人IL-8基因对宫颈癌侵袭和血管生成能力影响的实验研究论文_刘海凤

四川省成都市核工业416医院 妇产科 610051

摘要:目的:宫颈癌是全球发病率居第二位的妇女恶性肿瘤,在我国的发病率居首位[1],其高发区连接成片,且发病人群有年轻化的趋势[2],成为严重威胁妇女健康的疾病之一。宫颈癌的发生、发展是一个由量变到质变,由渐变到突变的过程。局部浸润和淋巴结转移不仅影响手术效果,而且直接关系患者预后。淋巴结转移是宫颈癌的主要转移途径,在早期即可发生,有文献报道,无淋巴结转移者五年生存率为82.2%,有淋巴结转移者五年生存率仅为50.8%[3]。

关键词:宫颈癌;IL-8;血管生成:CD34:CD57:成瘤时间;成瘤率:细胞增殖;侵袭转移;

血管生成是从已有的微血管系统形成新生血管的过程,是一种对生理和病理过程都十分关键的生物学过程。血管生成的调节有赖于血管生成因子和血管静止因子之间的平衡,它们分别促进和抑制肿瘤血管的生成。如果没有血管,氧气和营养物质的扩散就会受到抑制,那么肿瘤也不会生长。血管形成过程可有许多生长因子触发,这些生长因子可由肿瘤细胞自身和(或)其周围的基质细胞分泌的[4]。随着最近几年对肿瘤血管形成的研究,人们发现许多生长因子都具有使血管生成的功能,血管生成相关性趋化因子和细胞因子在肿瘤血管生成过程中有重要作用,其中最初被描述为嗜中性化学诱导物的CXC趋化因子IL-8正越来越多的引起人们的注意。

IL-8是1987年Yoshimur等[5]发现的第一个趋化因子,当时被命名为单核细胞衍生的中性粒细胞趋化因子,是与炎症相关的CXC趋化因子。随着对IL-8及其受体生物学活性和作用机制研究的深入,Strieter等[6]发现IL-8的NH2末端有一谷氨酸一亮氨酸一精氨酸(Glu-Leu-Arg)组成的三联体氨基酸基序一ELR基序,该基序在IL-8促血管生成中起重要作用。Murphy等[7]也发现IL-8参与肿瘤血管形成,与肿瘤的侵润、转移密切相关。随后研究者在小细胞肺癌[8]和胃癌[9]及卵巢癌[10]等也得出了类似的结果,提示IL-8 参与肿瘤的发生和发展。IL-8可以促进肿瘤细胞的增生,使肿瘤细胞向内皮细胞迁移[11];调节肿瘤细胞及周围基质细胞分泌MMP-2,MMP-9并增强其活性,从而促进胶原酶活性,提高肿瘤细胞的体[12]。IL-8也可以促进血管内皮细胞的增生、迁移、抑制其自发性凋亡及增加血管的通透性[13],有助于肿瘤细胞转移。另外,有研究显示淋巴管内皮细胞可通过分泌趋化因子吸引肿瘤细胞,进而主动促进肿瘤细胞的淋巴结转移[13]。但对IL-8在宫颈癌中的作用研究甚少,Tjiong等人[14]通过比较宫颈分泌物和阴道冲洗液中IL-8的水平认为宫颈癌和CIN病例阴道局部可能产生高水平的IL-8和IL-6,这些细胞因子有可能对局部炎症反应和肿瘤生长有一定作用。日本的Fujimot等人[15]的研究表明IL-8与宫颈癌的血管生成及预后相关,但并未阐明其分子作用机制。吴素慧等[16]对早期宫颈鳞癌进行了cDNA基因芯片筛查,结果表明IL-8在有淋巴结转移宫颈癌组织中的表达较无淋巴结转移者高3.4倍,推测其可能在早期宫颈癌的浸润、转移中起重要作用。

尽管宫颈癌的治疗研究已近百年,成绩显著,但其疗效还未能达到普遍接近“早期宫颈癌5年生存率90%-100%”的水平。为进一步探讨早期宫颈癌发生、发展及淋巴结转移机制,以尽早有效地诊断、治疗宫颈癌,近些年来,随着细胞工程和基因工程技术的发展,肿瘤免疫治疗亦得以迅猛发展,细胞因子基因治疗成为目前研究的热点。本实验通过动物实验,应用免疫组化法比较CD34及CD57在宫颈癌移植瘤组织中的表达情况,观察IL-8对宫颈癌侵袭和转移能力的影响,并探索其作用机制,以期为宫颈癌的诊治和预后判断提供新的指标。现多采用免疫组织化学技术对肿瘤微血管进行定量计算,即微血管密度计数,目前反映微血管密度的标记物有CD34,CD31,CD105和vs因子等,其中CD34是较敏感和较特异的肿瘤新生血管内皮细胞表面标志,CD34又称为人定向造血干细胞抗原,在造血干细胞、血管内皮细胞等都有表达。在肿瘤组织中,其表达与肿瘤血管内皮细胞的增殖、移行有关,并被认为是判断肿瘤患者预后的一个独立因素。NK细胞是机体免疫中一类对多种靶细胞有自发细胞毒活性的效应细胞,在抗肿瘤中主要发挥非特异性免疫作用,NK细胞在启动杀瘤作用时不需要复杂的抗原呈递作用,也不受主要组织相容复合体(MHC)的限制,能直接释放特异性杀伤蛋白-穿孔素(pertorin)、细胞毒因子(NKCF),对靶细胞起溶解杀伤作用,故认为是机体抗肿瘤,抗感染的第一道防线[17,18]。CD 57(I-INK一1,leu一7)是一种分子量为110000的糖蛋白,被认为是人自然杀伤细胞的特异性表面标记,也存在于T淋巴细胞上和一些肿瘤细胞表面[19,20],外周血中30%-80%的NK细胞可表达此抗原,故其阳性细胞数量水平在一定程度上能反映NK细胞的功能。

方法:

1.细胞和实验动物

Hela/pcDNA3.1(+)–h/IL-8细胞、Hela/pcDNA3.1(+)–h细胞和Hela细胞由本室构建并保存。

SPF级BALB/c-nu裸小鼠,21只,雌性,4-6周龄,体重16-18g,购自北京协和动物中心。

2.Hela/pcDNA3.1(+)–h/IL-8细胞、 Hela/pcDNA3.1(+)–h细胞和Hela细胞分别培养至对数生长期,取1.5×107个细胞(0.2ml),常规消毒皮肤后,接种于裸鼠右后背部皮下,当肿瘤长至直径约为5 mm时视为成瘤,并记录成瘤天数及成瘤率。

3.成瘤后每周测量各组肿瘤的纵径和横径一次,通过公式V=π/6×长×宽²计算肿瘤体积(mm³),估算肿瘤体积。

4.接种肿瘤细胞9周后颈椎脱臼处死小鼠,完整剥离肿瘤组织及肺组织。

5.将小鼠成瘤组织及肺组织按病理学制样常规行福尔马林固定,石蜡包埋,切片,通过HE染色,观察肺组织的转移情况;通过免疫组化法观察CD34及CD57在三组瘤组织中的表达情况。

结果:

1.成功构建裸鼠移植瘤模型,各组成瘤率均为100%。两两比较结果显示,IL-8组成瘤时间与空质粒组及阴性对照组有明显差异(P<0.05),空质粒组与阴性对照组之间无明显差异(P>0.05)。

2.7、8、9周IL-8组肿瘤生长活跃,体积明显大于空质粒组及阴性对照组,两两比较有统计学意义(P<0.05),前6周各组肿瘤体积比较无明显差别(P>0.05)。

3.免疫组化结果

MVD免疫组化结果:IL-8组肿瘤组织中CD34阳性表达明显增加,空质粒和阴性对照组的肿瘤组织内可见少量阳性反应。两两比较结果显示,IL-8组CD34平均光密度值(OD)值与空质粒组及阴性对照组均有明显差异(P<0.05),空质粒组与阴性对照组之间无明显差异(P>0.05)

CD57免疫组化结果:空质粒和阴性对照组的肿瘤组织内可见大量阳性反应,IL-8组肿瘤组织中阳性表达明显少于空质粒和阴性对照组。两两比较结果显示,IL-8组CD57阳性细胞数与空质粒组及阴性对照组均有明显差异(P<0.05),空质粒组与阴性对照组之间无明显差异(P>0.05)。

4.各实验组肺组织均未见癌组织转移。

结论:

1.成功构建IL-8基因裸鼠移植瘤模型,通过比较各组的成瘤率、成瘤时间及肿瘤体积证实IL-8能够促进肿瘤生长、增殖。

2. 动物实验研究发现IL-8促进肿瘤组织内毛细血管的生成,为宫颈癌组织生长侵袭和远处转移提供必要条件。

3.CD57低表达可能与宫颈癌组织生长侵袭和远处转移有关。

4.各组肺组织中无癌细胞的转移。

Objective:Uterine cervix carcinoma is the second commonest female cancer worldwide,The Prevalence lies in first Place in our country(China)[1].The areas of its high occurrence are all connected with each other and people who developed it are at a much younger age than before[2].It has become one of the main diseases which severely threaten the health of women in our country.The occurrence of cervical cancer development is a quantitative change to qualitative change,from gradient to the mutation process.Local infiltration and lymph node metastasis not only influence the operation effect but also correlate directly with the prognosis of patients.Lymph node metastasis is the main route of metastasis of uterine cervix carcinoma,and could take place in the early stage.It has been reported that the 5-year survival rate of the patients who had no lymph node metastases was 82.2% and who had lymph node metastasis was 50.8%[3].

Angiogenesis is the process that from the previously blood capillary system to form new vessels,and plays important part in the physiology and pathology process.The regulation of angiogenesis depends on the balance between angiogenesis factors and vascular static factor factors,they discern to promote and restrain the tumor’s angiogenesis.If there is no blood vessel,the diffusion of oxygen and nutrient substance will be restrained,then,the tumor can not grow up.Angiogenesis process has many growth factors’ trigger,These growth factors are from tumor cell-self or their peripheral matrix cell[4].Along with the last years’ investigation of angiogenesis,people discovered that all manners of growth factors are all can promote angiogenesis.Angiogenesis correction chemotatic factors and cytokine play important part in angiogenesis process,among these factors,IL-8 which has been described neutrophilia chemical inductor initial,is one of CXC chemotatic factors,today,more and more people pay attention to it.

IL-8 was discovered in 1987,the first one,etc.Yoshimur[5] chemotactic factor,was then named monocyte-derived neutrophil chemotactic factor is associated with inflammation-related CXC chemokines.Along with the investigation functional mechanism of IL-8 and its acceptor,Strieter[6] discovered that NH2 termination of IL-8 had a ELR motif,playing an important role in angiogenesis.Murphy[7] also found that IL-8 involved in tumor angiogenesis,and tumor invasion,metastasis.Followed by researchers in small cell lung cancer[8] and stomach cancer[9] and ovarian cancer[10],and so have come to similar results,suggesting that IL-8 involved in tumor occurrence and development.IL-8 can promote the proliferation of tumor cells to tumor cells to endothelial cell [11] migration;regulating tumor cells and surrounding stromal cells secrete MMP-2,MMP-9 and to enhance its activity, thereby contributing to collagenase activity and increased in vitro invasion[12] of tumor cells.IL-8 can also promote vascular endothelial cell proliferation,migration,inhibit the spontaneous apoptosis and increased permeability of blood vessels[13] contribute to tumor cell metastasis.In addition,studies have shown that lymphatic endothelial cells through the secretion of chemokines in attracting tumor cells,and then take the initiative to promote lymph node metastasis of tumor cells.But until now,there has been little investigation of IL-8 in uterine cervix cancer.Tjiong[14] and others by comparing the cervical secretions and vaginal washing fluid levels of IL-8 that the cases of cervical cancer and CIN may have high levels of local vaginal IL-8 and IL-6,these cytokines may have local inflammatory response and tumor growth of a role.Japan's Fujimot [15] and others studies have shown that IL-8 and cervical cancer angiogenesis and prognosis,but did not clarify the molecular mechanism of action.Suhui Wu[16],etc.carried out in early cervical squamous cell carcinoma cDNA microarray screening results show that IL-8 in a lymph node metastasis of cervical cancer tissue than those without lymph node metastasis was 3.4 times higher,suggesting it may at an early stage of cervical cancer invasion and metastasis play an important role.

Although the research on the treatment of UCC has continued for nearly a hundred years and the result is very striking,the 5-year survival rate of early UCC hasn’t reached 90%-100%.To improve the treatment and promote the curative effect,in recent years,with the technological development of cell engineering and generic engineering,tumor immunotherapy is also developing rapidly.Recently cytokine gene therapy has become the focus of research.In this study,through animal experiments,immunohistochemical staining compared CD34 and CD57 in cervical tumor tissue expression was observed IL-8 in cervical cancer invasion and metastasis ability of and explore their mechanisms of action,with a view to cervical cancer The treatment and prognosis of new indicators.Now more than immunohistochemical techniques for quantitative microvessel count,that microvessel density count,this is MVD.Microvessel density,reflecting the markers are CD34,CD31,CD105,and vs factors,among which CD34 is a more sensitive and more specific for tumor angiogenesis endothelial cell surface marker,CD34 known as hematopoietic stem cell antigen targeted Wei Ren,in the hematopoietic stem cells,vascular endothelial cells,and others have expressed.In tumor tissues,its expression and tumor vascular endothelial cell proliferation,migration and related,and is considered to determine the prognosis of cancer patients as an independent factor.NK cell is one effector cell which has spontaneous cytototix reactive and effects on many kinds of target cells on immune function of organism.It play in the main anti-tumor non-specific immune function,It is neither need a complex antigen-presenting role nor restriction from the major histocompatibility complex(MHC),to release specific anti-protein -- pertorin(pertorin),cytotoxic factor(NKCF)directly.It can dissolute and kill the target cell,so it is considered to be the body of anti-tumor,anti-infection of the first line of defense[17,18].CD 57(I-INK 1 1,leu-7)is a glycoprotein with a molecular weight of 110000,is considered the specificity of human natural killer cell surface markers.Also present in T lymphocytes and some tumor cell surface [19,20].The formerly study indicated that CD57 antigen can hold back the proliferation of homeocyte.In peripheral blood of 30% -80% of the NK cells can express views antigens,so the level of positive cells to some extent reflect the function of NK cells.

Methods:

1 Cells and experimental animal

Hela/pcDNA3.1(+)–h/IL-8 cell and Hela/pcDNA3.1(+)–h cell,these cells all come from laboratory.

Nude-mice,21,female,aged 4-6 week,body mass is 16-18g,buy from animal Center of Beijing Concord.

2 Hela/pcDNA3.1(+)-h/IL-8 cells,Hela/pcDNA3.1(+)-h cells and Hela cells were cultured to logarithmic growth phase,taking 1.5×107 cells(0.2ml),conventional After skin disinfection and inoculated subcutaneously in nude mice,after the right,when the tumor grew to a diameter of about 5 mm were regarded as tumorigenicity,and record the animal tumorigenicity time and rate.

3 After animal tumorigenicity,to measure every group tumor’s length and width,through formula V=π/6×a×b² to calculate tumor volume(mm³).

4 9 weeks after inoculation of tumor cells mice were sacrificed cervical dislocation,complete stripping tumor tissue and lung tissue.

5 The nude mice tumor was paraffin-embedded and prepared into histologic section,and the tumor cells morphology was observed by HE staining,the expression of CD34 and CD57 in tumor tissue was detected by immunohistochemical staining.

Result:

1.The subcutaneously transplant nude mouse models were successfully established.The animal tumorigenicity rate are all 100%.Hela/pcDNA3.1(+)–h/IL-8 cell group’s tumorigenicity time is obviously lower than Hela/pcDNA3.1(+)–h cell group’s and Hela cell group’s(P<0.05),there are no obviously distinction between Hela/pcDNA3.1(+)–h cell group and Hela cell group(P>0.05).

2.The gross tumor volume of the 7,8,9week,the Hela/pcDNA3.1(+)–h/IL-8 cell group’ volume obviously bigger than Hela/pcDNA3.1(+)–h cell group and Hela cell group(P<0.05).After subcutaneously transplant,before sixth week the volume comparion has no significant differenct(P>0.05).

3.The immunohistochemical result

The immunohistochemical result of MVD:The CD34 expression of Hela/pcDNA3.1(+)–h/IL-8 cell group is obviously.Hela/pcDNA3.1(+)–h/IL-8 cell group obviously higher than Hela/pcDNA3.1(+)–h cell group and Hela cell group(P<0.05),there are no obviously distinction between Hela/pcDNA3.1(+)–h cell group and Hela cell group(P>0.05).

The immunohistochemical result of CD57:Hela/pcDNA3.1(+)–h/IL-8 cell group obviously less than Hela/pcDNA3.1(+)–h cell group and Hela cell group(P<0.05).there are no obviously distinction between Hela/pcDNA3.1(+)–h cell group and Hela cell group(P>0.05).

4.Lung tissue of each group have no cancer metastasis.

Conclusion:

1.IL-8 gene was successfully constructed in nude mice transplant model,by comparing each group into a tumorigenicity rate,time and tumor volume confirmed IL-8 can promote tumor growth.

2.Animal study found that IL-8 can promote the generation of capillaries within the tumor tissue,and this provides the necessary conditions for the growth of cervical carcinoma invasion and distant metastasis.

3.Low expression of CD57 may be related to the growth of cervical carcinoma invasion and distant metastasis.

4.Lung tissue of each group have no cancer metastasis.

Key words:cervical cancer;Interleukin-8;angiogenesis;CD34:CD57:tumorigenicity time;tumorigenicity rate;cell proliferation,invasion and metastasis英文缩写

IL-8Interleukin-8白细胞介素8

VEC vascular endothelial cell 血管内皮细胞

VEGFvascular endothelial 血管内皮(细胞)

growth factor生长因子

MVD micorvesseide nsity 微血管密度

BMT bone marrow transplate 骨髓移植

RA theumarthritis 风湿性关节炎

CXCR chemoattractant cytokine趋化因子受体

receptor

PI Proliferation index 增殖指数

TNF tumor necrosis factor 肿瘤坏死因子

TGF tumor growth factor 肿瘤生长因子

前 言

肿瘤的局部浸润和远处转移是恶性肿瘤的一个重要的生物学特征,也是导致肿瘤患者治疗失败甚至死亡的主要原因之一。如何控制肿瘤的侵袭和转移已经成为恶性肿瘤临床治疗与基础研究的难点和热点问题。

宫颈癌的传统治疗方法主要有三种,即手术治疗、放射治疗和化学治疗。而如何按“个体化”治疗的原则设计针对性治疗方案,提高疗效成为临床和研究的重点。因此寻找一个新的、特异的、监测病情发展、判断肿瘤肿瘤转移和患者预后的宫颈癌特异性标志物及有效的肿瘤转移抑制方法意义重大。

白细胞介素8(IL-8)是1987年Yoshimur发现的第一个趋化因子,当时被命名为单核细胞衍生物的中性粒细胞趋化因子,属于ELR+ CXC趋化因子,在炎症中起重要作用。随着研究的深入,多项研究表明IL-8可以通过自分泌和旁分泌方式在肿瘤的浸润和转移中发挥作用,近来实验研究IL-8能促进大鼠角膜中血管形成和诱导兔角膜囊模型产生新的血管,临床研究发现它可促进某些恶性肿瘤的血管新生、生长和转移,探讨IL-8的作用机制可为肿瘤的治疗增加新的途径和作用靶点。为进一步探讨IL-8在宫颈癌侵袭和转移中的作用,本研究通过成功构建Hela/pcDNA3.1(+)–h/IL-8细胞、 Hela/pcDNA3.1(+)–h细胞和Hela细胞三种细胞的裸鼠移植瘤模型,比较各组裸鼠的成瘤天数,成瘤率及成瘤体积,利用S-P免疫组织化学染色的方法,检测移植瘤组织中中微血管密度及CD57的表达情况,并通过比较各组移植瘤中CD34及CD57表达的不同,进一步探讨IL-8对宫颈癌侵袭和转移能力的影响及其机制的研究。

材料与方法

1 材料

1.1实验动物

SPF级BALB/c-nu裸小鼠,雌性,4-6周龄,体重16-18g,购自北京协和动物中心。

1.2肿瘤组织和肺组织

SPF级BALB/c-nu裸小鼠颈椎脱臼处死取得

1.3主要试剂

一抗CD34大鼠抗小鼠多克隆抗体 北京中山生物有限公司

CD57大鼠抗小鼠多克隆抗体 北京中山生物有限公司

二抗CD34羊抗大鼠 北京中山生物有限公司

CD57羊抗小鼠 北京中山生物有限公司

SP9001试剂盒 北京中山生物有限公司

DAB显色剂 北京中山生物有限公司

1.4主要仪器

电热干燥箱DGB-20 上海光华仪器厂

水浴箱201-0 天津泰斯特仪器有限 公司

恒温水浴震荡器CU600 姜堰市医疗器械有 限公司

冰箱BD120 青岛海尔股份有限公司

移液器、染色缸、湿盒等 北京中山有限公司

NikonFXA尼康光镜显微照相机 日本株式会社尼康

LEICA RM2125石蜡切片机 莱卡上海分公司

Motic6.0数码医学图象分析系统 厦门麦克奥迪仪器仪表表有限公司

2方法

2.1细胞和实验动物

2.1.1 Hela/pcDNA3.1(+)–h/IL-8细胞为转染了pcDNA3.1(+)-hIL-8质粒并表达IL-8的Hela细胞,以及Hela/pcDNA3.1(+)–h细胞和Hela细胞由本室构建并保存。

SPF级BALB/c-nu裸小鼠,21只,雌性,4-6周龄,体重16-18g,购自北京协和动物中心。于SPF环境内饲养,环境温度为28℃,每3天添加一次饲料和饮用水,更换一次垫料。实验动物随机分成3组,每组7只,分别命名为IL-8组、空质粒组和阴性对照组。

2.1.2 Hela/pcDNA3.1(+)–h/IL-8细胞、Hela/pcDNA3.1(+)–h细胞和Hela细胞分别培养至对数生长期,常规消化细胞,PBS洗涤细胞3次,取1.5×107个细胞(0.2ml),常规消毒皮肤后,用1ml注射器接种于裸鼠右后背部皮下,当肿瘤长至直径约为5 mm时视为成瘤,并记录成瘤天数及成瘤率。

2.1.3成瘤后用游标卡尺每周测量各组肿瘤的纵径和横径一次,通过公式V=π/6×长×宽²计算肿瘤体积(mm³),估算肿瘤体积(a为长轴纵径,b为短轴横径),并比较各组肿瘤体积有无差异。

2.1.4 实验期间观察裸鼠一般情况和肿瘤生长情况。接种肿瘤细胞9周后颈椎脱臼处死小鼠,完整剥离肿瘤组织及肺组织

2.1.5将小鼠成瘤组织按病理学制样常规行福尔马林固定,石蜡包埋,切片,通过(1)HE染色,观察肺组织的转移情况;(2)免疫组化法观察CD34及CD57在三组中的表达情况。

2.2免疫组织化学法测定肿瘤组织内CD34的表达情况

⑴ 切片常规脱蜡至水

⑵ 0.01M PBS 清洗3次,每次5分钟。

⑶ 0.3%甲醇-过氧化氢室温下孵育20 min

⑷ 蒸馏水清洗清洗3次,每次5分钟

⑸ 0.1M枸橼酸缓冲液(pH 6.0)微波炉内修复,98℃维持20 min

⑹ 冷却至室温

⑺ 10%山羊血清,37℃温箱湿盒内孵育30 min

⑻ 滤纸吸去多余血清,加入CD34大鼠抗小鼠多克隆抗体(稀释1∶100)

⑼ 0.01M PBS清洗3次,每次5分钟

⑽ 滴加CD34羊抗大鼠多克隆抗体,37℃温箱湿盒内孵育30 min

⑾ 0.01M PBS清洗3次,每次5分钟

⑿ 滴加辣根过氧化物酶标记链酶卵白素工作液,37℃温箱湿盒孵育30 min

⒀ 0.01M PBS 清洗3次,每次5分钟

⒁ DAB显色2-5分钟

⒂ 自来水充分冲洗,终止显色

⒃ 梯度酒精脱水:70%,80%,90%酒精5min,95%酒精10 min,100%酒精Ⅰ、Ⅱ各15 min

⒄ 二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各15 min透明

⒅ 中性树胶封固

2.3免疫组织化学法测定肿瘤组织内CD57的表达情况

⑴ 切片常规脱蜡至水

⑵ 0.01M PBS 清洗3次,每次5分钟

⑶ 0.3%甲醇-过氧化氢室温下孵育20 min

⑷ 蒸馏水清洗清洗3次,每次5分钟

⑸ 0.1M枸橼酸缓冲液(pH 6.0)微波炉内修复,98℃维持20 min

⑹ 冷却至室温

⑺ 10%山羊血清,37℃温箱湿盒内孵育30 min

⑻ 滤纸吸去多余血清,加入CD34大鼠抗小鼠多克隆抗体(稀释1∶100)

⑼ 0.01M PBS清洗3次,每次5分钟

⑽ 滴加CD57羊抗小鼠多克隆抗体,37℃温箱湿盒内孵育30 min

⑾ 0.01M PBS清洗3次,每次5分钟

⑿ 滴加辣根过氧化物酶标记链酶卵白素工作液,37℃温箱湿盒孵育30 min

⒀ 0.01M PBS 清洗3次,每次5分钟

⒁ DAB显色2-5分钟

⒂ 自来水充分冲洗,终止显色

⒃ 梯度酒精脱水:70%,80%,90%酒精5min,95%酒精10 min,100%酒精Ⅰ、Ⅱ各15 min

⒄ 二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各15 min透明

⒅ 中性树胶封固

2.4肺组织切片HE染色步骤:

⑴ 切片常规脱腊至水:

二甲苯Ⅰ,二甲苯Ⅱ,100%酒精Ⅰ,100%酒精Ⅱ,各10分钟。95%酒精,90%酒精,80%酒精,70%酒精各10分钟,蒸馏水洗

⑵ 苏木精 染色1分钟,自来水冲洗。

⑶ 1%盐酸分化,自来水冲洗。

⑷ 伊红染色2分钟。

⑸ 常规梯度酒精脱水70%酒精,80%酒精,90%酒精,95%酒精,各2分钟,100%酒精1,100%酒精11,各10分钟 二甲苯透明,中性树胶封片。

2.5光镜下观察各组裸鼠肺组织的宫颈癌转移情况。

3图像分析及统计学处理统计方法

所有切片标本均在Motic Med 6.0数码医学图像分析系统内,移植瘤组织内有棕黄色粗颗粒分布或棕黄色细腻颗粒弥漫分布者为阳性反应,染色强度明显高于背景者为阳性表达。在相同的放大倍数(400×)下,以阳性细胞染色的平均光密度值(OD)值来表示CD34的表达量。免疫组化染色切片在400倍镜下任意取5个不同视野,计数每个视野内100目网格内CD57阳性细胞数,然后计算单位面积(mm²)内阳性细胞数来表示CD57的表达量。

所有资料录入微机,建立数据库,用SPSS13.0统计软件分析。所有计量数据均采用±s表示,多组间均数比较首先采用单因素方差分析,若方差分析有显著性则进一步行均数间的两两比较。P<0.05即认为有统计学意义。NikonFXA尼康光镜显微照相机拍照。

结 果

1成功构建Hela/pcDNA3.1(+)–h/IL-8细胞、Hela/pcDNA3.1(+)–h细胞和Hela细胞三种细胞的裸鼠移植瘤模型(Fig10-11)。IL-8组成瘤时间为16.00±1.53天,空质粒组成瘤时间为19.90±1.28天,阴性对照组成瘤时间为19.70±1.25天,各组成瘤率均为100%。两两比较结果显示,IL-8组与空质粒组,IL-8组与阴性对照组均有明显差异(P<0.05),空质粒组与阴性对照组之间无明显差异(P>0.05)(Table 1)。

2 实验期间,各实验组小鼠一般情况良好,饮食,活动如常。接种肿瘤细胞后7、8、9周,IL-8组肿瘤生长明显活跃于空质粒组和阴性对照组。7、8、9周肿瘤体积分别为:IL-8组:1394.795±108.559mm3、1773.860±133.087mm3、2207.659±209.713mm3;空质粒组:1106.625±146.984mm3、1402.206±127.053mm3、1657.190±173.368mm3;阴性对照组:1110.330±186.458 mm3、1355.918±210.983 mm3、1582.372±169.642 mm3。IL-8组肿瘤体积大于空质粒组和阴性对照组,且两两比较有统计学意义(P<0.05)。实验前6周各组肿瘤体积比较无明显差别(P>0.05)(Table 2)。

3各实验组肺组织均未见癌组织转移(Fig1-3)。

4免疫组化结果

MVD免疫组化结果:细胞胞浆内有棕黄色粗颗粒分布或棕黄色细腻颗粒弥漫分布者为阳性反应。综合分析整张切片的阳性细胞数及染色强度,分为四级:阳性细胞数<25%,染色浅,胞浆未见明显棕黄颗粒者为(-),阳性细胞数≥25%而<50%者,染色较浅,可见稀疏棕黄颗粒者为(+),阳性细胞数≥50%而<75%者,染色深,并见明显棕黄颗粒者为(++),阳性细胞数≥75%者为(+++),IL-8组肿瘤组织中阳性表达明显增加,空质粒和阴性对照组的肿瘤组织内可见少量阳性反应。所有标本均在Motic Med 6.0数码医学图像分析系统内在相同的放大倍数(400×)下,以阳性细胞染色的平均光密度值(OD)值来表示CD34的表达量,IL-8组阳性目标平均光密度值为0.1942±0.0175,明显高于空质粒组和阴性对照组肿瘤组织的光密度值0.1302±0.1042、0.1330±0.0134。通过染色强度及阳性细胞的OD值两两比较结果显示,IL-8组与空质粒组,IL-8组与阴性对照组均有明显差异(P<0.05),空质粒组与阴性对照组之间无明显差异(P>0.05)(Fig4-6)(Table3)。

CD57免疫组化结果:CD57定位于淋巴细胞中的自然杀伤细胞膜和细胞浆,组织内有棕黄色粗颗粒分布或棕黄色细腻颗粒弥漫分布者为阳性反应。阳性判定结果采用4级,半定量法,阴性(-):无阳性细胞;弱阳性(+):少于10%的淋巴细胞胞浆及胞膜见棕黄色颗粒;中阳性(++):10% -50%的淋巴细胞胞浆及胞膜见棕黄色颗粒;强阳性(+++):多于50%的淋巴细胞胞浆及胞膜见棕黄色颗粒。空质粒和阴性对照组的肿瘤组织内可见大量阳性反应,染色强度明显,IL-8组肿瘤组织中阳性表达明显少于空质粒和阴性对照组。每例CD57免疫组化染色切片在400倍镜下任意取5个不同视野,计数每个视野内100目网格内CD57阳性细胞数,然后计算单位面积(mm2)内阳性细胞数。IL-8组为:4.22±3.85,空质粒组为:6.01±3.73,阴性对照组:6.03±1.98,通过分析和两两比较结果显示,IL-8组与空质粒组,IL-8组与阴性对照组均有明显差异(P<0.05),空质粒组与阴性对照组之间无明显差异(P>0.05)(Fig4-6)(Table3)。

附 图

附 表

讨论

肿瘤是机体在各种致瘤因素作用下,局部组织的细胞在基因水平上失去对其生长的调控,导致克隆性异常增生而形成的新生物。即使在去除致瘤因素的刺激,肿瘤的增生状态仍能一直持续下去,它是由一个转化细胞不断增生繁衍形成的,在此过程中,恶性转化细胞的内在特点(如肿瘤生长分数)和宿主对肿瘤细胞及其产物的反应(如肿瘤血管形成)共同影响着肿瘤的生长和演进,肿瘤的生长速度决定于生长分数和肿瘤细胞的生成与丢失之比。

恶性肿瘤细胞的生物学特性,包括形态结构、生理功能、生化组成、细胞代谢、基因调节等都与正常细胞不同[23,24] 因此,对其生物学特性的研究具有重要意义,一般认为恶性肿瘤具有以下特征[25] ①癌细胞生长自主性(autonomy),即控制正常细胞增殖的调节因素对癌细胞不起作用;②可移植性(nartPslnatbaliiyt),即将原发瘤、继发瘤或培养的肿瘤细胞移植于同种或同基因动物或免疫缺陷动物体内,能再次生长并发展为和原来相同的肿瘤组织;③侵袭性和转移性(invasivenessnadmetastasis),瘤细胞可侵犯邻近组织(即发生侵袭)以及向远处器官或全身扩散(即发生转移),使宿主死亡;④去分化或异常分化(ddeiefferniiatoin),即瘤细胞缺乏成熟的形态与完整的功能,对正常的细胞分化调节机制缺乏反应;⑤细胞接触抑制(ocniactihnihitino)的丧失,正常细胞在培养基中生长时,彼此接触后即停止生长,只能形成单层细胞,而肿瘤细胞不受此限制,相互接触生长不被抑制,可在培养基内继续生长并形成多层;⑥体外培养的密度依赖性(densiyt一dependent)抑制丧失;⑦贴壁依赖性生长(naehoarge一dependent)丧失,即细胞无需附于表面基质也可以生长繁殖。

在这些生物学特征中以侵袭性和转移性最为关键,它们是恶性肿瘤的重要特性也是目前研究的热点,临床经验告诉我们,肿瘤细胞的侵袭和转移时造成患者死亡的主要原因,对于一些没有侵袭和转移的良性肿瘤病人,预后一般较好,因此侵袭性和转移性也是影响肿瘤患者生存和预后的关键因素。

侵袭和转移是一个过程中的两个阶段,侵袭是转移的前奏,是转移性肿瘤必备的基本特性之一:转移是侵袭的后果,当恶性肿瘤离开原瘤灶后,首先向周围组织侵袭,进而进入血管或淋巴管,这是转移过程中的重要一步,若它能在血循环或淋巴循环中存活,尚需再侵袭和穿过血管壁的基底膜,方可进入实质器官形成转移灶。因此,侵袭在转移过程中起关键作用。多数实验证明,大多数分离出的高侵袭性克隆细胞株转移能力也较强[26,27,28]。侵袭和转移是人类恶性肿瘤致死的主要原因之一,也是其最基本的生物学特征之一。肿瘤的转移是一个连续的多步骤过程,涉及细胞黏附、侵袭、肿瘤血管生成及转移灶生成过程[29]。一般认为主要经过以下部分:

肿瘤发生,生长

邻近组织浸润和直接扩散到接触的体腔内

穿入血管,淋巴管(接近或在原发瘤内)

肿瘤细胞在淋巴管或血循环中扩散

淋巴道扩散首先到达局部淋巴结,然后到达较远的淋巴结

血道扩散运行中的瘤细胞停留,穿过血管壁到达组织间隙

组织间隙的瘤细胞开始存活,血管开始形成

进行性生长

转移灶形成

局部浸润和远处转移是恶性肿瘤最重要的特点,也是肿瘤患者治疗失败甚至死亡的主要原因。肿瘤的侵袭与转移是肿瘤细胞与宿主细胞及细胞间质之间一系列复杂、多因素、多环节相互作用的结果。诱导血管的生成能力是恶性肿瘤的生长、浸润与转移的前提之一。肿瘤细胞本身和浸润到肿瘤组织内及其周围的炎细胞(主要是巨噬细胞)能产生一类血管生成因子,如血管内皮细胞生长因子(VEGF)和碱性成纤维细胞生长因子(b-FGF)。这些血管生成因子促进血管内皮细胞分裂和毛细血管出芽生长。新生的毛细血管既为肿瘤生长提供营养,又为肿瘤转移提供了有利条件。肿瘤血管生成是肿瘤浸润转移的关键步骤,是指在肿瘤内形成新的血管,这一过程包括原有微血管基底膜的蛋白水解,内皮细胞的增生、迁移,管状结构的形成与成熟,是由肿瘤细胞及肿瘤周围基质细胞表达血管生成因子与血管生成抑制因子失平衡及蛋白酶的释放所引起的。多项研究表明IL-8与肿瘤的血管新生和肿瘤侵袭相关。肿瘤及其周围环境中的单核细胞、淋巴细胞、中性粒细胞等都可以自分泌IL-8,它们之间既可相互作用,也可作用于周围的血管内皮细胞,构成一个复杂的网络系统。Murphy等[30] 发现IL-8参与肿瘤血管形成,与肿瘤的侵润、转移密切相关。随后研究者在小细胞肺癌[31] 和胃癌[32]等也得出了类似的结果。正义IL-8 cDNA 导入低转移性前列腺癌PC-3P细胞后可上调基质金属蛋白酶(MMP)-9 mRNA的水平和胶原活性,提高肿瘤体外侵袭力,其裸鼠移植瘤生长速度快,淋巴结转移率高,反义IL-8 cDNA转染高转移性前列腺癌细胞则可抑制肿瘤的生长和转移[33]因转染研究表明IL-8的表达会促进膀胱癌和前列腺癌转移[34,35]妇科肿瘤方面,Herrera等[36]应用比色原位mRNA杂交技术,证明IL-8 mRNA的表达水平与卵巢癌分期相关。Anna等[37] 通过免疫荧光检测患者血清中的IL-8和抗IL-8抗体,发现其在卵巢癌早期即可增高。Dong Seok Kim等[38]。研究显示蛇毒解聚素可以通过抑制IL-8的表达而抑制TNF-α诱导的卵巢癌细胞的增殖。谭维琴等[39]通过比较正常人群,乳腺癌无骨转移患者和有骨转移患者血清中IL-8水平的差异,认为IL-8参与乳腺癌骨转移的发生和发展过程,检测IL-8等细胞因子水平对于乳腺癌骨转移的病理研究和预防、治疗可能具有重要价值。IL-8在肿瘤血管生成中的主要作用机制包括:① 促进内皮细胞的增生:重组人IL-8作用于人类脐静脉内皮细胞、人皮肤微血管内皮细胞和人小肠微血管内皮细胞后可诱导内皮细胞增生和毛细血管形成[11,20];② 抑制内皮细胞的凋亡:Li等通过RT-PCR和Western Blot分析表明IL-8还可提高抗凋亡基因Bcl-xL、Bcl-2 的表达,抑制促凋亡基因Bax的表达,因此认为IL-8还可通过调节凋亡相关基因抑制内皮细胞的自发性凋亡;③ 诱导血管内皮迁移:刘肖珩[22]等通过比较不同浓度IL-8对血管内皮细胞迁移的影响,得出各种浓度的IL-8均可促进血管内皮细胞迁移的结论。④ 促进胶原酶的活性:近来多项研究表明IL-8可调解肿瘤细胞及其周围基质细胞分泌MMP-2和MMP-9并增强其活性,而后两者可促进血管周围胶原酶活性和周围基质的降解,促进内皮细胞沿着降解的细胞外基质向血管生成因子的方向移动,从而促进肿瘤血管的生成,增强肿瘤细胞的侵袭力;感染或炎症过程中产生的细胞因子如白细胞介素-6,8(IL-6,8)、肿瘤坏死因子(TNF-α)等分泌增加可诱导或激活MMPs活性,从而降解细胞外基质;⑤ 增加血管通透性:Heidemann等[42]研究表明IL-8可促进内皮细胞的收缩使血管的通透性增加,促进肿瘤的浸润与转移;⑥ IL-8还可通过趋化激活中性粒细胞使其分化为肿瘤相关巨噬细胞,后者又可分泌血管内皮生长因子(VEGF)、bFGF、血小板源性的内皮生长因子、TNF-α和IL-8等多种促血管生成因子,在肿瘤的浸润和转移中发挥重要作用[43,44]与体内激素水平尤其是雌激素有关:有许多研究报道高浓度的IL-8表达与乳腺癌肿瘤的扩散和浸润高度相关,可能与IL-8因子的生成与体内雌激素的水平有关[45,46],有研究显示淋巴管内皮细胞可通过分泌趋化因子吸引肿瘤细胞,进而主动促进肿瘤细胞的淋巴结转移[47,48]。IL-8作为一种重要的趋化因子可能在肿瘤的淋巴转移中也发挥重要的作用。在促进肿瘤细胞生长方面,Yue Wang等[49]现通过调节细胞因子(如IL-6和IL-8)分泌,两者通过其相应的受体介导,从而促进OVCAR-3等卵巢癌细胞的生长。Evagelia等人[50]现IL-8对辐射诱发的基因组不稳定的细胞具有促进有丝分裂和生存的作用。

本实验成功构建了Hela/pcDNA3.1(+)–h/IL-8细胞、Hela/pcDNA3.1(+)–h细胞和Hela细胞三种细胞的裸鼠移植瘤模型,实验期间,各实验组小鼠一般情况良好,成瘤率均为100%。两两比较成瘤时间结果显示,IL-8组与空质粒组,IL-8组与阴性对照组均有明显差异(P<0.05),空质粒组与阴性对照组之间无明显差异(P>0.05);接种肿瘤细胞后的前6周,各组肿瘤体积大小无明显差异(P>0.05),接种肿瘤细胞后7、8、9周,IL-8组肿瘤生长明显活跃并且体积大于空质粒组和阴性对照组,两两比较有统计学意义(P<0.05)。证实IL-8能够促进肿瘤生长、增殖。

子宫颈癌主要为鳞癌,其转移方式大多为向邻近组织直接侵袭蔓延和经淋巴道转移,其转移机制十分复杂,受到多种相关基因及细胞因子的调控。近年来在肿瘤领域研究的重大进展之一就是确立了肿瘤血管生成在肿瘤发展中的重要地位与抗血管生成治疗肿瘤的意义,肿瘤生成依赖血管形成,肿瘤的生长、局部浸润及转移必须以适宜的血液供应为前提。因此,肿瘤组织内的微血管形态、分布、数量及血液循环等对于肿瘤的形成机制、治疗和预后判定有着十分重要的意义。对宫颈癌内微血管密度(MVD)的研究,日益受到人们的重视,但文献报道的免疫组化染色技术检测宫颈癌中MVD的结果不一致,给准确判定宫颈癌中的MVD带来许多不便。现多采用免疫组织化学技术对肿瘤微血管进行定量计算,即微血管密度计数,目前反映微血管密度的标记物有CD34,CD31,CD105和vs因子等,其中CD34是较敏感和较特异的肿瘤新生血管内皮细胞表面标志,CD34又称为人定向造血干细胞抗原,在造血干细胞、血管内皮细胞等都有表达。在肿瘤组织中,其表达与肿瘤血管内皮细胞的增殖、移行有关,并被认为是判断肿瘤患者预后的一个独立因素。

本 实验通过S-P免疫组化法,比较各组移植瘤组织中CD34的表达,细胞胞浆内有棕黄色粗颗粒分布或棕黄色细腻颗粒弥漫分布者为阳性反应。综合分析整张切片的阳性细胞数及染色强度,分为四级:阳性细胞数<25%,染色浅,胞浆未见明显棕黄颗粒者为(-),阳性细胞数≥25%而<50%者,染色较浅,可见稀疏棕黄颗粒者为(+),阳性细胞数≥50%而<75%者,染色深,并见明显棕黄颗粒者为(++),阳性细胞数≥75%者为(+++)。所有标本均在Motic Med 6.0数码医学图像分析系统内在相同的放大倍数(400×)下,以阳性细胞染色的平均光密度值(OD)值来表示CD34的表达量,IL-8组阳性目标平均光密度值为0.1942±0.0175,明显高于空质粒组和阴性对照组肿瘤组织的光密度值0.1302±0.1042、0.1330±0.0134。两两比较结果显示,IL-8组与空质粒组,IL-8组与阴性对照组均有明显差异(P<0.05),空质粒组与阴性对照组之间无明显差异(P>0.05),通过组织切片染色强度分析及呈阳性反应肿瘤细胞OD值比较,证明IL-8组肿瘤组织中CD34阳性表达明显增加,能够促进肿瘤微血管的形成,进而促进肿瘤的生长、侵袭和转移。

NK细胞是机体免疫中一类对多种靶细胞有自发细胞毒活性的效应细胞,在抗肿瘤中主要发挥非特异性免疫作用,NK细胞在启动杀瘤作用时不需要复杂的抗原呈递作用,也不受主要组织相容复合体(MHC)的限制,能直接释放特异性杀伤蛋白-穿孔素(pertorin)、细胞毒因子(NKCF),对靶细胞起溶解杀伤作用,故认为是机体抗肿瘤,抗感染的第一道防线。NK细胞数量及活性的变化影响肿瘤细胞的分化、增殖、转移等各个方面,另一方面,肿瘤也能通过诱导产生细胞体液抑制因子及肿瘤细胞产物的免疫抑制作用影响NK细胞的功能状态,削弱其抗肿瘤的作用。CD 57是人自然杀伤细胞的特异性表面标记,也存在于T淋巴细胞上和一些肿瘤细胞表面[47],人已发现T淋巴细胞CD57的表达与多种疾病有关,如肾移植、心移植、骨髓移植、风湿性关节炎、病毒感染及HIV感染等疾病中CD57表达增多[48]。近有文献报道老年人CD57表达明显多于青年人[49]。外周血中30%-80%的NK细胞可表达次抗原,故其阳性细胞数量水平在一定程度上能反映NK细胞的功能。

本实验通过本实验通过S-P免疫组化法,比较各组移植瘤组织中CD57的表达,CD57定位于淋巴细胞中的自然杀伤细胞膜和细胞浆,组织内有棕黄色粗颗粒分布或棕黄色细腻颗粒弥漫分布者为阳性反应。阳性判定结果采用4级,半定量法;阴性(-):无阳性细胞;弱阳性(+):少于10%的淋巴细胞胞浆及胞膜见棕黄色颗粒;中阳性(++):10% -50%的淋巴细胞胞浆及胞膜见棕黄色颗粒;强阳性(+++):多于50%的淋巴细胞胞浆及胞膜见棕黄色颗粒。每例CD57免疫组化染色切片在400倍镜下任意取5个不同视野,计数每个视野内100目网格内CD57阳性细胞数,然后计算单位面积(mm2)内阳性细胞数,IL-8组为:4.22±3.85,空质粒组为:6.01±3.73,阴性对照组:6.03±1.98。空质粒和阴性对照组的肿瘤组织内可见大量阳性反应细胞,染色强度明显;IL-8组肿瘤组织中阳性表达细胞数明显少于空质粒和阴性对照组;经过两两分析和比较结果显示,IL-8组与空质粒组及阴性对照组CD57的表达均有明显差异(P<0.05),空质粒组与阴性对照组之间无明显差异(P>0.05)。也就是说IL-8组中NK细胞减少,降低了机体的免疫功能,进而削弱了其抗肿瘤的能力,促进肿瘤的生长、侵袭和转移。

综上所述,本动物实验研究证实:IL-8可以促进肿瘤细胞的增殖,并通过促进肿瘤组织内毛细血管的生成,削弱NK细胞的杀伤作用,为宫颈癌组织生长侵袭和远处转移提供了必要条件。IL-8是趋化性细胞因子,隶属C-X-C亚族,既往研究表明,IL-8主要由单核-吞噬细胞产生,对淋巴细胞,特别是中性粒细胞有很强的趋化作用并能够诱导其活化。关于其与肿瘤关系的认识,早期研究发现肿瘤组织中可有IL-8高表达及大量中性粒细胞浸润的现象,并认为其或许招募中性粒细胞发挥抗肿瘤作用,然而近年来,越来越多的证据显示[50],IL-8或许更多的参与了肿瘤的发生发展,我们及他人的一些研究工作已证实了这一点,但促瘤机制如何尚不十分清楚,能否成为肿瘤综合生物治疗的靶分子等问题或许将成为我们下一步研究工作的重要问题。

结 论

1成功构建IL-8基因裸鼠移植瘤模型,通过比较各组的成瘤率、成瘤时间及肿瘤体积证实IL-8能够促进肿瘤生长。

2 动物实验研究发现IL-8促进肿瘤组织内毛细血管的生成,为宫颈癌组织生长侵袭和远处转移提供必要条件,但其确切的机制还有待遇进一步的深入研究。

3 CD57低表达可能与宫颈癌组织生长侵袭和远处转移有关。

4各组肺组织中无癌细胞的转移。

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作者简介:

一、一般情况

姓名 刘海凤 性别 女 民族 汉族

出生年月 1983 年01 月26日 籍贯 山东广饶

二、个人经历

2002 年~2005 年 山东菏泽医学高等专科学校临床医学系

2005 年~2007 年 山东济宁医学院临床医学系

2007 年~至今 河北医科大学攻读硕士学位

三、承担或主研课题情况

参与研究河北省卫生厅课题:妇科恶性肿瘤组织 IL-8与ERα、β 表达的相互关系,编号 05013,受河北省强势特色学科资助

论文作者:刘海凤

论文发表刊物:《健康世界》2015年18期

论文发表时间:2016/3/7

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人IL-8基因对宫颈癌侵袭和血管生成能力影响的实验研究论文_刘海凤
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