
1、样品制备：固体或半固体食品：以无菌操作称取25g样品，放入装有225mL灭菌生理盐水的灭菌均质杯内，于8000r/min均质1～2min，制成1：10样品匀液。2、选三个连续稀释度，从每个稀释度分别取1mL稀释样品液，接种3管含10％氯化钠胰蛋白胨大豆肉汤。3、用3mm接种环，从有细菌生长的各管中移取1环，划线接种于表面干燥的Baird-Parker琼脂平板，置36±1℃培养45～48h。4、从有细菌生长的每一平板上至少挑取1个可疑金黄色葡萄球菌菌落，移种到肉汤培养基中，置36±1℃培养20～24h。5、取肉汤培养物0.3mL同0.5mL凝固酶试验兔血浆于8mm×100mm试管内充分混合，置36±1℃培养，定时观察是否有凝块形成，至少观察6h，以内容物完全凝固，使试管倒置或倾斜时不流动者为阳性。
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MPN计数法采用的是经过增菌48h的10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤接种Baird－Parker平板，阳性检出率明显高于Baird－Parker平板直接计数法，此方法适合于金黄色葡萄球菌含量低、杂菌含量高的样品。但是MPN计数法阳性检出率也不能达到100%，反映出实验样品的理化性质、状态结构、对细菌的吸附等对金黄色葡萄球的检出都有一定的影响。
2.3 测试片法
金黄色葡萄球菌，大肠杆菌，粪大肠菌，阪崎肠杆菌，副溶血性弧菌，蜡状芽孢杆菌，大肠杆菌O157，肠炎沙门氏菌，阴沟肠杆菌，粪链球菌和铜绿假单胞菌标准菌株纯化和复壮后，挑取单个菌落并接种到营养物中琼脂倾斜，培养过夜后，用生理盐水洗脱，制备适当浓度的细菌悬浮液。吸出1mL上述细菌悬浮液并加入金黄色葡萄球菌试验片中。将每种菌株的两个菌株作为重复接种，并在（36±1）℃下培养24小时，并观察细菌生长。只有金黄色葡萄球菌显示出典型的紫红色斑块，大多数非靶细菌没有在试验片上生长，而一小部分如大肠杆菌显示蓝色斑块，这明显不同于目标细菌，表明试件具有良好的特异性。采用快速测试片法检测样品还具有其他的一些优势：省去了配制培养基、分装灭菌等前处理和试验后清洗玻璃器皿等一系列繁杂的准备和整理工作，能大幅度减少工作量；携带方便，检测成本较低；操作简便迅速，对操作人员和检验设备及场所的要求也不高，可在基层检验机构或食品生产企业进行推广应用。因此，该方法具有广阔的市场应用前景。
优点：不需要配制大量培养基，减少检测员的工作量；操作简单，检测员通过简单培训后就可熟练操作；培养时不占用培养箱空间。相比GB4789.10-2016的方法，缩短测试时间和操作步骤。
缺点：属于非标方法，使用前需进行方法确认，并需经过客户同意才可使用测试片进行金黄色葡萄球菌的定量测试；测试片价格高，会增加企业的运营成本，性价比偏低。
2.4使用分子生物学方法鉴定金黄色葡萄球菌
分子生物学方法包括核酸杂交和聚合酶链式反应。已经使用核酸杂交技术作为通过使用基因特异性核苷酸序列作为探针分析含有毒素基因的菌株的另外手段。靶向不同肠毒素基因的寡核苷酸探针将允许通过菌落印迹杂交对产毒金黄色葡萄球菌分离株进行特异性检测和分化。斑点杂交技术已被开发并应用于确定葡萄球菌菌株中的金黄色葡萄球菌基因。此外，核酸杂交和聚合酶链式反应已被广泛用于通过扩增相应的基因来检测金黄色葡萄球菌。目前，有几个变种核酸杂交和聚合酶链式反应已经开发了用于检测的金黄色葡萄球菌，例如多重核酸杂交和聚合酶链式反应，实时核酸杂交和聚合酶链式反应，逆转录酶核酸杂交和聚合酶链式反应（RT-核酸杂交和聚合酶链式反应），和环-介导的等温扩增。与其他基于核酸杂交和聚合酶链式反应的技术相比，多重核酸杂交和聚合酶链式反应的独特优势是使用不同引物同时检测几种金黄色葡萄球菌。核酸杂交和聚合酶链式反应还具有与其他技术相结合的优势，如最可能的数量（MPN-核酸杂交和聚合酶链式反应）和核酸杂交和聚合酶链式反应-酶联免疫吸附试验（核酸杂交和聚合酶链式反应-ELISA），可以提供敏感的结果。在可用的常规技术中（与动物试验相比），核酸杂交和聚合酶链式反应更快并且可以用于检测大多数种类的食物中的金黄色葡萄球菌，例如蔬菜，牛奶，奶酪和肉制品。然而，由于干扰核酸提取，核酸降解和/或核酸杂交和聚合酶链式反应的直接抑制所必需的靶细胞裂解，可能发生假阴性核酸杂交和聚合酶链式反应结果。此外，使用核酸杂交和聚合酶链式反应对微生物进行常规检测可能是昂贵且复杂的，并且需要专业操作人员进行测定。
3 结束语
快速检测技术在实际应用过程中有其自身的特点。在开发过程中，各种检测技术必将继续融合并相互影响，从而使检测技术和方法朝着高速、高质量和高效率的方向发展。
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论文作者:黎志坚,周怡
论文发表刊物:《基层建设》2019年第25期
论文发表时间:2019/12/9
标签：葡萄球菌论文; 金黄色论文; 链式反应论文; 核酸论文; 细菌论文; 培养基论文; 样品论文; 《基层建设》2019年第25期论文;