绵阳市中心医院风湿免疫科 621000
摘要：目的：本文研究白细胞介素-35（Interleukin-35，IL-35）在类风湿关节炎（Rheumatoid Arthritis，RA）患者外周血清表达水平，分析RA患者与健康人外周血清IL-35的表达差异，与白细胞介素-17（Interleukin-17，IL-17）、RA免疫学指标及疾病活动性的关系，探讨IL-35在RA疾病过程中可能起的作用。方法：收集初次发病未经药物干预的RA患者和健康对照组血清，同时记录与RA患者对应的血沉（ESR）、C-反应蛋白（CRP）、抗环胍氨酸肽抗体（anti-CCP）、类风湿因子（RF）、关节压痛数、关节肿胀数及关节Ritchie指数等指标，并行DAS28评分。用酶联免疫吸附试验（ELISA）定量方法检测血清IL-35及IL-17水平。结果：RA组血清IL-35水平34.01±9.7明显低于健康对照组63.3±14.8（p<0.001）；轻中度活动的RA血清IL-35水平高于重度活动患者，但无统计学有意义（p=0.141）；RA组血清IL-17水平24.6±8.2明显高于健康对照组17.6±6.4（p<0.001）；RA组血清IL-35水平与IL-17水平（r=-0.319，p=0.035）、关节压痛数（r=-0.509，p=0.001）、关节肿胀数（r=-0.373，p=0.001）及关节Ritchie指数（r=-0.478，p=0.013）呈明显的负相关，与DAS28评分、RF、ESR、CRP、anti-CCP无相关性。结论：RA患者血清IL-35表达下调，与血清IL-17水平、关节压痛数、关节肿胀数及关节Ritchie指数呈现负相关，提示IL-35在RA发病及病情变化中可能起着关键的作用。
关键词：类风湿关节炎，IL-35，IL-17
【Abstract】Objective：We aimed to investigate the serum level of interleukin-35（IL-35）in patients with rheumatoid arthritis（RA）. The relationship between IL-35 and interleukin-17（IL-17），immunological index markers and disease activity score were also studied，The possible roles IL-35 may play in the pathogenesis of RA were also discussed.Methods：Serum samples of newly diagnosed RA patients without any drug therapy were collected in the study. Thirty healthy volunteers were recruited as the control，serum samples were collected. ESR，CRP，anti-CCP，RF，tender joint count，swollen joint count，Ritchie index and DAS28 score were measured and recorded. IL-35 and IL-17 had been detected in all 85 cases via ELISA. Result：IL-35 level in RA group was lower than that in health group（p＜0.05）；serum IL-17 level in RA group was higher than that in health group（p＜0.05）；the serum levels of IL-35 in RA patient negatively correlated with IL-17，tender joint count，swollen joint count and Ritchie articular index. Serum IL-35 level had not correlated with DAS28 scores，RF，ESR，CRP，and anti-CCP. Conclusion：IL-35 levels in RA patients are reduced and it negatively correlated with serum IL-17 levels，tender joint count，swollen joint count and Ritchie index.It means that IL-35 may play a key role in the pathogenesis and process of RA.
【Keywords】rheumatoid arthritis，Interleukin-35，interleukin-17
前言
RA是一种慢性、系统性炎性疾病，可累及多种组织及器官。RA发病机制目前仍不是很清楚，目前认为细胞因子在RA发病中起着至关重要的作用。IL-35是具有免疫抑制功能的细胞因子，可诱导CD4+CD25+treg增殖和分化。本文通过检测RA患者外周血IL-35的表达水平，探讨IL-35对RA临床的影响。
1 对象
所选RA患者均来自2015年10月至2016年11月在绵阳市中心医院住院患者，参照1987年美国风湿病学会修订的RA诊断标准，排除合并感染、过敏性、肿瘤及其他结缔组织病等疾病。男性10例，女性55例，平均年龄（44±11）岁，均为初次发病，未经治疗。健康对照组30例，均来自我院体检中心。
2 方法
2.1临床资料收集
记录RA患者28组关节Ritchie指数、ESR、SwJ+s、通过100mm视力对照表进行的一般状态评估（GH），CRP，RF，anti-CCP值，疾病活动指数（DAS28）值。
2.2 分离血清、ELISA检测血清IL-35及IL-17水平
取得患者同意，并签署知情同意书，采取外周血2ml，分离获得血清，放入-80摄氏度冰箱保存。将收集的血清，采用美国RD试剂盒分别测定血清中IL-35及IL-17水平。
2.3统计学处理
所有数据均应用SPSS16.0统计软件，计量资料服从正态分布时采用LSD-t检验，不服从正态分布时，采用Wilcoxon秩和检验；计数资料采用χ2检验；相关性应用spearman相关分析，p<0.05具有统计学意义。
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3结果
3.1各组IL-35水平比较
RA组血清IL-35浓度为34.0±9.7ng/L，明显低于健康对照组63.4±14.8ng/L（p<0.001）。RA组血清IL-17水平明显高于健康对照组（p<0.001）。病情轻中度活动（DAS28≤5.1）IL-35水平（35.3±9.4）ng/L高于病情重度活动（DAS28＞5.1）的患者（30.3±10.0）ng/L，但没有统计学意义（p=0.141）。
2.2 IL-35与IL-17及各临床指标相关性分析
RA组血清IL-35水平与IL-17（r=-0.319，p=0.035）呈负相关、与DAS28评分（r=-0.25，p=0.102）无相关性（p>0.05）；与Ritchie指数（r=-0.478，p=0.013）、关节压痛数（r=-0.509，p=001）、关节肿胀数（r=-0.373，p=0.001）呈负相关；与DAS28评分（r=-0.25，p=0.102）、ESR（r=0.022，p=0.887）、CRP（r=0.135，p=0.383）、RF（r=-0.015，p=0.925）、anti-CCP（r=0.143，p=0.353）无相关性。
4.讨论
类风湿关节炎（Rheumatoid arthritis，RA）是临床上常见的慢性自身免疫性疾病，主要病理特点是关节滑膜的慢性炎症、滑膜细胞增生、炎性细胞浸润、血管翳形成，进而侵犯软骨、韧带和肌腱等，从而造成关节破坏，导致关节的畸形和功能丧失。RA的发病机制与细胞免疫和体液免疫密切相关，细胞因子在RA发病及病程中扮演着重要的角色。研究发现具有免疫抑制功能的抗炎性细胞因子在免疫调节抑制及免疫耐受过程中具有重要的作用。RA患者体内这些抗炎性细胞因子在不能有效调节炎症反应导致免疫的过度激活，参与RA发病。
研究发现调节性T细胞可抑制淋巴细胞的增殖、活化和免疫效应，在维持机体免疫系统的平衡，尤其是在免疫耐受、防止自身免疫病和慢性炎症的发生中发挥着重要的作用。IL-35由调节性T细胞分泌，不仅有助于调节性T细胞抑制性功能的表达，同时能正反馈促进该细胞的生成[1]。因此，IL-35可能参与RA的发病。
研究发现IL-35是CD4+CD25+treg特异性抑制性细胞因子，在体内外均有很强的调节其分化及功能[8]，可诱导IL-35-iTR cells产生，在体内外具有更好的稳定性及更持久的免疫抑制功能[9]。研究发现，初发未经治疗的RA患者外周血中CD4+CD25+treg数量是减少的，从而导致RA免疫系统异常活化，丧失免疫耐受，从而自身反应性T细胞过度活化及大量炎性介质的产生及释放，介导组织损伤[3]。在RA患者关节液及外周血中CD4+CD25+treg的数量明显高于健康人，但其抑制免疫反应的活性却明显下降。初发RA患者CD4+CD25+treg数量是降低的，但随着治疗和病情的缓解逐渐与正常人没有什么差别4]。本研究发现，初诊RA未经药物治疗患者血清IL-35水平明显低于健康对照组，这可能因为RA患者体内CD4+CD25+treg数量的减少和功能的低下导致，同样低水平的IL-35可能对CD4+CD25+treg促增殖和促分化的功能大大的降低，尤其是IL-35依赖的CD4+CD25+treg数量可能明显减少。在RA的不同时期患者体内CD4+CD25+treg数量和功能可能有这差异，意味着IL-35的水平也可能有差异。在对不同疾病活动状态下RA患者血清IL-35水平进行比较发现病情轻中度活动者与重度活动者没有明显差别。
IL-35除了通过与CD4+CD25+treg相互作用发挥在自身免疫性疾病中调节过度激活的免疫外，还直接通过作用于效应性T细胞及影响一些炎性细胞因子的释放和功能以调节免疫反应。Wanda在给予实验组小鼠每日腹腔注射IL-35，而对照组给予PBS，10天后发现对照组出现了典型的关节炎症状，而且病理提示软骨破坏及炎性细胞浸润。因此，IL-35明显降低了关节炎的发生发展，阻止关节损伤，同时两组小鼠血清IL-17及IL-10水平出现了明显的差异[5]。Kochetkova等用IL-35处理CIA小鼠后发现小鼠体内及关节液中Th17的数量明显减少，同时IL-17水平下降，小鼠关节炎症及软骨破坏也得到了明显的缓解[6]。 本研究中发现RA组血清IL-17水平明显高于健康对照组，RA组IL-35水平与IL-17水平呈现出负相关。这表明IL-35参与了RA的发病过程，血清中IL-35的水平可能影响RA患者体内Th17细胞的数量和功能状态及IL-17水平和功能，同时体现了患者体内免疫紊乱及炎症反应的程度。在对RA组血清IL-35水平与炎症、免疫学及疾病活动指标分析发现其没有相关性，但与患者压痛关节数、肿胀关节数呈明显的负相关（p<0.05），IL-35对RA关节可能是一种保护性因素。
IL-35与自身免疫耐受关系密切，在RA病情控制以及免疫耐受的重建中可能发挥重要的作用[7]。通过促进内源性IL-35的表达或者给予外源性的IL-35可能有助于RA的治疗，并有可能在RA自身免疫耐受状态的重建发挥不可或缺的作用，通过针对IL-35的进一步的研究，可能有望在临床上作为RA新的生物治疗手段，并可能通过IL-35重建RA的免疫耐受状态。
参考文献：
[1]Zhao N et al Mesenchymal stem cells overexpressing IL-35 effectively inhibit CD4+ T cell function.[J] Cell Immunol.2017：61-66
[2]Collison，L.W. et al. The inhibitory cytokine IL-35 contributes to regulatory T-cell function[J]. Nature，2007；566–569.
[3]Lawson CA，et a1．Early rheumatoid arthritis is associatal with a deficit in the CD4+CD25 high regulatory T cells population in peripheral blood[J]．Rheumatology，2006；45（10）1210-1217．
[4]Ponchel F，Morgan AW et a1．Dysregulated lymphocyte proliferation and differentiation in patients with rheumatoid arthritis[J]．Blood，2002；100（13）：4550-4556
[5]Wanda Niedbala，et al.IL-35 is a novel cytokine with therapeutic effects against collagen-induced arthritis through the expansion of regulatory T cells and suppression of Th17 cells[J].Eur. J. Immunol. 2007；37：3021-3029.
[6]Kochetkova I，et al.. IL-35 stimulation of CD39+ regulatory T cells confers protection against collagen II-induced arthritis via the production of IL-10[J]. J immunol，2010；184（12）：7144-53.
[7]Guan SY；et al Interleukin-35：a Potential Therapeutic Agent for Autoimmune Diseases. [J] Inflammation.2017：303-310
作者简介：邓代华，男，主治医师，研究方向：类风湿关节炎的发病机制。
通讯作者简介：杨静，女，主任医师，教授，硕士生导师。
注：项目来源：绵阳市科技局项目（编号：12C006-6）
论文作者:邓代华,杨静,李思吟,张羽
论文发表刊物:《中国误诊学杂志》2017年第16期
论文发表时间:2017/11/27
标签：血清论文; 关节论文; 患者论文; 水平论文; 免疫论文; 细胞因子论文; 细胞论文; 《中国误诊学杂志》2017年第16期论文;