江苏省连云港市第一人民医院心内科 222202
生长分化因子15（GDF-15）是 TGF-β超家族中的一员，Bootcov等科学家早在1997年就有关于GDF-15蛋白结构和生物学功能的报道[1]。GDF-15在细胞内是以二硫健形式结合的非活化的二聚体蛋白前体，经过酶解以受体介导的胞吐方式向细胞外释放的具有生物活性的分泌形式单体蛋白。GDF-15主要表达于胎盘和前列腺中[2-3]，在心脏和其它重要脏器处于应激时也有大量表达。在心肌缺血缺氧过程中，伴随着大量心肌组织和细胞的能量代谢紊乱，引起缺血局部趋化因子和炎症因子的表达增高[4]。缺血心肌组织分泌的组织生长因子例如血管内皮生长因子（VEGF），转化生长因子-β（TGF-β），结缔组织生长因子（CTGF）等具有促进缺血区域血管新生的效应[5-8]。这些生长因子可以促进内皮细胞的增殖和血管再生的代偿功能，从而在缺血缺氧的心脏局部微环境发生血管新生和侧枝循环建立，即在缺血性心脏病中常发生的血管重构现象。本实验志在研究缺氧状态下脐静脉内皮细胞表达GDF-15的变化。
【摘 要】目的：观察缺氧状态下HUVECs细胞内外GDF-15水平的变化。方法：HUVECs取自健康的破腹产产妇分娩后新鲜的婴儿脐带，经分离、培养获得；通过化学缺氧的方法模拟体内心肌缺血时的组织缺氧环境；用PCR法测定需要检测的基因（mRNA），用western blot.检测需要检测的蛋白表达水平，用ELISA法测定HUVECs上清液中GDF-15因子浓度；检测在缺氧（0、2、6、12、24、36、48h）时HUVECs细胞中GDF-15基因和蛋白表达水平及细胞上清液中GDF-15因子浓度；结果：HUVECs在缺氧2h时细胞中GDF-15的mRNA水平较0h、6h、12h、24h、36h、48h显著上调，随缺氧时间延长，表达水平逐渐下调，灰度比0.77±0.08 VS 0.22±0.04、0.33±0.09、0.35±0.04、0.29±0.09、0.19±0.06、0.15±0.04，p＜0.05；缺氧2h、6h时细胞中蛋白水平较0h、12h、24h、36h、48h明显升高，随着缺氧时间延长，蛋白水平逐渐下调，灰度比0.36±0.04、0.30±0.00 VS 0.06±0.00、0.15±0.02、0.10±0.03、0.09±0.02、0.06±0.01，p＜0.05；细胞上清液中GDF-15水平缺氧2h组较0h、12h、24h、36h、48h 显著上调，随着缺氧时间延长，逐渐下调，11.93±1.55 VS 3.43±0.76、4.73±0.76、4.6±1.3、4.0±0.56、3.43±1.04，p＜0.05；结论：缺氧可导致HUVECs细胞内源性的GDF-15的转录、翻译和分泌水平出现上调，但长时间缺氧导致内源性GDF-15的水平急剧下调。.
【关键词】缺氧；生长分化因子-15；人脐静脉内皮细胞；
【中图分类号】R845.2+2【文献标识码】A【文章编号】2096-0867（2015）-11-091-03
Objective：To explore the change of the level of GDF-15 inside and outside the human umbilical vein endothelial cells（HUVECs）in hypoxia.Methods：HUVECs were obtained from cord blood of healthy cesarean delivery，isolated and cultured in vitro. We used the chemical hypoxia method which mimicked the myocardial ischemia condition in vivo. The mRNA levels of interested genes were detected by RT-PCR，the proteins levels by Western blot，and secretion levels of GDF-15 from HUVECs by ELISA. The mRNA，protein and supernatant levels of GDF-15 in HUVECs were determined at different time-points（0、2、6、12、24、36、48h）after hypoxia；Results：the mRNA level of GDF-15 in HUVECs at hypoxia for 2h was significantly upregulated compared with that at hypoxia for 0h、6h、12h、24h、36h and 48h，GDF-15 mRNA was gradually decreased with the prolonged hypoxia（Relative mRNA levels for 2h hypoxia 0.77±0.08 VS hypoxia for 0h、6h、12h、24h、36h and 48h，0.22±0.04、0.33±0.09、0.35±0.04、0.29±0.09、0.19±0.06、0.15±0.04，p＜0.05）；the protein levels of GDF-15 in HUVECs at hypoxia for 2h and 6h were significantly upregulated compared with that at hypoxia for 0h、12h、24h、36h and 48h. GDF-15 protein level was also gradually decreased with the prolonged hypoxia.（Relative protein levels for 2h and 6h hypoxia，0.36±0.04、0.30±0.00 VS hypoxia for 0h、12h、24h、36h and 48h，0.06±0.00、0.15±0.02、0.10±0.03、0.09±0.02、0.06±0.01，p＜0.05）；the supernatant levels of GDF-15 in HUVECs was upregulated at hypoxia for 2h，and gradually decreased with the prolonged hypoxia（Relative GDF-15 levels for 2h hypoxia，11.93±1.55 VS 3.43±0.76、4.73±0.76、4.6±1.3、4.0±0.56、3.43±1.04，p＜0.05）.Conclusion：The transcription，translation and secretion levels of GDF - 15 is raised by Hypoxia in HUVECs.
Key Words：Hypoxia；GDF-15；HUVECs；
一、材料
1主要试剂与仪器
1.1主要仪器与设备
RoterGene3000荧光定量PCR仪（澳大利亚RoterGene公司）
1.2主要试剂配制
细胞培养基：DMEM440ml、10%FBS 50ml青-链霉素双抗 2m、HEPES 1.0g、NaHCO3 1.15g，磁力搅拌待试剂完全溶解后调ph至7.2，加入ddH2O定溶，0.22um滤膜抽滤，4度保存。
细胞消化液：Trypsin（1：250，0.25%）0.25g、EDTA（0.5 mM，0.02%）0.02g、ddH2O 100ml，磁力搅拌待试剂完全溶解后，加入ddH2O定溶，0.22um滤膜抽滤，4度保存。
二、实验方法
一、内皮细胞的收集、分离、培养以及缺氧刺激
1.取材：在无菌条件下，我们取健康的剖腹产产妇分娩后新鲜的婴儿脐带，取长约15--20cm，一定要取没有被血管钳夹过的痕迹、尽量比较直、一定要没有凝血块。
2.内皮细胞分离：在脐静脉两端开口处，分别用丝线扎紧并固定在50ml注射器和带输液胶管的玻璃插管上，注入D-Hanks液冲洗静脉，至无血迹。用止血钳夹住玻璃插管上的输液胶管，通过注射器向脐静脉缓慢灌入0.1%胶原酶溶液，至血管充盈。注意两端封闭，以防液体返流。立即放入37℃的无菌D-Hanks液内，15min后取出。通过注射器吸取收集酶液，同时注入含20%小牛血清的M199培养液冲洗静脉，合并于同一离心管内，以1100rpm离心5min。弃去离心沉淀后的上清液。加入20%小牛血清的M199培养液（pH7.2），重新悬浮细胞。并调整至细胞密度为1.5X105-2.0 X105个／ml，接种于细胞培养六孔板中。放置在37℃、5%CO2培养箱培养。第二天弃掉细胞培养液，用D-Hanks液轻轻洗1次，以去除不贴壁的细胞或死细胞。换入新鲜含20%小牛血清、100IU／ml青霉素和100ug/ml链霉素的M199的培养液（pH7.2）。继续置37℃5%CO2培养箱培养。每2-3天换一次培养液，换培养液时要将原来的培养液倒去1／2--1／3左右，再加入新鲜的培养液至原来的量。待细胞长至融合状态后，即可行传代培养，传到当细胞传至2代后用于实验干预。
将上述HUVECs细胞（6孔板）置于生物缺氧盒（Biomerieux Genbox）中，再取一包缺氧发生剂（Cat．96124），在盒内撕开后立即盖紧盒盖，然后置于37℃，5%CO2培养箱培养。按体外培养的HUVECs细胞经不同时间段（0、2、6、12、24、36、48 h）的缺氧处理后，打开缺氧盒，分别提取细胞总RNA、总蛋白和细胞上清液，用于检测HUVECs细胞内源性mRNA转录水平、蛋白翻译水平以及GDF15细胞外的分泌情况。生物缺氧盒（Biomerieux Genbox）和缺氧发生剂（Cat．96124）均购自梅里埃公司。
三、RT-PCR检测GDF-15mRNA
在6孔板培养的HUEVCs细胞（1×106/孔），用1×PBS洗3遍后，吸静孔内液体，加入1mlTrizol处理细胞，用移液器反复轻轻吹打，然后转移至1.5mL的EP管，加入200ul氯仿，震荡30秒后室温静置10min，12000 rpm 4°C离心10min后，小心吸取上清转移至另一个干净无酶的1.5mL的EP管，加入500ul异丙醇，上下颠倒混匀后冰上孵育20 min。然后12000 rpm 4°C离心10min。去除上清后加入75%的DEPC酒精洗3遍后，风干后加入DEPC水溶解，-20°C保存。
RNA纯度和浓度检测：确认每个标本的总RNA的OD260/ OD280比值大于1.8，然后按照每个样品的OD值校正每个样品达到一致的浓度（500ng/ul）。
cDNA合成：将RNA按照TOYOBO公司说明书步骤进行逆转录反应：
RNA样品 10.0ul
5╳ReverTra buffer 5.0ul
dNTP 2.0ul
Oligo-dT 1.0ul
逆转录酶 1.0ul
Rnase Inhitor 1.0ul
加DEPC-H2O至总体积为20ul，42°C逆转录反应1小时后，95灭活5min，-20°C保存。
PCR扩增条件：94°C预变性2min ——（95°C 30s——55°C 30s——72°C 1min，35cycles）——72°C终延伸5min，4°C保存。
PCR扩增引物：
h-GDF-15：上游，5'-GTTGCGGAAACGCTACGAG-3'
下游，5'-GAACAGAGCCCGGTGAAGG-3'
h-VEGF：上游，5'-TTGACTGCTGTGGACTTGAG-3'
下游，5'-AGGACATAGGTCCTTTTAGG-3'
h-VEGFR2：上游，5'-CCTACAAGTGCTTCTACCG-3'
上游，5'-TCAATCCCCACATTTAGTT-3'
四、Western blot 检测GDF-15蛋白表达
HUEVCs细胞用RIPA加PMSF（100：1）进行冰上裂解，30min后15000rpm离心10min，提取上清，加入1×上样buffer，95°C处理3min，-80°C长期保存。利用BCA法测定每个样品的蛋白浓度，按顺序在10% SDS-PAGE胶上进行蛋白电泳，以15V电压0.07A电流，将目的蛋白转移至PVDF膜。加入5%BSA封闭后加入一抗（1：1000）4°C过夜孵育，1×PBS洗3遍后加入带HRP的二抗（1：5000），利用高敏曝光试剂进行蛋白显影。条带的相对量由Quantity One（Bio-Rad）统计计算。
五、酶联免疫法（ELISA）测定细胞上清中GDF-15水平
1、细胞上清样品准备和标准工作浓度准备曲线制备。不同时间点收集的内皮细胞上清液按试剂盒提供的样品稀释液1：4进行稀释，标准曲线如下图所示：
标准曲线制作方法示意图
2、从试剂盒提供的96孔板上取下所需样品数的微孔板条，剩余的置于铝箔袋密封4°C保存。
3、在每孔中添加100μL的测定稀释剂（RD1-9），包括标准曲线和阴性对照。
4、然后在每孔添加50μL的标准品、空白试剂或待测样品，用胶带覆盖后，在水平摇床上室温振动50转/min孵育2 h。
5、用缓冲液洗涤微孔板条三次。
6、加入GDF-15的特异性配体，再次覆盖胶带并在摇床上室温振动孵育1 h。
7、重复步骤5洗涤微孔板条三次。
8、添加200μL的底物溶液，室温需避光孵育30 min。
9、加入50μL的终止反应液，使孔内溶液颜色从蓝色转变黄色。如果绿色或颜色变化出现不均匀，轻轻敲击微孔板条使之充分混合。
10、用酶标仪在450 nm波长处30 min内测定各孔的吸光度值，并进行样品浓度计算和换算。
六、统计学处理
所有实验数据均重复3次，以均数±标准差（±s）形式表示。组间资料应用单因素方差分析，各项数值均用SPSS 11.0统计软件进行统计学分析处理，以P值小于0.05定义具有统计学差异
结果：
缺氧状态下HUVECs细胞内外GDF-15水平的变化。
如图1-14及表1-1、2所示：GDF15的mRNA和蛋白表达水平在缺氧2h后即出现明显升高，在6 小时仍保持较高表达水平，此后，随着缺氧时间延长，GDF-15表达水平显著下降。如表1-3及图1-5所示细胞外上清液中GDF-15因子浓度在缺氧2h时显著增加，在6小时时已下降，但仍保持在较高水平，此后随着缺氧时间延长，GDF-15因子浓度明显下降。以上结果提示：缺氧可导致HUVECs细胞内源性的GDF-15的转录、翻译和分泌水平出现上调，但长时间缺氧导致内源性GDF-15的水平急剧下调。
图1-1：缺氧（0~48h）过程中，HUVECs细胞中GDF-15的mRNA水平
表1-1 缺氧（0-48h）细胞中GDF-15的mRNA水平（±s）
0h（n=3）2h（n=3）6h（n=3）12h（n=3）24h（n=3）36h（n=3）48h（n=3）
灰度比0.22±0.040.77±0.08*0.33±0.09*Δ0.35±0.04Δ0.29±0.09Δ0.19±0.06Δ0.15±0.04*Δ
注：与缺氧0h组比较，*P＜0.05；与缺氧2h组比较，ΔP＜0.05。
图1-2缺氧（0~48h）过程中，HUVECs细胞中GDF-15的mRNA水平
注：与缺氧0h组比较，*P＜0.05。
注：与缺氧0h组比较，*P＜0.05；与缺氧2h组比较，# P＜0.05。
讨论：生长分化因子15（GDF-15）是 TGF-β超家族中的一员，Bootcov等科学家早在1997年就有关于GDF-15蛋白结构和生物学功能的报道[13]。如表1-3及图1-5所示细胞外上清液中GDF-15因子浓度在缺氧2h时显著增加，在6小时时已下降，但仍保持在较高水平，此后随着缺氧时间延长，GDF-15因子浓度明显下降。提示我们：缺氧可导致HUVECs细胞内源性的GDF-15的转录、翻译和分泌水平出现上调，但长时间缺氧导致内源性GDF-15的水平急剧下调。GDF-15在缺氧时上调，是否与细胞缺血缺氧状态下细胞耐缺氧及细胞缺氧后的修复，促进心肌再生及缺血区的血管新生有一定的关系。要说明的是这只是本研究的一部份。我们会进一步研究下去。
图1-5：缺氧（0~48h）过程中，HUVECs细胞分泌上清中GDF-15因子的水平
参考文献：
[1]Bootcov，M.R.，et al.，MIC-1，a novel macrophage inhibitory cytokine，is a divergent member of the TGF-beta superfamily. Proc Natl Acad Sci U S A，1997. 94（21）：p. 11514-9.
[2]Bottner，M.，et al.，Expression of a novel member of the TGF-beta superfamily，growth/differentiation factor-15/macrophage-inhibiting cytokine-1（GDF-15/MIC-1）in adult rat tissues. Cell Tissue Res，1999. 297（1）：p. 103-10.
[3]Ago，T. and J. Sadoshima，GDF15，a cardioprotective TGF-beta superfamily protein. Circ Res，2006. 98（3）：p. 294-7.
[4]Vilahur，G.，et al.，Molecular and cellular mechanisms involved in cardiac remodeling after acute myocardial infarction. J Mol Cell Cardiol，2011. 50（3）：p. 522-33.
[5]Banai，S.，et al.，Upregulation of vascular endothelial growth factor expression induced by myocardial ischaemia：implications for coronary angiogenesis. Cardiovasc Res，1994. 28（8）：p. 1176-9.
[6]Hashimoto，E.，et al.，Rapid induction of vascular endothelial growth factor expression by transient ischemia in rat heart. Am J Physiol，1994. 267（5 Pt 2）：p. H1948-54.
[7]Pearlman，J.D.，et al.，Magnetic resonance mapping demonstrates benefits of VEGF-induced myocardial angiogenesis. Nat Med，1995. 1（10）：p. 1085-9.
[8]Recchia，A.G.，et al.，Endothelin-1 induces connective tissue growth factor expression in cardiomyocytes. J Mol Cell Cardiol，2009. 46（3）：p. 352-9.
论文作者:宋和鉴,周艺,王莹,杨凯,江成功
论文发表刊物:《系统医学》2015年第1卷第11期
论文发表时间:2016/3/29
标签：细胞论文; 水平论文; 蛋白论文; 培养液论文; 因子论文; 浓度论文; 内皮论文; 《系统医学》2015年第1卷第11期论文;