关键词：抗体药物 质谱 一级结构 高级结构
单克隆抗体药物的发展起源于1975年，Kohler 和Milstein 创立杂交瘤技术，为大量制备鼠源单克隆抗体提供了技术条件，开创了大规模制备单克隆抗体时代。抗体类药物是指含有抗体片段的蛋白类药物，可以和靶抗原特异性结合，并且更加安全有效，所以在恶性肿瘤、自身免疫性疾病、心血管疾病、感染和器官移植排斥等重大疾病上得到了快速的发展，是当前生物药物领域增长最快的一类药物。[1]
1.抗体药物发展新趋势
在生物药物领域，抗体药物占据着越来越重要的地位，2015年全球销售排名前10 位的药物中有6 个为抗体药物，分别是humira、enbrel、remicade、rituxan、avastin和Herceptin。抗体药物按来源分类可以分为：鼠源单克隆抗体、人鼠嵌合抗体、人源化抗体和全人源抗体。鼠源单克隆抗体是第一代的抗体药物，经过不断改造过渡到全人源单抗。目前，FDA 批准的单克隆抗体药物中，人源化单抗和全人源单抗数量已占据72%[2]
1.1抗体药物偶联物（ADC）
抗体药物偶联物（ADC）由单克隆抗体和小分子化合物两部分组成，小分子化合物通常是毒性很强的抗肿瘤小分子药物。通过抗体的靶向作用，ADC 的抗体部分和肿瘤细胞表面抗原特异性识别并结合，通过细胞内吞作用，将抗体和小分子化合物一起带进肿瘤细胞内部，并在细胞内部发生水解反应，释放出小分子化合物，从而杀死肿瘤细胞。[3]这样既可以降低小分子药物的毒性，同时具有靶向结合的作用。已经上市的两个ADC是Kadyla和Adcetris。
1.2双特异性抗体（BsAb）
双特异性抗体（BsAb）是含有两种特异性抗原结合位点的人工抗体，能在靶细胞和功能分子（细胞）之间架起桥梁，激发具有导向性的免疫反应，现已成为抗体工程领域的热点。由于基因工程的发展，目前双特异性抗体已经研发出多种类型[4]，主要类型有三功能双特异性抗体、IgG-scFv、三价双特异性分子、串联单链抗体(串联scFv) 、DVD-Ig 等多种形式。2014年第一个双特异性抗体Blinatumomab获FDA批准，靶向位点是CD19和CD3。
2.质谱技术
近年来质谱仪性能的显著改进主要基于开发出的两种离子化技术：一种是介质辅助的激光解吸/离子化(matrix-assisted laser desorption/ionization.MALDI) [5]技术。另一种是电喷雾离子化（Electrospray ionization，ESI）[6]技术。由于这两种电离技术的出现，使原本只能检测小分支的质谱技术，可以运用于检测生物大分子。
MALDI和ESI两种离子化方法都是软性离子化法，能够使生物大分子在离子化过程中的保持完整性，分析灵敏度都极高，对低浓度的生物大分子样本也有很好的检测效果。目前，高效液相色谱电喷雾质谱仪联用（HPLC-ESI-MS）及飞行时间质谱仪(HPLC-ESI-TOF)联用已成为蛋白质组学实验中最常用的质谱技术。通过质谱技术可以得到肽指纹图谱，并通过与二维电泳的联用分析蛋白质。现在这项技术越来越多的应用于抗体药物分析中。与其它抗体方法相比，质谱分析具有准确性高、灵敏度高、分析时间短和应用范围广的优势，但是由于质谱仪器高额的成本限制了其发展。
在过去质谱技术主要运用于对一级结构和序列的表征，而现在质谱技术越来越多地运用于高级结构的分析，而高级结构对于抗体药物的生物活性至关重要。过去只有对于小分子药物，质谱可以进行定量分析，对于大分子蛋白只能够进行定性分析，而现在生物质谱不断发展，现在已经可以进行半定量分析，相信在不久的未来生物大分子的定量分析也可以实现。
3.质谱技术在抗体药物一级结构分析中的应用
3.1完整抗体药物精确分子量测定
当得到抗体药物时，可以直接通过高分辨率的MALDI-TOF或者ESI-MS进行分子量的检测。通过对于脱糖后分子量的检测，可以对于抗体药物进行初步定性分析，并将可以作为药物常规放行的分析方法[7]。对于脱糖前的抗体药物进行分析，可以得到抗体药物的糖基化类型的信息及糖基化水平的分布[8]，对于快速了解生产工艺与药物质量的关系具有十分重要的意义。该方法可以对于样品的分子量进行快速检测，适用于工艺过程样品的快速检定。
3.2药物抗体偶联比（DAR）
对于赖氨酸链接的抗体偶联药物，采用C4 色谱柱及联用的质谱对去糖基化样品进行分析，根据偶联不同数目药物分子的质量数增加判断偶联数目[9]。对于半胱氨酸链接的抗体偶联药物，利用反相色谱( RP-HPLC) 串联质谱，测定药物抗体偶联比(DAR) [10]。对于质谱测定的结果，不仅可以给出确切的药物抗体偶联比值，更能够给出链接不同个小分子药物的分布情况，及反应过程副产物空链接头的分布情况。[11]该方法可以得到更为准确的小分子分布信息，和UV-DAR方法相比更为准确。
图1：抗体偶联物去卷积化前后图谱[9]
3.3肽指纹图谱
蛋白被特异酶切微店的蛋白酶水解后得到的肽片段质量图谱。由于不同的抗体药物具有不同的氨基酸序列，蛋白质被酶水解后，产生的肽片段也各不相同，肽混合物的质量数医具有指纹特征[12]。可以通过LC-ESI-MS进行肽片段的一级质量数的鉴定，也可以通过LC-ESI-MS/MS对于每个肽片段进行进一步确证，提高肽指纹图谱的准确性。对于抗体药物，可以对于利用质谱对于特征的氨基酸序列进行表征，定位在液相中的出峰时间，作为特征峰可以对于抗体药物进行有效的鉴别。该方法适用于终产品的放行鉴定，虽然检测时间比较长，但是对于样品的鉴别比较全面而准确。
3.4翻译后修饰研究
蛋白质的翻译后修饰（PTM）对于抗体药物的生物学功能十分重要。常见的翻译后修饰有：磷酸化、脱酰胺、甲硫氨酸氧化、糖基化修饰、N 端焦谷氨酸环化，C 端赖氨酸[13]切除等。一般特定的氨基酸的翻译后修饰，会给该氨基酸残基质量数的增加或者减少。如磷酸化会增加80Da；脱酰胺会减少1 Da等。因此，只用质谱分析仪检测蛋白和肽片段的分子量偏差，可以实现高灵敏、高通量和高精确地鉴别蛋白质的翻译后修饰的种类。[14]利用质谱同时可以对每个位点的修饰比例进行相对定量，从而可以比较不同批次之间药物的差异性，也可以用于对于早期细胞菌株的筛选。[15-17]相比较于传统的HPLC检测方法，质谱法不仅可以得出整体翻译后修饰的水平，也可以得到关于单个氨基酸水平的修饰水平。
3.5测定抗体药物降解产物
几乎所有的蛋白降解产物和原本的蛋白都存在分子量的差异，质谱可以检测分子量的差异，从而检测这种降解产物。但是对于分子量超过20ku的大分子量的蛋白质. 质谱的分辨率不够，不能够检测微小的分子量的改变。因此通常是由肽谱图和质谱来共同确定蛋白质的降解产物。将蛋白质酶解后的碎片用 ESI-MS 可找出与未降解蛋白质碎片的不同，来确证蛋白降解产物。[18]相比较于HIC-HPLC，质谱法不仅可以得出讲解产物的比例，还可以得到讲解产物的类型，对于分析蛋白质的结构变化具有十分重要的意义。
3.6 N端氨基酸序列检测
常规N端氨基酸检测用Edman 降解法进行检测，但是抗体药物有时候会出现N端环化的现象，在这种情况下用Edman 降解法需要先对抗体进行去封闭处理，但去封闭的效率直接影响N 端测序结果，而直接使用质谱可以直接测出N端的氨基酸序列，同时可以检测出N端环化的相对比例。[19]
4.质谱技术在抗体药物高级结构分析中的应用
4.1氢/氘交换质谱（HDX-MS）
常规的质谱只能获得蛋白的一级结构信息，对于蛋白的高级结构无法进行深入的研究。氢/氘交换质谱（HDX-MS）可以进行蛋白质构象，溶液动力学和表位映射进行分析。在一个典型的实验中，将蛋白质复合物放在D2O中不同的时间，使H和D进行交换。然后在强酸性条件及低温下（0℃）将反应淬灭。将这种状态下的蛋白用特异性的蛋白酶进行酶切，将酶切的肽段通过nano UPLC-MS分析，以评估各肽段的氘化水平。分离用离子淌度作为额外的分离手段可以提高序列覆盖率。在能够调查的蛋白质的高阶结构和动态结构技术中，HDX-MS已经证明适合单克隆抗体和单克隆抗体 - 抗原复合物的构象分析。例如利用HDX-MS，一个完整的糖基化的IgG1相对于其去糖基化的蛋白的相比，显示出糖基化如何影响的IgG1构象。 [20-22]
4.2离子淌度质谱法（IM-MS）。
离子淌度是根据蛋白的电荷和形状选择性分离的方法，可以区分相同分子量的蛋白和肽段，可用于检测蛋白的简单高级结构。IM-MS可以是一个实用的质谱表征的方法，因为它可以获得蛋白常规的高级结构，比如说蛋白是线性还是球形的，这在IM-MS中可以有很好的区分。[23]
4.3高分辨率傅立叶变换离子回旋共振质谱（FTICR-MS）
高分辨率傅立叶变换离子回旋共振质谱（FTICR-MS）能够检测最高质量数的质谱仪器，并且有着很高的分辨率。FTICR-MS是目前被公认为是蛋白质组学研究的有力工具，特别是和完整的蛋白质鉴定和上/下调翻译后修饰（PTM）蛋白质的鉴定。这预示着由FTICR-MS表征分子量很大的蛋白复合物，如完整的免疫球蛋白（IgA的二聚体或IgM五聚体），以及诸如抗体 - 抗原复合物的蛋白复合物。这是普通的质谱检测仪不具备的。[24]
4.4电子转移解离（ETD）检测二硫键错配。
二硫键的正确配对是维持蛋白高级结构的重要条件，当然蛋白质中也存在错误折叠的蛋白。经典的MS的方法依赖于对比还原和非还原样品质谱图，间接证明二硫键的存在。连接有二硫键的肽段通常是比较长的肽段，如果使用普通的裂解模式不能够得到较好的离子碎片。而在ETD的模式下，可以得到较好的离子碎片，进行二硫键的分析。使用LC-MS方法加上线性离子阱ETD仪，以确定蛋白的二硫键。[25-27]
4.小结
随着抗体药物的不断发展，需要对于抗体药物的结构信息不断进行深入的分析，质谱技术也随着这一要求不断进步。在现阶段，由于生物质谱分析的成本很高，并且对于人员的要求比较高，所以使其应用受到了限制。除此之外，对于质谱分析的样品必须保持低盐的缓冲体系，而大部分蛋白样品必须在高盐的体系中才能比较稳定，所以对于蛋白样品的前处理也十分复杂。当然随着技术的进步，可以预见质谱分析会越来越多地运用于抗体分析中，特别是在高级结构分析的领域，现阶段对于高级结构的分析只有传统的生物学活性的方法，通过质谱分析，可以让我们更多获得高级结构的信息，这对于抗体药物的分析是极为重要的。此外，现阶段的质谱分析只是半定量的结果，相信通过技术的发展，可以逐渐转变为绝对定量的分析。
参考文献
［1］王兰，朱磊，徐刚领，等．单克隆抗体类生物治疗药物研究进展[J]．中国药学杂志，2014，49( 23) : 2058-2064．
［2］李壮林，姚雪静. 单克隆抗体药物研究进展[J].药物生物技术，2014,21（5）：456-461.
［3］Austin CD,Wen X,Gazzard L,et al. Oxidizing potential of endosomes and lyosomes limits intracellular cleavage of disulfidebased antibody-drug conjugates[J]. Proc Natl Acad Sci,2005,102（50）:17987-17992.
［4］Kontenrmann,R. Dual targeting strategies with bispecific antibodies[J]. Mabs,2012,4（2）:182-197.
［5］Vestal M L,Juhasz P. Delayed extraction matrix-assisted laser desorption time-of-flight mass spectrometry.[J].Rapid Commun Mass Spectrom,1995,9:1044-1050
［6］Tisato F,Bolzati C,Porchia M.Contribution of electrospray mass spectrometry for characterization,design,and development of nitride technetium and rhenium heterocomplexes as potential radiopharmaceuticals[J]. Mass Spectrometry Reviews,Published Online,2004,23（5）:309-332.
［7］李萌,于传飞,王馨,等. 相对分子质量测定作为单抗药物常规放行分析方法的可行性商榷[J]. 药物分析杂志,2015,12:2076-2082.
［8］Zhu L, Guo Q, Guo H, et al.Versatile characterization of glycosylation modification in CTLA4-Ig fusion proteins by liquid chromatography-mass spectrometry. [J]. MAbs. 2014;6(6):1474-1485.
［9］于传飞,李萌,郭玮,等. 一种抗体药物偶联物中药物抗体偶联比的测定[J]. 药学学报,2014,03:363-367.
［10］于传飞,王文波,张峰, 等. 一种基于半胱氨酸偶联的抗体偶联药物的药物抗体偶联比测定[J]. 中国新药杂志,2015,20:2336-2340.
［11］Wakankar A Chen Y,Gokarn Y, et al. Analytical methods for physicochemical characterization of antibody drug conjugates. [J]. MAbs. 2011;3(2):161-172.
［12］Allen D, Baffi R, Bausch J, et al. Validation of peptide mapping for protein identity and genetic stability. Biologics and biotechnology section, pharmaceutical research and manufacturers of America.[J].Biologicals. 1996;24(3):255-275
［13］Duan X T，Dai L P，Chen S C,et al． Nano-scale liquid chromatography/mass spectrometry and on-the-fly orthogonal array optimization for quantification of therapeutic monoclonal antibodies and the application in preclinical analysis. [J]． J Chromatogr A,2012,1251( 17) : 63-73．
［14］Stackhouse N, Miller AK, Gadgil HS. A high-throughput UPLC method for the characterization of chemical modifications in monoclonal antibody molecules. [J]．J Pharm Sci. 2011;100(12):5115-5125.
［15］Haberger M, Bomans K, Diepold K, et al. Assessment of chemical modifications of sites in the CDRs of recombinant antibodies: Susceptibility vs. functionality of critical quality attributes. [J].MAbs. 2014;6(2):327-339.
［16］Du Y, Walsh A, Ehrick R, et al. Chromatographic analysis of the acidic and basic species of recombinant monoclonal antibodies. [J].MAbs. 2012;4(5):578-585.
［17］Ponniah G, Kita A, Nowak C, et al. Characterization of the acidic species of a monoclonal antibody using weak cation exchange chromatography and LC-MS. [J].Anal Chem. 2015;87(17):9084-9092.
［18］He XA, Washburn N, Arevalo E, et al. Analytical characterization of IgG Fc subclass variants through high-resolution separation combined with multiple LC-MS identification. [J].Anal Bioanal Chem. 2015;407(23):7055-7066.
［19］LI M Z,HAN W D,XING G H,et al． Research of N Terminal Sequencing Methods for Monoclonal Antibody Pharmaceuticals Blocked by Pyroglutamic Acid.[J]． Chin Biotechnol J,2013,33 ( 8) : 73-80．
［20］Houde D, Arndt J,Domeier W ,et al.Characterization of IgG1 Conformation and Conformational Dynamics by Hydrogen/Deuterium Exchange Mass Spectrometry. [J]．Anal. Chem. 2009, 81, 2644−2651.
［21］Houde D, Nazari ZE, Bou-Assaf GM, et al. Conformational Analysis of Proteins in Highly Concentrated Solutions by Dialysis-Coupled Hydrogen/Deuterium Exchange Mass Spectrometry.[J]．J Am Soc Mass Spectrom. 2016;27(4):669-676.
［22］Resetca D, Wilson DJ. Characterizing rapid, activity-linked conformational transitions in proteins via sub-second hydrogen deuterium exchange mass spectrometry.[J]．FEBS J. 2013;280(22):5616-5625.
［23］Bagal D, Valliere-Douglass J F, Balland A ,et al. Resolving disulfide structural isoforms of IgG2 monoclonal antibodies by ion mobility mass spectrometry. [J]．Anal. Chem. 2010, 82, 6751−6755.
［24］Valeja, S. G.; Kaiser, N. K.; Xian, F.; Hendrickson, C. L.; Rouse,J. C.; Marshall, A. G. Unit mass baseline resolution for an intact 148 kDa therapeutic monoclonal antibody by Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry. [J]．Anal. Chem. 2011, 83, 8391−8395.
［25］Li X J,Wang F Q,Xu W,et al. Disulfide bond assignment of an IgG1 monoclonal antibody by LC -MS with post-column partial reduction [J]． Analy Biochem，2013，436( 2) : 93-100．
［26］Yuan L,Arnold M E,Aubry A F,et al． Simple and efficient digestion of a monoclonal antibody in serum using pellet digestion:comparison with traditional digestion methods in LC-MS /MS bioanalysis [J]． Bioanalysis,2012,4( 24) : 2887-96．
［27］Li X, Xu W, Paporello B, Richardson D, et al． Liquid chromatography and mass spectrometry with post-column partial reduction for the analysis of native and scrambled disulfide bonds. [J]．Anal Biochem. 2013;439(2):184-186.
论文作者:高燕波
论文发表刊物:《科技新时代》2017年12期
论文发表时间:2018/1/29
标签：抗体论文; 药物论文; 质谱论文; 蛋白论文; 结构论文; 分子量论文; 蛋白质论文; 《科技新时代》2017年12期论文;