吴东林, 张玉静, 阮承迈, 陈守义, 李鹏[1]2001年在《端粒酶重复扩增程序(TRAP)的改进和应用以及端粒酶酶学性质的研究》文中认为端粒酶(Telomerase)是一种核糖核蛋白,它能利用自身的RNA组分作为模板,催化合成端粒重复序列(脊椎动物为5′-GTTAG-3′).目前应用最广的检测端粒酶活性的方法是Kim等的端粒重复扩增程序(Telomeric Repeat Amplification Protocol,TRAP).该方法引入了PCR扩增步骤,使检测灵敏度大大增加.本
吴东林[2]2001年在《端粒重复扩增程序（TRAP）的改进和应用以及端粒酶酶学性质研究》文中研究表明端粒酶（Telomerase）是一种核糖核蛋白，它能利用自身的RNA组分作为模板，催化合成端粒重复序列（脊椎动物为5’—GGTTAG—3’）。研究表明端粒酶的表达与细胞永生化及肿瘤发生密切相关，因此对端粒酶活性的检测日益受到重视。目前应用最广的检测端粒酶活性的方法是Kim等的端粒重复扩增程序（Telomeric Repeat Amplification Protocol，TRAP）。该方法引入了PCR扩增步骤，使检测灵敏度大大增加。但由于PCR反应的反向引物是端粒重复的互补序列，可结合在端粒重复序列的任意部位，导致PCR产物长度发生变化（变长或变短），不能如实反映端粒酶的持续合成能力（进行性，processivity），这个缺陷限制了TRAP反应的实际应用效果。针对这个问题，一些研究者通过在反向引物CX的5’末端加入短的锚定序列的方法阻止PCR产物错误延长，但未解决PCR产物缩短的问题。利用重新设计的反向引物和特殊的反应体系，对TRAP方法进行了重大改进，解决了上述问题，实现了对端粒酶活性的准确测定。利用这个方法，对各种细胞系，肿瘤临床样品的端粒酶活性进行了测定。并对端粒酶的酶学性质进行了研究。端粒重复扩增程序（TRAP）的改进 重新设计TRAP反应引物P1和P2。其中P2引物包括两部分，分别为端粒序列结合部分和锚定部分，反向引物的重新设计是本实验的关键改进之一。改进反应体系，引物使用经过重新设计的P1和P2。在体系中只有dATP、dTTP、dGTP叁种核苷酸，不含dCTP核苷酸。端粒酶延伸反应后进行接尾反应，反应体系中的Taq聚合酶以P2的锚定部分为模板，在端粒酶产物末端催化合成锚定的“尾”序列。此步反应也可与延伸反应同时进行。反应液90℃加热3min灭活端粒酶，在此期间加入dCTP。然后进行PCR扩增。利用人工合成的端粒酶产物作为模板进行TRAP反应，表明改进反应能正确进行PCR扩增，达到了设计目的。端粒重复扩增程序（TRAP）的条件优化 对改进的TRAP反应进行优化，确定PCR扩增条件：94℃30s，64℃45s，72℃1min，27～30个循环。确定反应的最适pH为8.3，最适Mg离子浓度为1.5mM。检测了方法的灵敏度，人工合成模板R5含量在0.002～0.2amol 中文摘要一之间呈线性关系。检测了 293细胞的端粒酶活性，来自 10个细胞的抽提物可检测到活性，且细胞数在30～1000之间呈线性关系。不同细胞系与肿鹰样品端粒醇活性测定 测定了40例肿瘤细胞的端粒酶活性，其中37例阳性，3例阴性，阳．性率·92．5％。人的心、肺、胃、肾等正常组织未见端粒酶活性，人体胎盘组织有端粒酶活性。肿瘤细胞系293、Hela细胞、SMMC、HepZ、MCF7均可见端粒酶活性。并初步总结了端粒酶活性与肿瘤样本病理指标间的关系。端粒酶活性和端粒酶催化亚基表达的相关性 通过RT—PCR检测hTERT基因的表达，肿瘤样品有特异扩增产物。发现肿瘤样品端粒酶活性与端粒酶催化亚基表达之间有一致性。但端粒酶活性大小与催化亚基表达强度之间没有正相关关系。说明除催化亚基决定端粒酶活性外，细胞中的其他因素对端粒酶活性也有较大影响。端粒酶酶学性质研究 利用改进的lLAP方法对端粒酶的酶学性质进行了研究，发现不同种类的脱氧核苔酸对端粒酶活性的影响不同，考察了端粒酶的底物专一性；证明人的端粒酶对端粒序列有一定的核酸酶活性。
韩烨[3]2005年在《不同毒力的MDV引起的端粒酶活性变化及MDV特异序列在宿主细胞的定位研究》文中研究指明本研究首次定位了马立克氏病毒(MDV)整合在宿主细胞大、中染色体的端粒附近,从而提示马立克氏病(MD)的形成与宿主细胞端粒结构有着密切的关系。两种MDV 强毒株均引起MD 肿瘤病的发生,且鸡的端粒酶活性在没有临床症状和可视病变出现之前就被激活,并与病毒血症的动态呈显着正相关。马立克氏病淋巴瘤细胞系MDCC-MSB1 的高水平的酶活性,再次阐明端粒酶在禽类病毒性肿瘤疾病中的作用;同时对酶活性大小和催化亚基的表达强度做了相关分析。meq 基因是MDV 的主要致瘤基因,MDV 强毒株在潜伏感染阶段,可同时检测到meq 和L-meq 基因,而L-meq 的检出恰好是端粒酶水平较高的阶段。MD的发病进程、特别是MDV 的潜伏感染,在某种程度上与meq 基因的变化和端粒酶活性的动态具有一定关系;MDV 强毒株在CEF 上高次数传代,均未发生meq基因的改变。本文从宿主细胞和病毒本身入手,为阐明MD 的发病机理提供可靠的理论依据,这将有助于阐明人类肿瘤的发生机理,为预防和治疗肿瘤提供理论依据,必将产生较大的经济效益和社会效益。
陈昌岳[4]2011年在《靶向端粒G四重折迭结构的抗癌策略的研究》文中提出真核生物的染色体末端(端粒),是一个蛋白质-DNA复合物,它能保护染色体末端使之避免末端融合和末端降解。而端粒3’未端是一段富含TTAGGG的重复序列,它能折迭成G-quadruplex四重折迭结构并抑制端粒酶活性。端粒长度的动态平衡是癌症细胞无限增值的先决条件。在超过85%的癌症细胞中,端粒长度的动态平衡是被端粒酶维持的。在另外15%癌症细胞中,还存在以链交换(ALT)为基础的其他端粒延伸途径。Hurley实验组在1999年报道称在TS-TRAP中K+的浓度增加会导致端粒酶活性的降低,这和早期一些与G-quadruplex有相互作用的小分子如TMPYP4,BSU-1051在端粒酶延伸中的表现相似。从那以后,人们就把小分子在TS-TRAP中的ICso和它们稳定G-quadruplex的能力建立了联系。我选择了四个有报道的与G-quadruplex结合的小分子BMVC、Zn-TTAPc、 TSPc和Cu-TSPc,用一种野生型(WT)和两种突变型的端粒酶(CAC和CUA)一起延伸TS底物,先后在传统的TS-TRAP和我首创的单管双色TRAP方法来考察究竟在小分子抑制端粒酶延伸过程中有多少是通过小分子稳定G四重折迭结构来达到抑制效果的。实验结果和预期不符,我发现这些所谓的G4配体是通过多种抑制途径抑制端粒酶介导的端粒延伸的,这其中通过稳定端粒G四重折迭结构来抑制端粒延伸只占整个抑制贡献中极少一部分。而我通常用的那叁种方法产生的抑制根本不是由于小分子稳定端粒G-quadruplex对端粒酶延伸抑制造成的。这个结论说明以前用小分子在端粒酶直接延伸、TS-TRAP和TSG4-TRAP的抑制IC50来评价小分子在端粒酶延伸过程中稳定G-quadruplex的能力是不准确的。这一结论说明小分子稳定G-quadruplex途径的抗癌机制还有待研究,同时单管双色TRAP也可以作为体外研究小分子在抑制端粒酶延伸机制中特异性和非特异性作用的系统。bisQMP是周翔实验室合成的一个水溶性好的光诱导的小分子交联剂,bisQMP是醌的前体,在>400nm的可见光下可以光诱导产生甲基中间体(o-QM), bisQMP I由于其亲电性可以进攻核酸和蛋白质上的亲核基团,是一种潜在的核酸烷基化试剂。为了进一步提高bisQMP的特异靶向性,我将bisQMP和一段寡核苷酸通过化学偶联反应得到一个序列导向性的光交联寡核苷酸探针,靶点是染色体末端端粒序列。在体外我分别用的电泳实验和PCR阻滞实验显示了这个光交联的寡核苷酸探针优秀的序列靶向性。我预期将它导入Hela细胞后这个探针能和端粒序列在光诱导下以共价键结合,光加合物结合端粒区或悬突区会阻止端粒的复制或端粒酶介导的端粒延伸,这样会导致端粒的快速损耗,最终导致细胞的凋亡。但接着的Annexin V-FITC染色的细胞凋亡实验却显示这个序列导向性探针和对照组随机链的探针相比却没有额外的显着抑制。这种结果可能由于这个光交联的寡核苷酸探针在细胞中与细胞组分非特异性作用,由于因素复杂,目前实验仍在进行中。
参考文献：
[1]. 端粒酶重复扩增程序(TRAP)的改进和应用以及端粒酶酶学性质的研究[C]. 吴东林, 张玉静, 阮承迈, 陈守义, 李鹏. 中国生物化学与分子生物学会第八届会员代表大会暨全国学术会议论文摘要集. 2001
[2]. 端粒重复扩增程序（TRAP）的改进和应用以及端粒酶酶学性质研究[D]. 吴东林. 中国人民解放军军需大学. 2001
[3]. 不同毒力的MDV引起的端粒酶活性变化及MDV特异序列在宿主细胞的定位研究[D]. 韩烨. 吉林大学. 2005
[4]. 靶向端粒G四重折迭结构的抗癌策略的研究[D]. 陈昌岳. 武汉大学. 2011