田 戈 姜 敏通讯作者
新疆医科大学附属中医医院国家中医临床研究基地 新疆乌鲁木齐 830000
【摘 要】目的：研究 Nrf2-ARE信号通路上关键因子的表达变化情况，探讨Nrf2-ARE信号通路在调节慢性阻塞性肺病氧化失衡过程中的作用机制。方法：80只小鼠随机分成4组，分别熏烟2个月、四个月和6个月，应用Fenton反应，ELISA，Real-time PCR等方法检测抑制羟自由基能力、Nrf2、GSH、蛋白及Nrf2、γ-GCS mRNA的表达，并行相关分析。结果：Fenton反应结果显示抑制羟自由基能力在6个月熏烟组显著高于正常组（P<0.05）；ELISA结果显示熏烟各组血清中GSH含量均高于对照组，其中熏烟4个月GSH含量与对照组相比差异显著（P<0.05），熏烟6个月GSH含量与对照组相比差异极显著（P<0.01）；Real-time PCR结果显示熏烟各组γ-GCS mRNA转录水平都高于正常组，其中熏烟6个月组γ-GCS mRNA水平显著高于对照组（P<0.01）；而Nrf2 蛋白及mRNA在各组表达无明显差异(P>0.05)；结论：过氧化物在熏烟各组小鼠肺组织中累积，可能通过活化Nrf2，促进Nrf2核积聚上调γ-GCS的基因表达，在氧化失衡中发挥作用。
【关键词】慢性阻塞性肺病，氧化应激，Nrf2-ARE信号通路，γ-谷氨酰半胱氨酸合酶
【中图分类号】R34 【文献标识码】B 【文章编号】1674-8999（2015）8-0187-02
慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)是一种可预防、可治疗的疾病，以不完全可逆的气流受限为特点，呈进行性加重[1]。COPD发病机制尚未完全清楚，目前研究主要集中在慢性炎症反应、蛋白酶/抗蛋白酶失衡、氧化应激和上皮细胞凋亡等方面[2,3]，氧化应激是造成 COPD 慢性全身损伤的重要原因。Nrf2-ARE防御性信号通路在抵抗内外界氧化应激反应，维持体内环境的稳定方面起到十分重要的作用。
本实验拟通过香烟烟雾吸入法建立COPD的小鼠模型，并检测造模不同时间段Nrf2-ARE信号通路上关键因子的表达变化情况，探讨Nrf2-ARE信号通路在调节慢性阻塞性肺病氧化失衡过程中的作用机制。
1 材料与方法
1.1 药物及试剂
Elisa试剂盒均购置于武汉优尔生科技有限公司，Mouse Nrf2 ELISA Kit， 1 Plate（货号SEL947Hu）； Mouse GSH ELISA Kit， 1 Plate（货号CEA294Ge）。
1.2实验动物及模型建立
清洁级雄性昆明小鼠80只，6~8周龄，质量18~20g，由新疆维吾尔自治区疾病控制中心提供。应用数字表法将动物随机分为正常组、熏烟2月组、熏烟4月组、熏烟6月组，每组20只。除正常组外，其余各组均使用自制熏烟箱进行熏烟，12支香烟/次，1日1次，每次1 h，分别持续2，4，6个月，造模结束。因本实验完全复制前期COPD小鼠造模过程且没有药物干预，所以死亡率很低，能确保实验顺利完成，造模结束后各组小鼠均为12只以上，符合统计要求。
1.3标本采集和处理
1.3.1肺组织匀浆收集：然后处死大鼠， 取右肺50mg 加入1mL冷生理盐水做肺组织匀浆，10000rpm离心10min，上清液于-80℃冰箱保存；
1.3.2血清收集：各组小鼠腹腔注射10%的水合氯醛 0.3 mL/100 g 以麻醉。麻醉后将小鼠仰面固定于手术台，75%酒精消毒皮肤后，打开腹腔，使用一次性真空采血针行腹主动脉采血，采血针另一端连接非抗凝负压采血管，找到腹部动脉血管抽取小鼠动脉血于采血管内，37℃静置30min，3000rpm离心10分钟收集血清，分装后标记，-80℃保存备用。
1.4测定肺组织匀浆中羟自由基OH-
严格接照Fenton反应试剂盒说明书操作步骤进行羟自由基含量的测定。预实验确定肺组织匀浆合适的稀释浓度5%，反应后通过gress试剂显色，生成红色物质，1cm光径，550nm测吸光度值，计算公式为抑制羟自由基能力（U/mgprot）=对照管吸光度-测定管吸光度标准管吸光度-空白管吸光度×标准管浓度÷（蛋白毫克数/ml×取样量）
1.5 肺组织总RNA的提取及反转录
将100 mg肺组织于液氮中研磨,在液氮挥发完全前用DEPC处理过的不锈钢钥匙把粉状物转加入于l mL的Trizol 裂解液中, 并振荡混匀；然后样品置于离心机中4℃、10000 r/min离心10 min；将上清转移到处理过的新离心管, 加入200 μL 氯仿震荡混匀， 并于室温静置5 min 后4℃、12 000 r/ min离心15 min；将上清转移到新的离心管，然后依次加入250 μL 异丙醇和250 μL 5M的NaCl溶液，震荡混匀，室温放置10 min使RNA 沉淀完全;于4℃、12 000 r/ min离心l0 min；小心弃去上清，然后加入1mL 70%的乙醇洗涤RNA，然后4℃、7500 r/ min离心5 min，弃上清，然后加入1mL95%的乙醇洗涤，同上离心后弃去上清, 室温干燥3 min， 然后溶 DEPC 处理过的水中；并通过紫外/可见分光光度计(NanoDrop ND- 2000 Spectrophotometer) 检测总RNA 的浓度和纯度。RNA 提取后加入DNA 酶对基因组进行消化。反转录使用Invitrogen公司的MLV 反转录试剂盒，严格按照说明进行，将反转录产物cDNA 置于- 70℃冰箱保存备用。
1.6 PCR引物设计
目的基因引物序列: Nrf2( PCR 产物为 165 bp )
上游引物: 5′-TTCAGCCAGCCCAGCACATC-3′
下游引物: 5′-CGTAGCCGAAGAAACCTCATTGTC-3′退火温度为58℃。
γ-GCS ( PCR 产物为 203bp )
上游引物: 5’- ACGGTCAGGTCATCACTATC -3’
下游引物: 5’- TCAAGGTAGGAGTTCAGAATG-3’,退火温度为 55℃。
β-actin ( PCR 产物为 205 bp )
上游引物: 5′-AACAGTCCGCCTAGAAGCAC-3′
下游引物: 5′-CGTTGACATCCGTAAAGACC-3′退火温度为 58℃。
1.7 Real- Time PCR
每组4个样品cDNA，每个重复进行3个平行实验, 按照invitrogen公司Platinum ?SYBR ?Green qPCR SuperMIX反应试剂盒的产品说明进行反应。将样品加入反应管中后放入Bio-RAD公司的C-1000 Thermal Cycler中进行检测，反应条件为: 95℃ 30 s, 95℃ 5 min, 95℃ 30 s, 58℃ 30 s, 72℃ 30 s, 35个循环。由于使用的是相对定量法即E-△△Ct法，所以必须对各个样品的扩增效率进行校正, 具体方法为：将cDNA 分别稀释10、 102、103、 104、 105和106倍，使用Real- time PCR 分别扩增3种基因，并做标准曲线， 得到斜率，利用公式：E= 10[ - 1/ slope]计算得到校正后各基因扩增效率[ 4, 5]。
1.8血清中细胞因子的检测
采用双抗体夹心酶联免疫吸附 ( ELISA ) 法检测小鼠血清中GSH和Nrf2的含量， 按试剂盒说明书操作规程进行检测，通过标准品吸光度值绘制标准曲线，然后计算各样本的值。
1.9 统计学分析
采用 SPSS17.0 软件进行统计学处理，数据以均数±标准差（ ±s）表示， 采用单因素方差分析和多重比较对各组进行比较分析，以 P <0.05 为差异有显著性。
2 结果
2.1各组中抑制羟自由基能力检测
由实验结果可知，与正常组相比，熏烟组抑制羟自由基能力均有增强，熏烟6个月组抑制羟自由基能力有显著差异，（如图2）。这很可能是由于这种协同作用，导致自由基增加刺激机体，使之增强其防御体系而发生的代偿性效应。
图2.正常组与熏烟各组小鼠肺组织匀浆抑制羟自由基能力
2.2Real-Time PCR结果
通过采集各组小鼠肺组织进行Nrf2-ARE信号通路相关因子的检测发现，熏烟各组γ-GCS mRNA转录水平都高于正常组，其中熏烟6个月组γ-GCS mRNA水平显著高于对照组（P<0.01,图3），虽然熏烟各组中Nrf2 mRNA转录水平较正常组有升高，但是统计分析比较无显著差异。
图3. 小鼠肺组织中γ-GCS转录水平的变化
图4. 小鼠肺组织中Nrf2转录水平的变化
2.3Elisa结果
Elisa结果见表1，熏烟各组血清中GSH含量均高于对照组，其中熏烟4个月GSH含量与对照组相比差异显著（P<0.05），熏烟6个月GSH含量与对照组相比差异极显著（P<0.01）；熏烟各组血清中Nrf2含量与对照组相比无明显差异。
表1：各组血清GSH和Nrf2含量
3 讨论
吸烟所致氧化应激反应是COPD发病、发展及恶化的主要因素。氧化应激是机体内在的氧化/抗氧化失衡，氧化程度超出抗氧化系统的清除能力，导致活性氧( reactive oxygen species，ＲOS)在体内或细胞内蓄积而引起的细胞毒性，最终导致组织损伤的过程[6]。Nrf2-ARE是近年新发现的机体抵抗内外界氧化损伤的防御性转导通路[7]。二相解毒酶的表达主要是通过此通路[8]。二相解毒酶催化内源性极性小分子物质如葡萄糖醛酸、谷胱甘肽(GSH)等，经共价键结合到外来物质或一相代谢活化物的分子上，使之失活、解毒，以维持机体内环境的稳定，起到抗毒、抗氧化、抗癌、抗衰老的作用[9]。
研究表明，ROS可开启Nrf2-ARE信号通路，上调抗氧化保护基因表达。羟自由基是机体内最强力、最活跃的氧自由基，其水平可反映体内促氧化的程度，GSH是机体具有多种生理功能的酶类，具有抗氧化损伤的作用[10]。在本组实验中，我们发现随着熏烟时间的延长，小鼠肺组织匀浆中OH-自由基含量逐渐增加，体内重要抗氧化酶γ-GCS mRNA及蛋白在不同熏烟阶段小鼠肺组织和血清中表达水平增高，GSH含量也随之增高，由此说明活性氧物质刺激机体产生氧化应激反应，机体通过上调GSH合成限速酶γ-GCS的表达促进GSH合成增加，参与局部抗氧化作用。Nrf2是调控γ-GCS基因表达的关键转录激活因子[11]。Nrf2 本身不具有任何抗氧化作用，在正常状态下，Nrf2 以非活化的形式位于胞浆中，氧化应激可激活 Nrf2，促使其入核并启动一系列抗氧化酶的表达，来对抗氧化应激[12]。本实验结果显示，熏烟各组Nrf2 mRNA水平和蛋白表达水平较正常组均无显著性差异，可能因为机体受到亲电试剂或氧化剂的作用，Keap1与Nrf2解耦联使得Nrf2转移入核，并与Maf蛋白结合成异二聚体后识别并结合ARE，启动二相解毒酶和抗氧化应激蛋白基因的转录，提高细胞抗氧化应激能力[13]。
随着对Nrf2-ARE信号通路在调节慢性阻塞性肺病氧化失衡过程中的作用机制的深入研究，将深化我们对于COPD发病机制的认识，并为COPD的抗氧化治疗提供新的思维和方法。
参考文献：
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基金项目：
新疆医科大学科研创新基金项目（ZYY201206）
作者简介：
田戈（1984-），女，学士，初级检验技师、助理实验师，主要从临床检验诊断方面的研究。
通讯作者：
姜敏，助理研究员，研究方向：呼吸系统生物化学与分子生物学方面的研究。
论文作者:田戈,姜敏通讯作者
论文发表刊物:《中医学报》2015年8月
论文发表时间:2015/12/3
标签：小鼠论文; 转录论文; 引物论文; 抗氧化论文; 自由基论文; 血清论文; 个月论文; 《中医学报》2015年8月论文;