陈等[1]2003年在《阿尔茨海默病的基因关联性分析及小鼠衰老相关基因的克隆》文中研究说明阿尔茨海默病(Alzheimer disease，AD)是一种涉及中枢神经系统的渐进性退行性疾病，严重威胁老年人身心健康。目前，AD的病因尚未完全阐明，一般认为是遗传因素和环境因素相互作用的结果，并以遗传因素的作用为主。 本研究利用聚合酶链反应—限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法分析了中国汉族人群中散发性AD(sporadic AD，SAD)患者(160例)和健康老年人(195例)中载脂蛋白E(Apolipoprotein E，APOE)、α2—巨球蛋白(α2-Macroglobulin，A2M)和血管紧张素转化酶(Angiotensin corverting enzyme，ACE)基因多态性分布的差异，研究了这些基因多态性与散发性AD发病间的关系。 载脂蛋白E(APOE)在血浆脂蛋白代谢过程中起重要作用。APOE基因的ε4等位基因是目前得到广泛认同的散发性AD的遗传危险因素，而ε2等位基因在AD中的作用尚无定论。本研究的结果表明，APOE基因的叁种等位基因ε2、ε3和ε4的频率在AD组和对照组分别为0.056、0.713、0.231和0.082、0.844、0.074。APOE-ε4等位基因频率在AD组明显高于正常对照组(OR 3.75，95％CI 2.37～5.93，x~2=34.89，P＜0.001)。在65岁以下人群中，APOE-ε4携带个体患AD的风险为非携带者的1.80倍(OR 1.80，95％CI 0.75～4.32，x~2=1.75，P=0.186)，而在65岁以上人群中，APOE-ε4携带个体发生AD的危险性为非携带者的5.38倍(OR 5.38，95％CI 2.84～10.21，x~2=29.76，P＜0.001)，说明年龄因素可能影响APOE-ε4与AD间的作用，年龄越大，APOE-ε4对AD的作用越明显。不含、含1个和2个APOE-ε4等位基因个体的AD患病率分别为36.6％、65.1％和100％，说明APOE-ε4等位基因的剂量与AD患病率之间存在着明显的剂量—效应关系(x~2=33.10，df=2，P＜0.001)。在上述分析的基础上，应用Logistic回归分析进一步显示，APOE-ε4变量的偏回归系数为1.30，进一步确定APOE-ε4是中国汉族人群AD发病的危险因素。APOE等位基因和基因型频率在轻、中和重度痴呆病人间的分布基本一致(x~2=0.63，P=0.730)，提示APOE基因多态性与AD患者的痴呆程度无关联。APOEε4基因型频率在女性AD病人中的分布略高于男性AD病人(43.0％对36.5％)，女性ε4携带个体患AD的危险也高于男性ε4携带个体(4.3倍对3.3倍)，但统计学分析未检测到这些差异的
毕秀华[2]2008年在《阿尔茨海默病基因关联性分析及APOE缺陷小鼠脑组织中异常表达miRNA的鉴定和初步功能研究》文中研究说明大量流行病学研究显示叶酸缺乏和同型半胱氨酸升高与阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)相关。体内叶酸和同型半胱氨酸水平可能受饮食因素影响,也可能受参与两者代谢途径的基因的多态性影响。我们采用干酪乳酸菌法和高压液相色谱方法测定了106例AD病人和120例正常人的血浆叶酸、同型半胱氨酸和半胱氨酸水平,并用限制性内切酶片段长度多态性方法(Restriction Fragment Length Polymorphism,RFLP)检测了368例AD病人和375例正常人中叶酸和同型半胱氨酸代谢途径相关的5个基因中的5个多态性位点,分别是5,10—亚甲基四氢叶酸还原酶677 C/T(5,10-methylenetetrahydrofolate reductase,MTHFR)、叶酸还原载体1 80 A/G(reduced folate carrier 1,RFC1)、胱硫醚β合成酶(cystathionine beta-synthase,CβS)844ins68、5,10—亚甲基四氢叶酸脱氢酶1958A/G(5,10-methylenetetrahydrofolate dehydrogenase,MTHFD1)以及磷脂酰乙醇胺甲基转移酶523 G/A(phosphatidylethanolamine N-methyltransferase,PEMT)。此外,也检测了载脂蛋白E(apolipoproteine E,APOE)的基因多态性。结果显示AD病人中同型半胱氨酸含量显着高于正常人群(p＜0.05),叶酸含量显着低于正常人(p＜0.001),同时还发现AD病人中半胱氨酸含量也显着低于正常人群(p＜0.001)。在基因多态性与AD关联研究方面,我们发现RFC1 80A/G多态性的GG基因型和G等位基因频率在AD病人中显着高于正常人(G等位基因:p=0.008,OR=1.312,95%CI:1.072-1.605;GG基因型:p=0.042,OR=1.383,95%CI:1.012-1.890)。按照APOEε4,年龄和性别分层后,发现在不携带APOEε4的人群,女性和≥65岁的人群中,G等位基因在AD病人中的分布显着高于正常人。这表明RFC1 80G等位基因可能是一个不依赖APOEε4的晚发性AD风险因子,在女性中的作用更为明显。在未分层样本中,MTHFR 677C/T多态性的基因型和等位基因分布在AD组和正常对照组间不存在显着性差异。根据年龄和性别分层后,也未发现显着性差异。但根据是否携带APOEε4等位基因分层后,发现在携带APOEε4等位基因的个体,AD病人中TT基因型和T等位基因的频率显着高于正常对照组(T vs.C:p=0.031,OR=1.586,95%CI:1.042-2.414;TT vs.CC plus CT:p=0.028,OR=2.250,95%CI:1.074-4.712)。我们没有发现CβS 844ins68,MTHFD1 1958G/A和PEMT 523G/A多态性与AD存在关联性。分析基因多态性对血浆叶酸和同型半胱氨酸含量的影响时发现,所有样本中携带RFC1 80GG基因型的人群中血浆叶酸水平低于AA和GA基因型人群血浆叶酸水平的平均值,而同型半胱氨酸水平高于AA和GA基因型人群,但是这种差异未达到显着性。在AD组和正常组也存在这样的趋势,尤其是正常人中的同型半胱氨酸含量,在GG基因型的人群中高于AA+GA的人群(10.25μmol/L vs.7.96μmol/L),差异接近但未达到统计学显着性(p=0.086)。没有发现MTHFR 677多态性,CβS 844ins68和MTHFD1 1958A/G对血浆叶酸和同型半胱氨酸含量有影响。上述结果表明叶酸代谢途径中的RFC1 80G等位基因和GG基因型能够增加患AD的风险,但可能不是通过影响血浆叶酸和同型半胱氨酸含量而实现的,确切机理还需进一步研究。此外,MTHFR 677T等位基因可能与APOEε4协同作用增加患AD的风险。小RNA(miRNA)是一类长度约为21-23个核苷酸的重要调节分子,它可以通过剪切靶基因mRNA或抑制靶基因翻译的方式在转录后水平抑制蛋白编码基因的表达。近年来鉴别了大量的miRNAs,已证明它们通过在转录后水平调控基因表达参与许多重要的生理过程,并涉及多种疾病的发生和发展。哺乳动物神经系统表达丰富的miRNAs,已确定它们在神经系统发育中起重要调节作用,它们在成熟的神经细胞,脑老化及神经退行性疾病中也可能行使重要功能。阿尔茨海默氏病(Alzheimer'sdisease,AD)是老年痴呆中最普遍的一种,其典型的病理改变是β淀粉样肽在大脑皮层和海马神经细胞外沉积以及过度磷酸化的微管相关Tau蛋白在神经细胞内缠结。APOE基因多态性是目前唯一确定的散发性AD的危险因素,该基因缺陷的小鼠能够显示部分AD病理特征,可用作研究载脂蛋白E在阿尔茨海默氏病病理过程中的作用的动物模型。我们采用Multiplex qRT-PCR方法鉴定了41个神经系统丰富或特异表达和我们感兴趣的miRNAs在7月龄APOE基因缺陷小鼠(apoE~(-/-))和正常小鼠大脑皮层和海马中的表达。发现mmu-miR-7f2和miR-29a在apoE~(-/-)小鼠大脑额叶皮层的表达显着低于正常小鼠;其中,mmu-miR-143在apoE~(-/-)小鼠额叶皮层和海马中的表达显着均低于正常小鼠,用单一qRT-PCR方法进一步验证也确证了mmu-miR-143的表达变化。随后我们检测了miR-143在2月龄和13月龄小鼠额叶皮层和海马的表达。发现正常小鼠中,随着年龄增加,miR-143的表达逐渐升高;在apoE~(-/-)小鼠中大脑额叶皮层中miR-143在2月龄时略高于正常小鼠,之后也随年龄增加,但增加趋势远不如正常小鼠明显,7月龄和13月龄时显着低于正常小鼠;apoE~(-/-)小鼠海马中,2月龄时miR-143的表达与正常小鼠无差异,到了7月龄时,表达较2月龄有所升高,但13月龄时表达较2月龄显着降低,同时也低于同时期的正常小鼠。miR-143表达的变化以及在正常小鼠和apoE~(-/-)小鼠中的差异提示它可能在载脂蛋白E相关的AD病理过程中起调节作用。为进一步了解miR-143的作用机制,我们对其可能的靶基因做了分析预测,用荧光素酶报告基因的方法检测了通过软件筛选到的4个基因:cAMP反应元件结合蛋白Zhangfei因子(cAMP response element binding protein Zhangfei factor,CREBZF),cAMP反应元件结合蛋白5(cAMP response element binding protein 5,CREB5),TAOK1(TAO kinase 1),DYRK1B(dual-specificity tyrosine-(Y)-phosphorylation regulatedkinase 1b,DYRK1B)以及已知的细胞外激活激酶5(extracellular activated kinase 5,ERK5)基因3'-UTR区可能的miR-143作用位点。发现miR-143可以使携带ERK5,CREBZF和TAOK1基因3'—UTR区的萤光素酶报告基因表达量分别下降约30%,28%和25%,提示除了ERK5外,CREBZF和TAOK1基因也有可能是miR-143的靶基因。ERK5和TAOK1基因是MAPKK—MAPK—ERK信号通路中的成员,已有研究表明该信号通路中的ERK1/2,p38在AD病人中表达升高且被激活;CREBZF是ATF4的共同作用因子,在神经系统中与长时程记忆形成受限有关。提示miR-143可能通过影响MAPK-ERK信号通路并限制长时程记忆形成参与apoE~(-/-)小鼠的病理过程。
黄畅[3]2017年在《基于mTOR信号通路探讨艾灸及艾烟对APP/PS1双转基因小鼠认知障碍的影响及机制研究》文中研究表明目的:观察艾灸及艾烟对AD小鼠学习记忆能力、特征性病理产物及氧化应激的影响,并基于mTOR信号通路探讨艾灸及艾烟抗AD的作用机制。方法:36只APP/PS1双转基因小鼠随机分为3组:常规艾灸组,艾烟组,模型组。将12只C57BL/6小鼠作为空白组。空白组及模型组小鼠每日放入固定器中,于室内空气中暴露;艾灸组小鼠每日放入固定器后,在关元穴处施灸;艾烟组小鼠每日放入固定器后,暴露于10-15mg/m3的艾烟环境,所有干预均为15min/天,6天/周,连续干预8周。于实验第9周开始进行开场实验、新物体识别实验、避暗实验及Morris水迷宫实验;行为学实验结束后,牺牲小鼠取材,采用免疫组化法测Aβ 1-42的表达;硫磺素S法测老年斑的总面积及斑块负荷;酶标法测定GSH含量,羟胺法测定SOD活力,硫代巴比妥酸法测 MDA 含量;Western blot 法测 p-tau(Ser202/Thr231)/tau、p-mTOR/mTOR、PI3K、p-AMPKα/AMPKα、PGC1α、p-4E-BP1/4E-BP1、p-p70S6K/p70S6 K、p-ULK、LC3-Ⅱ的蛋白表达水平;RT-PCR法检测mTOR、Akt、AMPKα1的mRNA表达。结果:1.行为学结果开场实验中,与模型组相比,艾灸组小鼠直立次数增加(p=0.048),艾烟组小鼠水平活动的距离(p=0.047)、穿越中央区的次数(p=0.014)均增加;新物体探索实验中,与模型组相比,艾灸组小鼠对新物体探索时间显着加长(p=0.012),艾烟组小鼠对新物体探索次数显着增多(p=0.019);在避暗实验中,与模型组相比,艾灸组小鼠(p=0.039)及艾烟组(p=0.000)小鼠的训练期犯错次数均显着降低;水迷宫定向航行实验中,随着训练天数的增多,各组小鼠潜伏期逐渐缩短。与模型组相比,测试第4d,艾灸组潜伏期明显低于模型组(p=0.006)。2.Aβ沉淀及tau蛋白磷酸化通过免疫组化检测发现,模型组Aβ 1-42的表达明显增多,海马CA1区及CA3区可见较多棕色沉淀斑块,艾灸组及艾烟组海马CA1区及CA3区偶见斑块且斑块面积较小;硫磺素S染色法测老年斑,与模型组相比,艾灸组斑块计数显着减少(p=0.025),艾灸组(p=0.008)及艾烟组(p=0.039)斑块负荷显着减少;Western blot法测tau蛋白磷酸化,与模型组相比,艾灸组海马p-tau(Thr231)显着降低(p=0.04)。3.脑组织氧化应激状态模型组小鼠脑组织SOD活力较空白组显着降低(p=0.000),MDA含量较空白组显着升高(p=0.000);与模型组相比,艾灸组小鼠脑组织GSH含量显着增高(p=0.002),SOD活力显着提高(p=0.02),MDA含量显着降低(p=0.009);艾烟组MDA含量显着降低(p=0.037)。4.mTOR上游信号通路模型组小鼠海马mTOR、p-mTOR、p-Akt/Akt较空白组显着升高(p<0.05),p-AMPKα、p-AMPKα/AMPKα较空白组显著降低(p<0.05);与模型组相比,艾灸组mTOR(p=0.029)、p-mTOR(p=0.005)、p-mTOR/mTOR(p=0.015)、p-Akt/Akt(p=0.002)均显着降低,p-AMPKα(p=0.049)、p-AMPKα/AMPKα(p=0.034)均显着升高;与模型组相比,艾烟组 mTOR(p=0.018)、p-mTOR(p=0.002)、p-Akt/Akt(p=0.029)均显着升高;mTOR的mRNA表达量模型组显着低于空白组(p=0.000),AMPKα1的mRNA表达量模型组显着高于空白组(p=0.014)。艾灸组AMPKα1的mRNA表达量较模型组显着降低(p=0.001)。5.mTOR下游信号分子各组小鼠海马4E-BP1、p-4E-BP1的表达均无明显差别;模型组小鼠海马p-p70S6K /p70S6K(p=0.001)、p-ULK(p=0.028)表达较空白组显着升高;与模型组相比,艾灸组p-p70S6K/p70S6K的比值显着降低(p=0.003),LC3-Ⅱ的表达量显着增高(p=0.034);艾烟组p-p70S6K/p70S6K的比值较模型组显着降低(p=0.006)。结论:1.艾灸与艾烟抗AD的效应有所不同,艾灸可有效改善AD模型小鼠学习记忆障碍,减少Aβ沉积及tau蛋白磷酸化;艾烟干预对模型小鼠学习记忆的改善作用不及艾灸干预,但艾烟干预可有效改善AD模型小鼠情绪相关的行为学异常,减少老年斑沉积。2.艾灸可能是通过抑制Akt活化,激活AMPKα,进而抑制mTOR,调节蛋白质翻译,增强自噬,减少Aβ及tau蛋白的生成,增强Aβ及磷酸化tau蛋白的清除,以延缓AD的发生发展。3.艾烟可能是通过抑制Akt活化,降低mTOR磷酸化水平,抑制p70S6K信号分子活化,抑制Aβ的积聚,减少老年斑的生成,来延缓AD的发生发展。
张自峰[4]2006年在《年龄相关性白内障相关基因NDRG2和MRG15的功能研究》文中研究指明目的 年龄相关性白内障(age-related cataract，ARC)，是目前主要的致盲性眼病。世界范围内近半数的盲由ARC所导致。随着人口老龄化趋势明显加剧，ARC的患病人数也将持续增加。虽然通过手术的方法可以对ARC进行有效的治疗，但不可避免的存在一些术后并发症，而且治疗花费的资金也已成为世界各国沉重的医疗负担。因此，ARC发病机制的研究不但是生物医学领域的重要课题，也具有重要的社会意义。 NDRG2(N-myc downstream regulated gene 2)是我校生化教研室近期克隆到的一个与细胞增殖、分化相关的新基因，它与衰老的相关性提示其可能在ARC的发生、发展中起一定的作用。MRG15(MORF4-related gene on chromosome 15)是我课题组在前期工作中，通过改良的消减杂交技术，从ARC与正常晶状体上皮间筛选到的一个重要的差异表达基因。本实验将验证NDRG2和MRG15两个基因在ARC与正常晶状体上皮间的差异表达、观察它们对氧化刺激的反应、以及在基因表达增加或抑制的情况下晶状体上皮细胞功能的变化，研究NDRG2和MRG15在ARC中的相关功能，从基因水平探讨白内障的发病机制，为ARC的防治提供新的思路和理论依据，并对这两个基因的功能研究给予有益的补充。
李楠[5]2016年在《人源性阿尔茨海默病噬菌体抗体库的构建及Aβ单链抗体的筛选与初步效价研究》文中提出阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一种与年龄相关度较高的神经变性疾病,是老年期痴呆的主要原因,其引起的并发症是导致老年人死亡的最常见原因之一。临床表现以记忆障碍、认知障碍和精神障碍为主。由聚集在神经细胞外的以β淀粉样蛋白(β-amyloid peptide,Aβ)为主要成分的老年斑(Senile plaques,SP),和聚集在神经细胞内的由过度磷酸化的Tau蛋白形成的纤维缠结(Neurofibrillary tangles,NFT)共同构成AD的重要病理改变。在AD的相关研究中,基于AD发病病因的多个假说被相继提出:例如胆碱能假说、Aβ假说、Tau蛋白假说和炎性因子假说等。最近的研究通常采用最普遍接受的Aβ假说,但Aβ假说对这种束手无策的疾病复杂的病理生理过程还是无法完美的解释。做为老年斑主要构成成份的Aβ在体内的生成是由淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein,APP)通过β和"-分泌酶剪切得来,APP属于跨膜蛋白,其跨膜胞外部分可以被#-分泌酶或β-分泌酶(BACE1)切割,从而产生两类N端具有可溶性的APP大片段,即APPs#和APPsβ,其相对应的残留在细胞膜上的C端APP片段分别为CTF#和CTFβ。然后CTF#和CTFβ可以分别由"-分泌酶(PS1)水解剪切产生Aβ片段。AD患者体内形成的Aβ蛋白有多种存在形式:可溶性Aβ单体、寡聚体、不可溶的Aβ纤维等,无论何种形式的Aβ蛋白对神经细胞都具有毒性,会导致神经细胞变性,继而发生凋亡,其中关键的问题是哪种结构的aβ类型与ad的发病机理联系最密切。在既往很长一段时间人们认为在细胞外异常沉积的aβ蛋白是ad的病理标记物,它也被认为是启动神经细胞变性和程序性死亡的重要病因。但最近的研究数据显示,最早生成于细胞内的具有可溶性的aβ单体及寡聚物往往是真正启动ad发病过程的关键所在,与aβ纤维相比具有更强烈的神经毒性,其中可溶性的寡聚体被认为与ad的发病,病情进展密切相关,可溶性aβ寡聚体的水平被认为在疾病的发病过程中尤其重要。最近的研究也特别强调了aβ寡聚体在突触的损伤中占主导地位,在ad病理性标记物中是仅有的参与到大脑功能损伤的信号。而且它也构成淀粉样斑块、启动和促进了ad的病情发展。aβ片段生成后,aβ缩氨酸自发地聚集成为可溶性的aβ寡聚体,这些寡聚物形成的纤维,继而形成不溶的片状结构而最终堆积成为弥漫性斑块。aβ1-42寡聚体是由神经元和相关联的星型胶质细胞的共同作用下产生,它能够引起氧化应激损伤,加速tau蛋白的过度磷酸化,从而造成对突触和线粒体的毒性作用。aβ1-42寡聚体拥有对富含胆固醇的膜表面持久的损伤能力,这些主要存在于少突胶质细胞和神经髓鞘中。目前的研究提示aβ1-42寡聚体在ad的损伤中占主要地位。针对于aβ1-42寡聚体的靶向免疫治疗可能是解锁ad治疗困境的有力钥匙。抗体库技术是筛选不同生物抗体的有力工具,具体是将外源性多肽表达于噬菌体的表面。抗体库技术被用来筛选及鉴定人源化治疗性抗体。约30%用于临床治疗性抗体是应用抗体库技术开发所得。除去治疗的价值,抗体库技术正逐渐在研究领域被用于识别及鉴定的目的。表达在抗体库表面的抗体或外源性多肽通常是依赖于目的基因的核酸序列与噬菌体外壳蛋白融合而实现的。在抗体库技术中,噬菌体是包含外来目的多肽核苷酸序列的展示系统。从抗体库中筛选抗体有多次的生物淘选过程。每一次的淘选都使抗体得到进一步的富集,可通过增加淘选的次数使抗体得到有效富集。高亲和力的抗体保留,低亲和力的抗体被洗脱掉。多次生物淘选后,仅有高亲和力的特异性抗体被保留下来。这使快速简便筛选单克隆抗体成为可能。特异性抗体基于不同的特性而被筛选出来,这使抗体库技术成为抗体筛选和工程化的有效途径。噬菌体抗体库技术是生产特异性抗体的重要来源,为ad的单克隆抗体治疗提供了基础和保障。本系列研究以此为切入点,分叁个部分探讨ad的单克隆抗体治疗的机制。第一部分,目的:构建人源性阿尔茨海默病噬菌体抗体库。方法:抽取20例ad病人的外周血,提取总rna,应用rt-pcr法得到人抗体vh和vl基因。将vh和vl连接,制备出scfv片段,然后将其酶切,再克隆到pcantab5e噬菌体载体上,电转化tg1感受态菌,辅助噬菌体m13k07超感染,构建出噬菌体单链抗体库。结果:从ad病人的外周血中成功提取总rna,逆转录pcr扩增vh,vl可变区基因,连接形成单链抗体,最终构建了库容为2.0$108的单链抗体库。bstnⅠ酶切鉴定构建的抗体库具有良好的多样性。结论:成功地构建了噬菌体展示的抗人阿尔茨海默病单链抗体库,为进一步筛选抗体,继而为ad治疗的进一步研究奠定了基础。第二部分,目的:筛选anti-aβ1-42特异性抗体。方法:以aβ1-42寡聚体为抗原,经过4轮“吸附-洗脱-扩增”叁步骤的生物淘选过程,并且在每轮结束时用洗脱得到的噬菌体来再次重复感染大肠杆菌,将其均匀涂布与sobag平板上,统计收获的百分率。在第四轮中,用筛选富集得到的阳性重组噬菌体来感染tgl,将其均匀涂布于sobag平板上。遵循随机化原则来挑取克隆,在辅助噬菌体m13k07的挽救下,分别生产出重组噬茵体抗体,用elisa方法对筛选到的阳性克隆进行诱导表达,sds-page和westernblot应用于特异性鉴定。结果:噬菌体抗体收获百分率呈上升趋势。大部分克隆产生的重组噬菌体都有较高的抗原结合活性。结论:4轮筛选后单克隆抗体得到有效富集。我们挑选活性最高的11a5进行下一步的研究。第叁部分,目的:所筛选出的anti-aβ1-42抗体11a5进行初步效价研究。方法:将11a5、商品化抗体6e10分别与aβ1-42寡聚体混合后脑定位注射于sd大鼠,对照组仅注射aβ1-42,30天后行morris水迷宫实验。将11a5,6e10分别经腹膜内注射于app-ps1模型鼠,每两周一次。分别于治疗后1,2,3月分析外周血中aβ的水平,脑组织中aβ的水平。结果:30天后水迷宫实验显示抗体混合组的sd大鼠较抗体注射组的大鼠行为学改变不明显;app-ps1小鼠治疗后1,2,3月的外周血的aβ水平上升,脑组织中aβ下降,水迷宫实验显示学习记忆能力有明显改善。以治疗后1个月最明显。结论:11a5能够结合aβ1-42使其失活,并且降低app-ps1模型鼠脑组织内aβ的水平,外周血中aβ的升高提示单克隆抗体对脑内的aβ有驱除致其外流的作用。本系列研究成功构建了人源性阿尔茨海默病噬菌体抗体库,并通过4轮“吸附-洗脱-扩增”生物淘选使阳性克隆达到有效富集,挑选出活性最高的人源性单克隆抗体11a5。通过动物实验证明11a5不仅能够直接与aβ1-42寡聚体结合使其失活,而且能使脑内的Aβ外流到外周,同时降低脑内Aβ的水平,使Aβ的聚集受限。本系列研究为AD的单克隆抗体治疗提供了初步的理论基础。
陈非, 马厚勋, 陈恳[6]2014年在《老年痴呆与Klotho基因关联性研究进展》文中研究说明随着人口老龄化社会结构的形成,老年痴呆发病率逐年增高[1],已成为世界性严重的公共健康问题,给社会、家庭带来了沉重负担。有关痴呆的病因和发病机制的研究主要集中在早老素基因、淀粉样蛋白前体基因、载脂蛋白E基因等方面[2]。近年来研究发现,在Klotho基因敲除后的小鼠中过早出现与人类老年阶段相关的多种行为和病理变化,即被认为可能Klotho基因参与了老年痴呆的发病机制,特别是与其发生认知功能障碍具有关联性,为此,
刘斌[7]2017年在《补阳还五汤对APP/PS1双转基因小鼠神经血管单元RAGE/LRP1受体系统的调节机制》文中研究表明背景:阿尔茨海默病(AD)是老年痴呆的一种常见类型,其发病率逐年升高,造成较重的社会负担。AD主要病理特征包括由淀粉样蛋白(Aβ)在细胞外大量沉积形成的老年斑(SP)和神经元丢失。补阳还五汤(BYHWT)是中医补血祛瘀的经典名方,临床用于脑血管意外的治疗有确凿的疗效。本文在前期研究中发现BYHWT对AD小鼠学习记忆能力有明显改善作用,与晚期糖基化终产物受体(RAGE)/低密度脂蛋白受体相关蛋白1(LRP1)信号通路有关。本研究继续对BYHWT作用的机制进行深入研究,以确定BYHWT是否作用于脑微血管内皮细胞(BMEC),影响BMEC外排转运体LRP1内向转运体RAGE调整Aβ中枢代谢而起到防治AD的作用。目的:研究BYHWT对AD小鼠学习记能力、海马形态、内皮细胞和血管形态、细胞凋亡和转运子RAGE/LRP1影响,研究BYHWT对采用Aβ25-35造模的微血管内皮细胞损伤的影响,通过观察AD细胞模型形态学变化、炎症介质分泌、细胞凋亡率和RAGE/LRP1转运体表达,探究药物是否通过影响BMEC功能从而对血脑屏障及神经血管单元产生影响,寻找药物的治疗靶点。方法:BYHWT提取物依据临床给药煎煮法制备。体内实验:选择7月龄APP/早老素(PS1)双转基因小鼠作为AD模型进行实验,采用聚合酶链式反应(PCR)验证APP和PS1基因表达。APP/PS1小鼠随机分为5组(n=20),Model组,多奈哌齐组,BYHWT高、中、低剂量组,另选择C57BL/6小鼠20只作为Control组。Control组和Model组给等体积的生理盐水,阳性药组给多奈哌齐0.001g·kg-1,高、中、低剂量组分别给37.06、18.53、9.26g·kg-1BYHWT(生药量),连续灌胃35日后行Morris水迷宫实验,测定小鼠学习记忆能力,采用苏木精-伊红(HE)染色、透射电子显微镜和Tunel染色观察各组小鼠海马形态结构和细胞凋亡。采用透射电镜(TEM)观察小鼠海马微血管形态改变,采用免疫组织化学(IHC)方法检测海马LRP1、载脂蛋白(Apo J)、RAGE 和 VCAM-1 表达。体外实验:体外培养脑微血管内皮细胞(BMEC),用含有24μmol/L的Aβ25～35细胞培养液培养24h,模拟AD细胞模型,用150μmol/L的BYHWT进行干预。采用光学显微镜观察细胞的一般形态,采用TEM观察细胞的超微结构,ELISA法检测炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α和Aβ25-35分泌,FCM检测细胞凋亡率,WB法检测细胞RAGE、LRP1、ICAM-1、VCAM-1、ApoJ、ApoE、NF-κBp65 蛋白表达。结果:体内实验Morris水迷宫实验显示,在空间探索实验中,与Model组相比,BYHWT高、中剂量组和Donepezil组小鼠穿越平台次数明显较低,目标象限停留时间明显延长。在定位航行实验中,BYHWT高、中剂量组和Donepezil组小鼠的逃避潜伏期明显缩短。HE染色显示Control组小鼠海马CA1区细胞排列规则,模型鼠细胞排列紊乱、细胞层数较少、核仁不清晰,BYHWT组海马CA1区细胞排列比较规则、核仁圆形或椭圆形、细胞层数较多。TEM观察到,ADModel组海马毛细血管变形且窄,内皮细胞不完整,腔外有大空泡,突触融合。经过BYHWT治疗,海马神经元形态逐渐恢复,毛细血管结构清晰,突触形态较好。Tunel法测细胞凋亡显示,与Model组相比,高、中剂量组海马Bcl-2/Bax比值明显增加。IHC显示,与Model组相比,高、中剂量组海马LRP1和ApoJ表达明显升高,且RAGE和NF-κBP65表达明显降低。体外实验通过透射电镜(TEM)观察血管内皮细胞形态,Model组细胞形态学与Control组细胞相比,发生异常改变,如细胞变圆、增殖减慢、细胞核固缩、核周隙增宽、核质比异常、粗面内质网扩张、线粒体空泡变性、微绒毛减少、脱落等。BYHWT低、中、高剂量组及Donepezil组与Model组相比细胞具一定程度的形态学恢复,其中BYHWT以中、高剂量组恢复较明显,且高剂量组及Donepezil组与Control组细胞形态最为接近。ELISA法显示,BYHWT高、中剂量可以下调Aβ诱导的BMEC细胞中IL-1β、IL-6、TNF-α和Aβ25-35的含量,从而减轻Aβ诱导的BMEC细胞产生的炎症反应。同时流式细胞术显示BYHWT高、中剂量可以降低由Aβ诱导的BMEC细胞凋亡。Western Blot法显示BYHWT叁个浓度组与Model组相比对RAGE蛋白表达有明显下调作用,呈剂量依赖关系,高浓度组作用最明显(P<0.01);BYHWT叁个浓度组对LRP1蛋白表达有明显促进作用,呈剂量依赖关系,低浓度组即有明显作用(P<0.01);BYHWT叁个浓度组对NF-κBP65蛋白表达有明显下调作用(P<0.05);BYHWT叁个浓度组中仅高浓度组对ApoE蛋白表达有上调(P<0.05),低浓度和中浓度组没有作用。与Model组相比,BYHWT叁个浓度组对ICAM-1、VCAM-1蛋白表达有明显下调作用,呈剂量依赖关系,中浓度组(P<0.05)、高浓度组(P<0.01)作用最明显,差异有统计学意义;BYHWT叁个浓度组对NF-κBp65蛋白表达有明显下调作用,呈剂量依赖关系,中、高浓度组作用最明显(P<0.01)。结论:体内实验表明BYHWT高、中剂量可改善AD小鼠学习记忆能力,恢复AD小鼠海马CA1区形态,改善海马血管内皮细胞形态,其机制与BYHWT增强AD小鼠海马RAGE蛋白表达,减弱AD小鼠海马LRP蛋白表达密切相关。体外实验进一步得出BYHWT通过调节RAGE/LRP1转运体调节Aβ代谢,通过抑制NF-KBP65信号通路影响ICAM-1、VCAM-1蛋白介导的血管内皮炎症,改善Aβ诱导的脑微血管内皮细胞损伤引起的形态学改变,对脑微血管内皮细胞损伤产生保护作用。
宋敏[8]2007年在《血管活性肠肽调节小胶质细胞功能减少转基因AD小鼠老年斑沉积的实验研究》文中认为研究背景与目的阿尔茨海默病(Alzheimer’s Disease.AD)作为一种多发生于老年和老年前期以进行性认知障碍和记忆力损害为主的神经退行性疾病,其典型神经病理学改变为神经细胞外老年斑、神经纤维缠以及皮层血管淀粉样变性等,但其致病机制一直不甚清楚。随着分子医学的飞跃发展,越来越多的实验证据支持β淀粉样蛋白级联学说这一AD病因假说。该学说认为:在AD患者中,由于基因突变以及环境因素影响,导致Aβ42的产生增多或者降解障碍,从而在大脑中发生堆积,进而活化小胶质细胞和星型胶质细胞,影响神经元的离子平衡、导致氧化损伤等使得神经元功能障碍。其中,小胶质细胞的活化是其关键步骤之一。作为单核吞噬细胞系统中的一员,小胶质细胞通过一方面通过受体介导吞噬、降解Aβ片段从而有利于Aβ斑块的减少,但与此同时把Aβ的异常沉积作为“危险物质”,启动了外源性的抗原呈递过程引发局部无菌性炎症释放炎症因子TNF-α、NO、IL-1β、IL-6、IL-12等,致使邻近神经元死亡和胶质瘢痕形成进而导致病症发生。因此找到一条有效途径能够充分发挥小胶质细胞吞噬Aβ的有益作用,而抑制小胶质细胞抗原呈递过程中的有害作用将能够极大的减轻AD的炎症病变,延缓病程。血管活性肠肽(Vasoactive Intestinal Peptide,VIP)是由28个氨基酸组成的神经多肽,主要由肽类神经元分泌,通过结合表达于免疫细胞上的G蛋白偶联的受体在保持神经免疫网络稳定上发挥重要作用。最近在小胶质细胞上的研究证实:VIP能够通过小胶质细胞上的受体介导的cAMP/MEKK/c-JUN途径以及非cAMP依赖的IKK/IKB途径拮抗内毒素诱导的IL-12、TNF-α和iNOS表达,从而减轻大脑炎症。而且VIP能够通过抑制Jak-STAT1途径有效抑制IFN-γ刺激活化的小胶质细胞表达CD40从而有效抑制小胶质细胞向抗原呈递细胞的转化。由此提示我们VIP在调节炎症因子介导的小胶质细胞活化中可能具有重要作用。回顾既往,早在1984年,Arai H等对AD患者进行放免测定就发现VIP在AD患者的大脑皮层中分泌减少。Zhou JN等的研究也证实在65岁以下组的女性AD患者中大脑SCN区VIP神经元存在明显的丢失。结合这一线索我们推测:在AD病程中,VIP神经元的丢失导致VIP分泌的减少,加速了小胶质细胞的活化,从而促进了AD病理的发展。因此,外源适当补充VIP,通过调节Aβ活化的小胶质细胞的状态,增强其对Aβ的吞噬清除功能、减少释放炎症因子以及与抗原呈递功能相关的共刺激分子的表达,可以改善和延缓AD病情的发生和发展,从而成为AD治疗的一种新的方法和途径。由于目前关于VIP调节Aβ42介导的小胶质细胞活化尚未见报道。为证实该推测,我们进行了了如下研究:在体外细胞实验中比较Aβ活化后的小胶质细胞在有无VIP以及不同的时相点下其吞噬Aβ功能、细胞因子谱系与抗原呈递功能相关的共刺激分子CD40等表型,验证VIP是否具有调节Aβ活化的小胶质细胞功能状态的作用;在此基础上,我们利用pAdEasy腺病毒载体系统构建、纯化了分泌型腺病毒表达载体并定位注入PS1/APP双转基因小鼠的海马区,通过转基因形式的VIP分泌,以保证VIP的在局部脑区浓度的持续稳定,而后检测了动物老年斑沉积的改变、小胶质细胞、星形胶质细胞活化等改变以及行为学变化。结果如下:一、VIP干预对Aβ42活化小胶质细胞株N9细胞吞噬、分泌功能的影响RT-PCR证实小胶质细胞细胞株N9细胞能够组成性表达VPAC1和PAC1,VPAC2在LPS刺激后表达增强,而后分别检测VIP干预对N9细胞吞噬功能、分泌功能以及免疫共刺激分子的表达的影响。得到以下结果:①吞噬功能实验表明:小胶质细胞在老化的Aβ42直接刺激后能够轻微活化吞噬Aβ42,但其效应比较微弱。而在同时加入VIP刺激小胶质细胞活化后,N9的吞噬作用明显增强,在数小时内即可达到高峰。PKC通路激活剂PMA可模拟该作用,而且该增强作用在加入PKC肽抑制剂后下调,提示VIP促进小胶质细胞吞噬作用的途径可能与PKC途径活化有关。②细胞因子分泌以及共刺激分子检测表明:小胶质细胞N9在Aβ42联合小剂量IFN-γ刺激后,上清中NO2-及TNF-α分泌增加,细胞膜CD40分子表达上调,加入VIP后,该刺激效应受到明显抑制,提示VIP能够调节Aβ42联合小剂量IFN-γ对小胶质细胞的活化效应。以上结果提示应用VIP有助于促进小胶质细胞吞噬Aβ42,减轻Aβ斑块沉积以及小胶质细胞活化后炎症因子的释放从而减轻神经毒性作用,为后续体内实验奠定了基础。二、分泌型VIP腺病毒载体的构建及其功能性表达通过RT-PCR技术从C57/BL6小鼠的大脑总RNA中扩增出了VIPmRNA的全长,进一步利用pAdEasy腺病毒系统成功构建了重组VIP腺病毒载体并在293细胞中成功进行了表达。结果如下:首先将扩增出的VIPmRNA全长亚克隆到腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV-VIP,而后在E.coli内进行同源重组。酶切、测序证实我们构建出了腺病毒载体pAdEasy-VIP。进一步在293细胞中获得了包装、扩增,并通过RT-PCR和免疫组化分别从mRNA和蛋白质水平证明了我们所需要的VIP多肽在293细胞上成功的进行了表达,ELISA检测证实与对照组相比,重组病毒转染后293细胞上清中VIP多肽的表达明显增高,证明我们成功构建了重组VIP腺病毒载体,为下一步进行基因转移提供了有效的分子工具。叁、海马定位注射重组VIP腺病毒对PS1/APP双转基因小鼠的病理学及行为学影响①对转基因小鼠杂合体种鼠(来源于Jackson实验室)进行繁殖,剪取鼠尾提取基因组DNA,并进行基因型分析,筛选得到了不同月龄的APP/PS1双转基因AD小鼠。抗Aβ免疫荧光组织化学染色显示9个月左右PS1/APP双转基因AD小鼠的皮层及海马区有大量的Aβ染色阳性斑块,随着年龄的增长其沉积亦更加明显,在14月左右的转基因小鼠脑内证实小胶质细胞和星型胶质细胞在Aβ沉积周围已明显聚集、活化。透射电子显微镜下海马区Aβ周围神经元溃变、肿胀,神经突触稀松形态不一,微管小泡及线粒体堆积,胶质细胞包绕Aβ斑块。水迷宫实验发现该小鼠逃避潜伏期较对照鼠显著延长。表明APP/PS1双转基因AD小鼠具有AD主要的病理及行为学特征,为本研究提供了理想的AD动物模型。②选取14月转基因小鼠海马定位注射重组VIP腺病毒而后检测Aβ斑块、胶质细胞的活化可见:在体内腺病毒可以有效转染扩散并长时间表达目标蛋白。免疫组化检测表明注射病毒1、2、4周后,重组VIP腺病毒注射组相海马区Aβ斑块沉积比对照空白腺病毒组明显下降,且在腺病毒注射部位周围比较明显。对比不同时相点可见:在注射的1周Aβ斑块沉积即开始减少,第2、4周进一步下降。比较胶质细胞的活化可见重组VIP腺病毒注射组相比对照空白腺病毒组:小胶质细胞活化比例增加,而星型胶质细胞无明显变化。结合体外实验我们认为:通过定位注射重组VIP腺病毒能够有效减轻Aβ斑块沉积,其机制可能与小胶质细胞活化后吞噬功能增强相关。但是水迷宫实验逃避潜伏期对比示注射重组VIP腺病毒小鼠和对照组小鼠学习和记忆能力未见显着性差别。③采用机械分离法分离出胚10d C57/BL6小鼠皮层NSCs,并利用加入生长因子B27和碱性成纤维细胞生长因子的DMEM/F12(1:1)培养基成功地进行了NSCs的培养和传代。采用Nestin、β-Tublin、MAP-2、GFAP进行鉴定证实培养的细胞有阳性表达,说明我们分离、培养的细胞为NSCs,而且具有向神经元和神经胶质细胞分化的潜能。进一步利用构建的腺病毒载体pAdEasy-VIP进行感染神经干细胞实验证实腺病毒载体pAdEasy-VIP能够感染神经细胞并保持较长时间的表达。定位移植VIP修饰的神经干细胞PS1/APP双转基因小鼠海马后四周仍可见表达EGFP的细胞,其大多分布在针道附近,部分迁移至颗粒细胞层并分化为成年神经细胞,部分细胞向纵深迁移并围绕在Aβ斑块周围。提示我们脑内在体应用神经干细胞作为腺病毒载体不仅能够表达VIP多肽,而且将有望补充丢失的神经元。以上结果证实:血管活性肠肽作为神经免疫的重要调节性多肽,能够有效促进小胶质细胞吞噬Aβ42,抑制Aβ42联合小剂量IFN-γ刺激后NO2-及TNF-α炎症因子的释放以及与抗原呈递功能相关的共刺激分子CD40的表达,通过腺病毒转基因形式的海马定位表达有效的减轻了AD转基因小鼠的Aβ斑块沉积,为研究通过调节小胶质细胞活化减轻AD病变提供了有益的思路。
参考文献：
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[4]. 年龄相关性白内障相关基因NDRG2和MRG15的功能研究[D]. 张自峰. 第四军医大学. 2006
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[6]. 老年痴呆与Klotho基因关联性研究进展[J]. 陈非, 马厚勋, 陈恳. 现代医药卫生. 2014
[7]. 补阳还五汤对APP/PS1双转基因小鼠神经血管单元RAGE/LRP1受体系统的调节机制[D]. 刘斌. 黑龙江中医药大学. 2017
[8]. 血管活性肠肽调节小胶质细胞功能减少转基因AD小鼠老年斑沉积的实验研究[D]. 宋敏. 第叁军医大学. 2007