朱明月[1]2015年在《番木瓜种子提取物异硫氰酸苄酯对肝癌细胞恶性行为的影响及其作用机制》文中提出异硫氰酸苄酯(Benzyl isothiocyanate, BITC)是异硫氰酸酯类化合物(Isothiocyanates, ITCs)的一种,在番木瓜种子中含量丰富,能够诱导包括乳腺癌、膀胱癌、前列腺癌、卵巢癌、白血病等多种肿瘤细胞的凋亡和周期阻滞,同时具有抑制肿瘤细胞侵袭和转移的作用。甲胎蛋白(a-fetoprotein, AFP)是肝癌细胞合成的特异性很高的蛋白质,在肝癌耐药中发挥重要的作用。本课题采用MTT、DAPI染色、流式细胞术、划痕修复、transwell侵袭和转移、脂质体转染、Western Blot、酶活性分析等方法,研究了BITC对肝癌细胞恶性行为的影响及AFP在其中发挥的功能和机制。研究结果显示：1、BITC能够抑制肝癌细胞Bel7402和HLE细胞增殖,引起Bel7402和HLE细胞形态变化,诱导Bel7402和HLE细胞凋亡及G2/M期周期阻滞,且均呈剂量依赖性。BITC通过诱导caspase-3酶活性的升高和抑制凋亡抑制蛋白Survivin的表达而诱导Bel7402和HLE细胞凋亡；通过下调Cyclin B1、CDK1、Cdc25c的表达以及提高p21和weel蛋白的表达诱导HLE细胞G2/M周期阻滞。2、干扰Bel7402细胞中的AFP表达能够增加BITC对其生长的抑制作用,增强BITC对其凋亡诱导作用和G2/M周期阻滞作用,在HLE细胞中过表达甲胎蛋白(alpha-fetoprotein, AFP)则能够降低BITC对其生长率的抑制作用,减少BITC对其凋亡诱导作用和G2/M周期阻滞作用。干扰Bel7402细胞中AFP的表达能够增强caspase-3的活性从而增强BITC的凋亡诱导作用,相反,在HLE中过表达AFP则能降低caspase-3的活性从而消弱BITC的凋亡诱导作用；干扰AFP表达导致p21表达上调及CDK1的表达下调而增强G2/M周期阻滞的程度,相反,过表达AFP则导致p21表达下调及CDK1的表达上调而消弱G2/M周期阻滞的程度。3、BITC通过降低基质金属蛋白酶MMP2、MMP9和CXCR4的表达及抑制MNP2、MMP9的酶活性而抑制Bel7402和HLE细胞的划痕修复、细胞迁移和细胞侵袭能力。4、干扰AFP表达导致PTEN表达上调,PI3K/AKT信号通路受阻,MMP2、MMP9、CXCR4的表达及MMP2和MMP9的活性受到进一步的抑制,从而导致对BITC诱导的迁移和侵袭的抑制作用进一步增强；相反,过表达AFP则导致PTEN表达下调,PI3K/AKT信号通路活化,MMP2、MMP9、CXCR4的表达及MMP2和MMP9的活性增强,从而导致对BITC诱导的迁移和侵袭的抑制作用被消弱。综上所述,番木瓜种子提取物BITC能抑制肝癌细胞的恶性行为,AFP可对抗BITC的作用；AFP可能是肝癌细胞恶性行为的重要分子。
于杉[2]2016年在《SPOCK1对人神经胶质瘤细胞的作用及其分子机制的体外实验研究》文中研究指明神经胶质瘤(glioma)是最常见的中枢神经系统恶性肿瘤,其占中枢神经系统肿瘤的30%和全部恶性颅内肿瘤的80%。神经胶质瘤多来源于少突胶质细胞,星形胶质细胞以及室管膜。神经胶质瘤病理类型包括少突胶质细胞瘤、胶质母细胞瘤、室管膜瘤、以及星形胶质细胞瘤等。由于肿瘤细胞的增殖及瘤体积的增大,压迫中枢神经并引起颅内压升高,导致极高的致死率。目前神经胶质瘤的治疗手段多为外科手术结合化疗和放疗的联合疗法。外科手术最为有效,但其对正常脑组织的损伤也最为严重。同时,多数神经胶质瘤呈浸润性生长,外科手术无法将其完全切除,因而其术后复发率很高。放疗对神经胶质瘤的作用有限,往往作为辅助手段,由于血脑屏障的存在,限制了很多化疗药物的应用。因此,深入研究神经胶质瘤的分子发病机理,寻找其发生发展密切相关的信号通路及其关键分子靶点,对于早期防治及其开拓神经胶质瘤治疗的新途径至关重要。SPOCK1是编码基质细胞糖蛋白家族的成员,它们均隶属于BM-40/SPARC/骨粘连蛋白家族,它的分子结构特点说明它可以作为一种黏附蛋白,不仅能够参与细胞基质与细胞表面的相互作用,而且能够参与细胞形态改变、参与细胞增殖及迁移过程,因而在物种生存中发挥重要作用。近年来的研究发现,SPOCK1在肝癌、肺癌、前列腺癌、胆囊癌、卵巢癌等恶性肿瘤组织中出现过度表达的现象,并与其病理分型及恶化程度呈正相关,揭示了SPOCK1与肿瘤的发生、发展有着密切联系。最近的一项研究表明SPOCK1在多型性胶质母细胞瘤和纤维型星形细胞瘤组织中高表达,说明SPOCK1基因在神经胶质瘤的发生与发展过程中可能发挥重要作用。然而,SPOCK1对人神经胶质瘤细胞生物学功能改变的影响,以及其潜在的发生机制国内外仅有1篇文献报道。本研究在国内外研究进展基础上,通过基因工程重组技术在人神经胶质瘤细胞内沉默SPOCK1基因以及过表达SPOCK1基因等,系统评价SPOCK1基因对人神经胶质瘤细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭的影响,并进一步研究SPOCK1基因对PI3K/AKT和Wnt/β-catenin信号转导通路的作用,从而探讨SPOCK1与神经胶质瘤发生、发展之间的作用及其涉及的信号通路与分子靶点。本研究主要取得以下学术进展:1.分别成功构建了SPOCK1基因沉默及过表达载体,为研究SPOCK1在神经胶质瘤发生发展中的作用奠定了实验基础。根据SPOCK1基因序列设计靶向抑制该基因表达sh RNA序列,并在体外人工合成,通过脂质体转入SPOCK1基因高表达的U87MG细胞株。将过表达质粒稳定转染至SPOCK1低表达的U251细胞株,转染细胞通过G418进行稳定筛选,应用实时荧光定量PCR与Western blot检测SPOCK1基因的干扰效率。其检测结果显示稳定转染sh RNA的U87MG细胞株的SPOCK1基因在m RNA以及蛋白水平表达受到抑制,稳定转染过表达质粒的U251细胞株的SPOCK1基因在m RNA以及蛋白水平表达升高,与对照组相比具有显着性差异。2.证实了沉默SPOCK1基因显着抑制人神经胶质瘤细胞的增殖,而SPOCK1基因过表达则显着促进人神经胶质瘤细胞的增殖。我们利用稳定转染的细胞株,通过CCK8方法检测各组细胞的增殖情况,发现SPOCK1基因沉默后明显抑制U87MG细胞株的细胞增殖,当SPOCK1基因表达上调后明显增强U251细胞株的增殖能力。为了更好的反映细胞的增殖能力,我们利用平板克隆形成实验,对各组中形成的单克隆细胞群计数,在接种细胞数的基础上,计算克隆形成率,实验结果提示SPOCK1基因沉默后明显抑制U87MG细胞株的克隆形成能力,SPOCK1基因表达上调后U251细胞株的克隆形成能力增强。通过流式细胞技术检测各组细胞在不同细胞周期的细胞比例,结果提示SPOCK1基因沉默后,G1期细胞比例明显增多,在G2/M期,细胞比例显着减少。在过表达SPOCK1基因组,G1期的细胞比例减少,G2/M期细胞比例显着增多。通过免疫荧光测定技术检测增殖细胞核抗原(PCNA)的分析结果进一步提示SPOCK1基因沉默引起PCNA荧光强度减弱,而SPOCK1基因过表达引起PCNA荧光强度增强,提示SPOCK1基因通过上调PCNA的表达促进神经胶质瘤细胞的增殖。3.证实了沉默SPOCK1基因可显着促进人神经胶质瘤细胞的凋亡,而SPOCK1基因过表达则显着抑制人神经胶质瘤细胞的凋亡。分别将SPOCK1基因沉默载体与过表达稳定转染神经胶质瘤细胞株,通过流式细胞仪分析各组细胞凋亡间的差异,Hoechst染色观察凋亡细胞的细胞核,分析结果显示SPOCK1基因表达受抑制的U87MG组细胞株发生了明显的细胞凋亡,而SPOCK1基因过表达的U251细胞株的细胞凋亡明显受到抑制。为了进一步验证SPOCK1对细胞凋亡的影响,我们通过Western blot方法检测细胞凋亡相关蛋白的表达,研究结果显示SPOCK1基因表达下调后抑制了Bcl-2的表达,促进了Bax,cleaved-caspase-3和cleaved-PARP的表达.反之,SPOCK1基因表达上调促进了Bcl-2的表达,抑制了Bax,cleaved-caspase-3和cleaved-PARP的表达,提出了SPOCK1通过影响多种凋亡关键蛋白的表达抑制神经胶质瘤细胞凋亡的分子机制。4.证实了SPOCK1基因沉默后人神经胶质瘤细胞迁移、侵袭能力显着减低,而SPOCK1基因过表达人神经胶质瘤细胞迁移、侵袭显着增强。为了研究SPOCK1基因对人神经胶质瘤细胞迁移、侵袭的影响,我们首先通过划痕实验观察各组细胞的迁移能力,分别观察0h,12h,24h各组间差别,测量宽度缩小的比例区别计算迁移能力差异,研究结果显示在SPOCK1基因表达下调的U87MG组细胞株迁移能力明显受到抑制,而在SPOCK1基因表上调的U251组细胞株中细胞的迁移能力明显增强。随后,我们通过Transwell小室实验观察各组细胞的侵袭能力,研究结果表明SPOCK1基因表达上调促进人神经胶质瘤细胞的侵袭,SPOCK1表达下调抑制人神经胶质瘤细胞的侵袭。为进一步确定SPOCK1基因对神经胶质瘤细胞转移能力的影响,通过明胶酶谱及Western blot实验检测MMP2,MMP9的活性及蛋白表达,结果表明U87MG组细胞中MMP2和MMP9的活性和表达受到了SPOCK1基因表达下调的抑制,而U251组中SPOCK1基因表达上调促进了MMP2和MMP9的活性和表达,率先阐述了SPOCK1基因过表达促进神经胶质瘤细胞迁移、侵袭的分子机理与相关的分子靶点。5.证实了SPOCK1基因通过调控PI3K/AKT及Wnt/β-catenin信号转导通路影响神经胶质瘤细胞株的生物学功能。为了进一步探讨SPOCK1基因对神经胶质瘤细胞作用的分子发病机制,我们首先通过Western blot检测PI3K/AKT通路相关蛋白表达,结果显示SPOCK1基因沉默后p-PI3K,p-AKT蛋白表达水平下调,相反,SPOCK1基因表达上调,促进p-PI3K,p-AKT蛋白表达。鉴于Wnt/β-catenin信号转导通路在神经胶质瘤发生和发展中同样发挥着重要作用,因此我们利用Western blot检测Wnt1和β-catenin的表达水平并同时检测了其下游靶基因c-MYC和Cyclin D1的蛋白表达,研究结果表明SPOCK1基因沉默后,Wnt1,β-catenin、c-MYC、Cyclin D1的蛋白表达水平随之下调,相反,SPOCK1基因表达上调,促进Wnt1,β-catenin、c-MYC、Cyclin D1的蛋白表达。进一步证实了SPOCK1基因通过PI3K/AKT、Wnt/β-catenin信号通路及其关键分子靶点促进神经胶质瘤细胞的增殖。综合上述研究得到以下结论:本研究通过使SPOCK1基因沉默及过表达两个方面证实SPOCK1基因对人神经胶质瘤细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭的影响。初步探讨了SPOCK1基因可能通过调控PI3K/AKT和Wnt/β-catenin信号通路影响神经胶质瘤细胞株的生物学功能。研究结果说明SPOCK1基因起到了促肿瘤发生的作用,有望成为神经胶质瘤治疗的新靶点。
张红东[3]2001年在《基质金属蛋白酶MMP-2和MMP-9的基因表达与肝癌侵袭和转移的关系》文中研究指明背景与目的 原发性肝细胞癌是我国最常见的恶性肿瘤，在癌症死因中所占的位次居第2位，每年有11万人死于肝癌，并且肝癌的发生率仍在持续上升。虽然现代诊疗技术有了长足进步，但是肝癌的预后仍不容乐观。其中，最主要的原因之一在于：肝内的侵袭性播散和远处的转移，造成肝癌难以切除或术后的复发，所以寻找准确评估肝癌原发灶转移能力和预后的肿瘤标记物，对肝癌转移的诊断、治疗都具有重大意义。原发性肝癌的病理学特点是细胞外基质丰富，大约80％的原发性肝癌被纤维结缔组织包裹。所以，原发性肝癌要发生侵袭和转移，降解细胞外基质、穿透基底膜是关键性的一步，而基质金属蛋白酶（MMPs）在这过程中起着关键性的作用。 MMPs是一类蛋白结构近似，编码基因与胶原酶基因同源的蛋白分解酶家族，至少包括16种对细胞外底物具有催化活性的末端肽酶，且具有以下特征：能分解细胞外基质的一种或多种成分；以胶原形式分泌，须经活化后才具有蛋白水解酶的活性；在活化位点上含锌离子，而且能被螯合剂阻断；酶在中性pH时有最好 浙江大学硕士学位论文的催化功能，并可被基质金属蛋白酶抑制剂（TIMPS）所抑制；它们具有同源的氨基酸序列。其中，MMP。2（明胶酶A）和MMPg（明胶酶B）是分解基质中IV型、V型胶原的最主要的基质金属蛋白酶，这是因为不但外周基质中存在IV型胶原，同时IV型胶原也是基底膜的主要成分之一。虽然，在MMPS中，MMP．2和MMP，9的结构最近似的，但是，MMP－9基因中有48个碱基序列是其它基质金属蛋白酶所没有的，这种差异可能导致MMP－二和MMP－9在肝癌组织和癌旁组织中出现不同的表达。 逆转录聚合酶链反应（reverse transcription－polymerase chain reaction，RT－PCR）是新近迅速发展起来的RNA诊断技术。其原理是从某一特定基因有表达的组织中提取总的RNA，经逆转录反应生成cDNA，然后在特异于该基因的外显子引物对的指引下进行PCR，扩增的产物经凝胶电泳分离后，再经光电密度扫描计算出相应的RNA含量，具有准确、敏感、简便的特点。 方 法 本研究通过RTPCR法，以8．actin为内对照，对扩增以后的28例肝癌组织和癌旁组织 MMP－2基因和 MMP－9基因表达的吸光度值来分析：（l）MMP－2基因表达在肝癌组织和癌旁组织中表达是否有差异；（2）MMP．9基因表达在肝癌组织和癌旁组织中表达是否有差异；（3）MMPZ基因表达与术前AFP水平、肿瘤大小、门静脉癌栓、病理分期等临床病理指标的关系；（4）MMP－9基因表达与术前AFP水平、肿瘤大小、门静脉癌栓、病理分期等临床病理指标的关系；（5）统计学分析：运用SSPS10刀统计软件包进行t检验分析MMP－2基因与MMP－9基因在肝癌组织中是否存在表达异常以及二者表达的相关性。 2 浙江大学硕土学位论文 结 果 1、MMP－ZmRNA在肝癌组织中和癌旁组织中均有表达，且其表达水平有显着性差异（P＜0．of）。MMP－ZmRNA表达水平与术前 AFP、肿瘤大小、WIM分期和门静脉癌栓形成无相关性（P＞0刀5）。 2、MMPgmRNA在肝癌组织和癌旁组织中均有表达，并且，表达水平有显着性差异（P＜0刀1），其表达水平与门静脉癌栓组密切相关（P＜0刀1），但与术前＊FP、肿瘤大小、TN M分期无相关性（P＞O．05）。 3、MMPZmRNA和 MMP－gmRNA在肝癌组织中的表达水平有显着性差异 （P＜0刀1），并经相关性检验（卜0刀1），证明两者表达存在正相关性。 结 论 1、MMP－2基因在原发性肝细胞癌组织中的表达水平明显高于癌旁组织，说明MMP－2与肝癌的恶性生物学行为存在一定的相关性。 2、MMP－9基因在原发性肝细胞癌组织中的表达水平明显高于癌旁组织，并与门静脉癌栓形成呈正相关，说明MMPg基因与肝癌的血行转移，扩散密切相关；可以作为临床上检测肝癌侵袭与转移的指标。 3、MMP－2基因与MMPg基因在肝癌组织中的表达水平不同，并且有相关性，提示MMP－9作为转移性指标更为敏感。
卢奕宇[4]2016年在《放疗联合介入栓塞对VX2兔肝肿瘤MMPs和VEGF表达的影响》文中研究指明研究背景和目的原发性肝细胞癌(primary hepatocellular carcinoma, HCC)是我国最常见的并且是恶性程度最高的恶性肿瘤之一,是一种对人民健康产生严重威胁的恶性肿瘤。原发性肝细胞癌在亚洲具有有很高的发病率和死亡率。然而,最近晚期肝癌1年存活率仍不到50%。经导管肝动脉化学栓塞(transcatheter arterial chemoembolization, TACE)为肝癌非手术治疗的重要方法之一,经股动脉插入导管,将导管超选择地插入肝固有动脉或肿瘤供血分支,然后经导管注入栓塞剂和治疗药物,采用TACE可提高肿瘤局部的药物浓度,从而提高疗效,减少全身副作用。目前,TACE不仅作为不能切除肝癌的主要治疗手段,而且能应用于可切除的肝癌,有门脉癌栓肝癌,恶性肝转移瘤的治疗。放射治疗是通过发射高能的射线破坏肿瘤区域的细胞DNA,造成细胞凋亡来杀伤肿瘤细胞。放射治疗作为肝癌综合治疗的重要手段,主要适用于不能手术切除的患者,可以治疗肝脏肿瘤及远处转移灶,但近年来由于放疗技术的发展,肝癌的放射治疗应用逐渐增多。叁维适形放疗及调强放疗是采用叁维适形治疗或调强计划系统进行聚焦式照射,达到精确定位、精确计算和精确治疗。正常肝脏对辐射较敏感,肝癌肿瘤与低分化鳞癌有相似的放射敏感性,其放射敏感性在人体中仅次于骨髓、淋巴组织和肾脏。VX2瘤株起源于Shope病毒诱发的兔乳头状瘤衍生的鳞癌,在兔动物体内缺乏该肿瘤的抗体,可接种到动物兔肝脏、肾脏、肌肉、肺脏等部位,制成兔原位肿瘤动物模型。VX2兔肝肿瘤具有与人肝脏富血供肿瘤类似的血供特点,动脉血供丰富,它是在大型动物上建立的富血供肝肿瘤模型,是一种良好的肝肿瘤动物模型。VX2兔肝肿瘤适合行动脉化疗栓塞术、影像学、治疗学、抗肿瘤药物的代谢动力学的实验性研究。侵袭、转移是肿瘤恶性行为的最本质特征。细胞外基质(extracellularmatrix, ECM)是肿瘤细胞进行侵袭和迁移的第一道重要屏障。肿瘤细胞转移是一个极其复杂的过程,包括细胞粘附到ECM,蛋白酶分泌,ECM降解和肿瘤细胞迁移,其中重要的第一步是肿瘤细胞通过宿主细胞和ECM的屏障,穿越组织的边界。细胞分泌的蛋白酶比如纤溶酶原激活剂、丝氨酸蛋白酶、基质金属蛋白酶类(matrix metalloproteinases, MMPs)帮助肿瘤细胞实现这迁移过程。MMPs是一类分解细胞外基质、基底膜,与肿瘤的侵袭转移关系十分密切的蛋白水解酶。目前许多研究证明,MMPs的过度表达与肿瘤的浸润和转移相关。在MMPs家族中,MMP-2 (72 kD gelatinase A)和MMP-9 (92 kD gelatinase B)是两个关键的成员,被认为在肝细胞癌侵袭、转移过程降解基质扮演着重要的角色。MMP-2、 MMP-9能降解层粘连蛋白、巢蛋白、明胶,MMP2还激活MMP-9、MMP-13,能降解I型胶原,MMPs共同作用可降解所有的细胞外基质。肝癌细胞的浸润和转移的过程中,必需发生其基底膜(basementmembrane, BM)的降解,BM呈厚实的网状结构,主要由糖蛋白、Ⅳ型胶原等组成,而Ⅳ型胶原又是BM的主要支架。丰富的资料研究表明,肿瘤细胞分泌的MMPs中的MMP-2、MMP-9其降解底物是Ⅳ胶原,使BM发生缺损,促使肿瘤细胞向周围组织浸润和转移。恶性肿瘤组织中MMP-2、MMP-9均有表达,尤其在肿瘤边缘表达最强,而癌周间质等癌旁正常组织却为弱表达或不表达。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)促进肝癌细胞浸润和转移的机制主要有：(1)增加血管的通透性；(2)促进血管内皮细胞的增殖；(3)促进血管支持物的生成；(4)抑制肿瘤细胞的调亡；(5)激活了PI3K/AKT、FAK/paxillin、Shc/RAS/MAPK及PLC-IP3/DAG-PKC等信号传导通路；从而为恶性肿瘤的浸润、转移创造条件。既往的研究表明：放疗可能对肿瘤组织中MMP-2、MMP-9的表达有上调作用,MMP-2、MMP-9是促进肿瘤侵袭中的重要因素,推测放疗引发促进转移的重要机制之一或是上调了MMPs的表达,增强了它们的活性。辐射能激活了VEGF-MMP2通路,诱导P53的上调,使受照射的肝癌细胞和未受照射的肝癌细胞都增强了侵袭能力。通过PI3K/PTEN/AKT/mTOR途径,肝癌的侵袭和转移和MMP9的上调有关。既往研究发现,阻塞小鼠肝脏的动脉血流能引起短暂的血液灌注减少和转移相关的VEGF和MMP的基因的表达,血流灌注的减少和低氧可能引起VEGF表达的上调。在数个碘油栓塞治疗兔VX2肝癌的实验中,残留的癌细胞会出现了MMP-2、MMP-9及VEGF的高表达。有相当部分HCC患者会出现VEGF过表达,VEGF的表达与P53的表达及肿瘤复发率显着相关。TACE后残留的肝癌组织有丰富的血供,增加了VEGF的表达。总之,亚致死剂量放射线辐照肝癌细胞后会导致MMP-2、MMP-9、VEGF表达增强,与肿瘤进展和不良预后有关。肝动脉栓塞／阻塞治疗动物的肝肿瘤动物模型的实验中,亦出现了肿瘤区的MMP-2、MMP-9、VEGF的表达有升高。本研究在建立兔VX2肝癌模型的基础上,探讨VX2兔肝肿瘤放疗、兔肝碘油介入栓塞治疗和放疗联合介入治疗,对VX2兔肝肿瘤MMP-2、MMP-9、VEGF表达的影响。方法1.实验性动物模型制备将液氮内冻存VX2瘤株37。C水浴箱内复苏后,取细胞悬液置传代培养,台盼蓝染色后计算出细胞活率,按1×107/ml活细胞密度调制培养液。于兔后腿外侧肌肉内接种0.5m1培养液,兔后腿外侧肌肉内2周后产生一个约1cm3实质性的肿物,证明荷瘤兔已经制作成功。在2-4周左右进行传代,用25mg/kg1%戊巴比妥钠耳源静脉麻醉,在无菌条件下手术取出荷瘤兔后腿肌肉内种植的肿瘤,剖开瘤体后取灰白色质硬脆的瘤细胞生长活跃的组织部分,制成约1mm×1mm ×1mm大小的肿瘤组织块备用。将实验大白兔麻醉后,铺无菌巾,无菌条件下逐层开腹,暴露肝脏,以眼科剪于肝左中央叶表面剪开肝组织并形成开口小“烧瓶”样窦道,在实验兔肝内,直接植入2-3块已制作好的1mm3左右的瘤块,并以小块的明胶海绵填塞封闭窦口。仔细检查无活动性出血后回纳复位肝脏,逐层关闭腹腔、缝合皮肤。接种2-3周后用二维超声检测瘤体至1.5 cm左右时,可供以下实验使用。2.动物分组随机将实验大白兔分成A、B、C、D四组,每组10只。使用碘油1ml对每只兔肝VX2移植瘤进行栓塞治疗。A组为对照组；B组为单纯碘油栓塞；C为单纯放疗组；D组为先碘油栓塞介入治疗后联合放疗组；A、B、D组接种2-3周后进行介入治疗,C组接种2-3周后进行放射治疗,D组介入治疗后1周后进行放射治疗。实验大白兔完成治疗后1周处死,取出肝脏标本。3.放射治疗接受放疗的模型兔经将大白兔用25 mg/kg 1%戊巴比妥钠耳源静脉麻醉后,在木板体模上固定四肢及头部,大白兔身上安装定位标记,CT扫描范围自胸廓至整个腹部水平,层厚2.5 mm,通过数字显示屏查看肿瘤种植的肝脏部位。在大白兔耳源静脉注入碘帕醇10 ml,再次CT扫描。扫描后的CT图像通过数字化形式的局域网传输到叁维适形治疗计划系统,对图像进行叁维重建后采用叁维治疗(Three dimensional conformal RT,3D-CRT)计划系统设计放射治疗计划。放射治疗计划在叁维治疗计划系统中设计,大体肿瘤体积(GTV)加上8 mm摆位误差和肿瘤的运动范围,成为计划照射体积(PTV)。勾画体表轮廓和正常肝组织等重要脏器。剂量参考点位于肿瘤内,经剂量体积直方图(dose volume histogram, DVH)和等剂量线参考综合评价优化治疗计划,90%的等剂量曲线覆盖PTV。选择瓦里安直线加速器(23EX, Varian Medical Systmes, Palo Alto,USA, dose rate of 4Gy/min)放疗,6MeV或9MeV电子线,处方剂量为单次剂量15Gy。4.介入治疗将实验兔全麻后,腹部朝上,固定于手术台上,备皮、常规手术范围消毒、铺无菌巾。根据腹股沟区血管走向触摸股动脉搏动,确定股动脉位置,纵行切开皮肤,暴露出兔股动脉鞘,股动脉鞘内可见并行排列的股静脉、股动脉和股神经,直径由粗到细。把股动脉从股神经与股静脉中钝性分离出3cm,用4号手术丝线各1根分别穿上已经分离的股动脉近段和远段,结扎远端并提起近段,于暴露的股动脉中间段用眼科剪剪开一斜行切口,见有鲜红色血液喷出,将导管鞘经切口缓缓插人股动脉近端,动脉外留管鞘2厘米,用近端丝线将管鞘与股动脉固定,置入3F微导管和导丝。导管经股动脉、髂动脉进入腹主动脉,第一腰椎水平主动脉处注入造影剂,了解肝动脉走行及腹腔动脉开口位置。沿着微导管置入“J”型导丝于T12-L1之间,导丝头端朝前,如已到达腹腔动脉开口,导丝会头端形态改变或直接嵌入开口,导管探入腹腔干,注入造影剂,继续跟进导丝达肝总动脉处,再次注入造影剂,观察肝动脉走行显示肿瘤血供情况,根据造影情况进行肿瘤血供动脉的超选择插管。行DSA造影检查后分别注入药物进行介入治疗。5. MMPs和VEGF在VX2兔肝肿瘤的表达研究切取后的肿瘤组织经HE染色,光学显微镜观察。应用免疫组织化学、定量PCR、Western blotting检测MMP-2,9和VEGF表达水平。统计学处理应用SPSS16.0软件进行统计学分析,计量资料以均数±标准差(x±s)表示, 两组间比较采用独立样本Bonferroni检验；单因素多组间比较,采用单因素方差分析(one-way ANOVA);以P<0.05为差异有统计学意义。结果1.VX2兔肝肿瘤组织经HE染色后光学显微镜观察到：未经治疗的肿瘤组织内包括光亮和较大细胞核VX2细胞,在各治疗组中均可见存活的VX2细胞,炎症细胞浸润和坏死。坏死区域和未经治疗的肿瘤组织不一样,质地较硬,颜色苍白。经过放射治疗,具有活性的肿瘤细胞的数量减少,部分VX2细胞被纤维组织取代。经肝动脉导管碘油栓塞后,碘油主要是沉积在肿瘤的边缘,只有少数碘油进入缺乏血管的肿瘤中央地区。2.免疫组织化学染色显示,VEGF、MMP-2和MMP-9均在各组的肿瘤组织中表达。他们主要表达于肿瘤细胞的细胞质中。采用Image-Pro Plus 6.0图像分析系统,行VEGF, MMP-2和MMP-9蛋白的定量评估,选取阳性区域测定灰度值。在B、C和D组中,VEGF、MMP-2和MMP-9相比A组显着增加(p<0.05)。然而,VEGF和MMP-2、9的含量在B、C和D组之间没有显着差异(p>0.05)。免疫印迹分析(Western-blot)也用于检钡VEGF、MMP-2、MMP-9的表达,B、C和D组VEGF、MMP-2和MMP-9的表达对比A组也有所增加。我们通过实时PCR比较了残余肿瘤细胞中VEGF、MMP-2和MMP-9的nRNA转录水平,根据比较Ct值定量实时PCR的结果,治疗组(B、C、D组)和A组之间比较：VEGF、MMP-2和MMP-9的nRNA转录水平差异有统计学意义(p<0.05),但B、C和D组之间差异没有统计学意义(p>0.05)。结论VEGF、MMP-2和MMP-9在残留的肿瘤细胞的表达：介入组、放疗组和介入加放疗组与对照组相比有明显增加,介入加放疗组中VEGF、MMP-2和MMP-9的表达对比单一治疗组(介入组、放疗组)略减少,然而各治疗组间没有明显差异。
周琳[5]2013年在《Ezrin在肝细胞癌侵袭转移中的作用及吴茱萸碱对人肝癌细胞株HepG2 Ezrin生物学行为的影响》文中进行了进一步梳理第一章肝细胞癌组织中Ezrin和CD44表达的相关性研究目的：了解Ezrin蛋白、CD44蛋白与肝细胞癌临床病理特征、淋巴结转移的关系。方法：本研究应用免疫组化法(SP法)检测Ezrin蛋白、CD44蛋白在70例肝癌的表达情况,并对它们在病理类型、临床分期、分化程度及淋巴结转移的不同表达进行对比分析。结果：1、Ezrin蛋白、CD44蛋白定位于细胞浆；2、Ezrin蛋白在有淋巴结转移的肝癌中阳性率(97.67%)显着高于无转移者(74.07%)(P<0.05),提示Ezrin蛋白表达与淋巴结转移有显着相关性。与患者年龄,性别,肿瘤大小无关均无显着相关性；3、CD44蛋白阳性表达与淋巴结转移有显着相关性(P<0.05),有淋巴结转移(100%)的阳性率要显着高于无淋巴结转移(81.48%)的阳性率。与临床分期无显着相关性；4、在肝细胞肺癌中,Ezrin蛋白与CD44蛋白阳性表达呈正相关(P<0,05)。结论：1、Ezrin蛋白和CD44在肝癌组织中高表达,两者表达呈正相关；2、Ezrin蛋白在肝细胞癌中的表达与TNM分期和病理分级有关,与有无复发和转移有关,而与其他因素均不相关；3、CD44在肝细胞癌中的表达与与肝癌转移与否有关,而与其他因素均不相关；4、联合检测Ezrin和CD44的表达有助于综合判断肝癌的恶性程度和转移潜能,为基因靶向治疗提供理论依据。第二章特异性下调Ezrin对肝细胞癌侵袭和转移的影响及其作用机制目的：应用小干扰RNA(siRNA)技术特异性下调Ezrin在肝癌细胞株HepG2中的表达,探讨Ezrin在肝细胞癌侵袭和转移中的作用及分子机制。方法：通过siRNA技术特异性下调人肝细胞癌细胞株HepG2中Ezrin的表达,应用Transwell法和划痕法对肝细胞癌侵袭、转移能力的改变进行分析；应用免疫印迹技术检测E-钙钻素,N-钙钻素和波形蛋白(Vimentin)的表达。应用细胞黏附实验和细胞伸展实验观察特异性下调Ezrin对细胞黏附特性和细胞极性形成的影响；应用明胶酶谱实验检测基质金属蛋白酶(MMPs)的活性；用免疫印迹实验检测细胞外基质重构相关蛋白基质金属蛋白酶-2,9(MMP-2,9)的表达以及转录因子c-jun的表达及磷酸化状态。结果：1、Transwell实验显示Ezrin siRNA转染细胞每个低倍视野细胞数平均为33.8个,明显低于未转染细胞(平均77.6个/低倍视野)和非特异性siRNA转染细胞(平均78.7个/低倍视野),统计学分析表明具有显着性差异(P<0.05)。这表明特异性下调Ezrin可以抑制肝细胞癌的侵袭。划痕法实验结果显示,24h后Ezrin siRNA转染细胞的创口愈合较慢(43.8%),而未转染细胞(94.2%)和非特异性SIRNA转染细胞(89.2%)创口基本愈合。统计学分析表明具有显着差异(P<0.05)；2免疫沉淀实验结果表明,在Ezrin siRNA转染细胞中Src的磷酸化水平明显低于未转染细胞和非特异性转染细胞,统计学分析具有显着差异(P<0.05)；免疫印迹实验结果表明在Ezrin siRNA转染细胞、未转染细胞和非特异性转染细胞中,Src的表达没有差异(P>0.05)。以上结果表明特异性下调Ezrin表达可以抑制Src的磷酸化。在Ezrin siRNA转染细胞中N-黏钙素、波形蛋白的表达明显低于未转染细胞和非特异性转染细胞,而E-黏钙素的表达明显高于未转染细胞和非特异性转染细胞,经统计学分析有显着差异(P<0.05)；3应用细胞伸展实验对Ezrin siRNA转染细胞的极性形成进行研究,结果表明在不同时间点Ezrin siRNA转染细胞的伸展明显落后于非特异性RNA转染细胞和未转染细胞(P<0.05)。应用明胶酶谱技术和免疫印迹技术对Ezrin siRNA转染细胞中MMP-2、MMP-9的表达与活性进行检测,明胶酶谱的实验结果显示Ezrin siRNA转染细胞MMP-2、MMP-9的活性明显低于非特异性转染细胞和未转染细胞；免疫印迹实验结果表明Ezrin siRNA转染细胞中MMP-2、MMP-9的表达明显低于非特异性转染细胞和未转染细胞。应用免疫印迹技术检测转录因子c-jun的表达及磷酸化水平,结果发现在Ezrin siRNA转染细胞中,c-jun的磷酸化水平明显降低,而c-jun的表达没有变化。结论：1、特异性下调Ezrin可以抑制肝细胞癌的侵袭和转移,这种作用是通过抑制上皮-间质转化和参与Src信号转导通路的调节实现的；2、特异性下调Ezrin可以抑制肝癌细胞的黏着斑转换、细胞极性形成和细胞外基质的降解；]Ezrin可作为肝细胞癌治疗的一个重要靶点。第叁章吴茱萸碱对人肝癌HepG2Ezrin表达和生物学行为的影响目的：观察吴茱萸碱对HepG2细胞Ezrin表达的影响,探讨吴茱萸碱抗肿瘤作用的可能机制。方法：1、用MTT法观察吴茱萸碱对HepG2细胞增殖的影响；2、用集落形成法观察吴茱萸碱对细胞集落形成的影响；3、通过划痕试验及transwell细胞侵袭试验进一步对吴茱萸碱作用的肝癌细胞迁移和侵袭能力进行分析；4、并用Western Blot和RT-PCR检测吴茱萸碱干预后肿瘤细胞Ezrin蛋白、磷酸化Ezrin蛋白及Ezrin mRNA表达的变化。结果：1、吴茱萸碱抑制HepG2细胞增殖,呈时间和剂量依赖关系,吴茱萸碱作用48小时,IC50约为37.283μM；2、吴茱萸碱影响HepG2细胞的集落形成,呈量效关系；3、细胞划痕实验结果表明药物治疗后肝癌细胞增殖迁移能力受到明显抑制；4、Western Blot和RT-PCR结果显示,吴茱萸碱明显降低Ezrin、磷酸化Ezrin及Ezrin mRNA在HepG2细胞中的表达,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论：1、吴茱萸碱呈时间和剂量依赖性抑制HepG2细胞增殖；2、吴茱萸碱下调Ezrin mRNA和Ezrin蛋白表达及其磷酸化活化,可能成为抗肝癌治疗的新的药物。
宋恩霖[6]2007年在《MMP9、CD147与宫颈鳞状细胞癌生物学行为关系的研究》文中研究说明背景:子宫颈鳞状细胞癌(CSCC)是影响女性健康的常见恶性肿瘤,恶性程度高、侵袭能力强、转移快,其发病率呈逐年增加且伴有年轻化趋势。尽管宫颈鳞状细胞癌的治疗现大有改善,但仍然有多数患者因癌的侵袭转移而导致预后不良。局部浸润和转移一直都是困扰治疗的难题,所以针对其早期的浸润转移入手而进行治疗才是本病治疗成败的关键。近年来,人们在肿瘤侵袭转移机制及抗侵袭转移治疗领域进行了广泛研究,发现细胞外基质(ECM)在肿瘤的侵袭与转移过程中起了关键性的作用。基质金属蛋白酶-9(MMP9)能降解细胞外基质和基底膜中的主要成份Ⅳ型胶原,使肿瘤细胞突破原发部位而发生侵袭和转移。CD147是新发现广泛存在于人体各个组织器官的糖蛋白,属于免疫球蛋白超家族(IgSF)。最新的研究认为它高表达于多种肿瘤,并可通过多种途径诱导MMPs的释放从而促进肿瘤细胞的侵袭和转移。肿瘤的侵袭和转移能力,与其产生诱导基质金属蛋白酶的能力紧密相关。此外,研究表明MMP9和CD147还可通过多种途径参与肿瘤细胞的分裂、分化、凋亡、黏附的调节,即说明MMP9和CD147可能参与宫颈鳞状细胞癌不良生物学行为过程,而对宫颈鳞状细胞癌生物学行为尤其是侵袭和转移机制的深入研究,为制定合理有效的综合治疗方案提供理论依据,具有重要的理论指导意义和临床应用价值。目的:本研究目的旨在通过检测MMP9、CD147分别在宫颈鳞状细胞癌组和慢性宫颈炎对照组中的表达情况,分析它们与宫颈鳞状细胞癌淋巴结转移、临床分期和组织分化程度的关系。方法:采用RT-PCR方法检测40例宫颈鳞状细胞癌(其中淋巴结转移者15例、非转移者25例;临床分期为Ⅰ期的22例、Ⅱ期为18例;低分化鳞状细胞癌25例、中分化鳞状细胞癌15例)和10例慢性宫颈炎对照组中MMP9mRNA的表达;同时采用免疫组化MaxvisonTM法检测此40例宫颈鳞状细胞癌和10例慢性宫颈炎组织中CD147的表达。结果:1. MMP9mRNA在宫颈鳞状细胞癌组和对照组中的相对表达量分别为0.9336±0.2343和0.3759±0.0882,P<0.05,MMP9mRNA在宫颈鳞状细胞癌组的表达显着高于其在对照组的表达,差异具有统计学意义;2. CD147在宫颈鳞状细胞癌组和对照组中的相对表达量分别为0.2531±0.0761和0.1162±0.0326,P<0.05,CD147在宫颈鳞状细胞癌组的表达显着高于其在对照组的表达,差异具有统计学意义; 3. MMP9mRNA在伴有淋巴转移的宫颈鳞状细胞癌组和无淋巴结转移的宫颈鳞状细胞癌组中的相对表达量分别为1.0533±0.2417和0.8356±0.1797 ,P<0.05,MMP9mRNA在伴有淋巴转移的宫颈鳞状细胞癌组的表达显着高于其在非转移组的表达,差异具有统计学意义; 4. CD147在伴有淋巴转移的宫颈鳞状细胞癌组和无淋巴结转移的宫颈鳞状细胞癌组中的相对表达量分别为0.3051±0.0671和0.2104±0.0536,P<0.05,CD147在伴有淋巴转移的宫颈鳞状细胞癌组的表达显着高于其在非转移组的表达,差异具有统计学意义; 3. MMP9mRNA和CD147分别在临床Ⅰ期和临床Ⅱ期宫颈鳞状细胞癌组中的表达无显着差异性;5. MMP9mRNA在宫颈鳞状细胞癌低、中分化组中的相对表达量分别为0.9932±0.2310和0.8343±0.2110,P<0.05,MMP9mRNA在宫颈鳞状细胞癌低分化组中的表达显着高于其在中分化组的表达,差异具有统计学意义;而CD147在此两组间的表达无显着差异性; 5.在宫颈鳞状细胞癌中MMP9mRNA和CD147的表达呈正相关性。结论:1. MMP9和CD147普遍高表达于宫颈鳞状细胞癌组织中,其可能参与肿瘤的发生;2.MMP9和CD147的高表达与宫颈鳞状细胞癌淋巴结转移有关; 3. MMP9和CD147的表达与宫颈鳞状细胞癌的临床分期无明显关系,与宫颈鳞状细胞癌的分化程度的关系尚不能肯定,有待于进一步研究阐明; 4.在宫颈鳞状细胞癌中CD147的表达与MMP9的表达呈正相关,联合检测两者的表达有助判断宫颈鳞状细胞癌的早期转移,辅助指导临床对宫颈鳞状细胞癌的预后判断和治疗。
武雅君[7]2013年在《MACC1基因在胃癌术后复发中的临床意义及其可能机制探索》文中指出研究背景和目的结肠癌转移相关基因1(metastasis associated in colon cancer-1, MACC1)最早是在结肠癌中发现其为癌基因,与结肠癌的转移和预后相关。MACC1是肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor, HGF)/肝细胞生长因子受体(Met tyrosine kinase receptor, c-Met)信号传导通路的重要调节因子。c-Met基因是上世纪80年代发现的一个癌基因,HGF是c-Met受体唯一的配体,当其表达异常时,HGF与c-Met受体结合后激活RAS-有丝分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MARK)、磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol3-kinase, PI3K)-丝氨酸/苏氨酸激酶(Serine/threonine kinase, Akt)、信号传导及转录激活因子(Signal transducers and activators of transcription, STAT)信号传导通路,发挥促细胞增殖、侵袭、血管生成和抗凋亡等功能,与包括结直肠癌、胃癌、肝癌、肺癌在内的多种恶性肿瘤发生及预后相关。MACC1基因位于7号染色体上(7p21.1),含有七个外显子和六个内含子,其cDNA含2559个核苷酸,编码的蛋白含852个氨基酸残基。MACC1基因与肿瘤转移的相关性首先由Stein等在结肠癌中被发现,MACC1高表达的患者术后转移发生的时间短于低表达的患者,是影响结肠癌转移和无转移生存时间长短的独立因素；MACC1表达对结肠癌患者预后也有影响,低表达的患者五年生存率高达80%,而MACC1高表达的患者五年生存率仅15%；此外,基于无远处转移患者结肠癌原发灶MACC1的表达情况,其在预测发生异时性转移和未发生异时性转移的结肠癌患者准确率高达74%和80%,可有效地预测结肠癌转移；在构建的结肠癌细胞株中,MACC1高表达的细胞运动力和增殖力明显高于干扰MACC1表达组；在异种移植的小鼠模型中也发现,MACC1明显促进肿瘤的生长和转移。随后,更多的研究支持stein等人的观点,发现MACC1与结直肠癌的TNM分期、腹膜转移也具有相关性,其表达在Ⅳ期患者中明显高于Ⅰ-Ⅲ期患者,在发生腹膜转移的患者中也明显高于未发生腹膜转移者。在肺癌、肝癌、胰腺癌、卵巢癌、膀胱癌等恶性肿瘤中也发现,MACC1可影响癌症患者的预后或术后复发,可促进肿瘤细胞的增殖和侵袭。在胃癌方面,关于MACC1的作用了解甚少。近期一项临床研究表明,MACC1在胃癌发生腹膜转移的患者中表达量比未发生转移的患者更高。目前,在全球恶性肿瘤中死亡率排名第二位的胃癌,外科手术仍然是其治愈的唯一方式,但即使行根治性切除术后仍有约一半的患者会面临肿瘤复发,而肿瘤一旦发生复发,则严重影响患者的预后。在发生术后复发的患者中,其中有很大一部分是因为出现了血行和腹膜转移,其原因可能是在术前肿瘤细胞就已经发生了不可察觉的微转移。人们普遍认为上皮-间质转变(epithelial-to-mesenchymal, EMT)是肿瘤细胞发生侵袭和转移的非常重要的因素。EMT发生过程是肿瘤细胞发生从上皮细胞表型到间质细胞表型的转化,从细胞间连接和周围基质的束缚中脱离出来,形成单个的肿瘤细胞,从而侵袭周围组织,发生远处转移。目前公认的与EMT发生相关的分子标志包括：间质表型相关基因表达上调,如波形蛋白(vimentin)、N-钙粘蛋白(N-cadherin)、纤连蛋白(Fibronectin)、基质金属蛋白酶-2、基质金属蛋白酶-3、基质金属蛋白酶-9等；上皮表型相关基因表达下调,如E-钙粘蛋白(E-cadherin)、桥粒斑蛋白(desmoplakin)、细胞角蛋白(cytokeratin)等。诱导EMT发生的机制涉及多条信号传导通路,而且各通路之间相互影响,关系错综复杂。HGF、成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor, FGF)、血小板衍生生长因子(platelet-derived growth factor, PDF)可通过酪氨酸激酶受体(receptor tyrosine kinases, RTK)激活Ras-Raf-MAPK信号通路,或作用于PI3K、Src-STAT信号通路而作用于EMT。转化生长因子(ransforming growth factor、TGF)-β通过丝氨酸/酪氨酸激酶受体(receptor serine/threonine kinases, RS/TK)激活R-Smad/Co-Smad通路,或作用于P13K和MARK通路,TGF-β受体信号通路也可直接作用于极性蛋白Par6,抑制Rho的表达,导致上皮细胞间紧密连接松解；Wnt配体信号通路也是调控EMT的重要途径之一,它可与跨膜受体结合,作用于p-连环蛋白(β-catenin)和转录因子LEF-1/TC而作用于EMT。这些信号通路都可调控EMT相关基因的而导致EMT的发生和细胞运动性改变。在结肠癌中已证实,MACC1是c-Met基因的上游转录激活因子,可调控HGF/c-Met信号通路,而HGF/c-Met信号通路可促进胃癌的发生和转移,同时,该信号通路失调也可诱导EMT的发生。因此,MACC1是否与胃癌的术后复发相关,是否通过调控EMT的发生而改变胃癌的恶性生物学行为?我们下面的研究将致力于解决这些疑问。在本篇研究中,我们首先回顾性研究264例Ⅰ-Ⅲ期已行胃癌根治手术的患者资料,分析MACC1对胃癌根治术后复发的影响,及其表达与患者临床病理学参数之间的关系；其次,在体外细胞实验中研究MACC1表达水平改变对胃癌细胞侵和迁移能力的影响,并进一步探索其是否通过调控EMT发生而影响胃癌的恶性生物学行为。研究方法1.检测Ⅰ-Ⅲ期行胃癌根治性切除手术患者的癌组织标本中MACC1蛋白的表达情况,并分析其临床意义。收集2004至2008年在南方医院行胃癌根治性切除手术的患者共264例,所有患者均经病理诊断为胃癌,并达到R0切除。根据2010年第7版AJCC胃癌分期标准进行分期。随访患者从手术到肿瘤复发的时间,随访截止时间为2011年3月。取患者手术癌组织标本进行石蜡包埋,将癌组织石蜡块制成4mm厚的石蜡切片,用免疫组织化学的实验方法检测MACC1蛋白表达,根据染色范围和染色深浅进行评分,结合患者的临床病理学特征,统计分析MACC1表达高低是否与胃癌患者术后复发及复发时间长短有所关联。这种关联是否受年龄、性别、分期等影响。2.构建MACC1过表达及沉默稳转人胃癌细胞株根据MACC1基因序列,设计扩增或干扰MACC1表达的质粒,将质粒转染逆转录病毒,感染BGC-823、MKN-28人胃癌细胞株,构建MACC1过表达细胞(MACC1),对照空载细胞(vector), MACC1沉默细胞(shMACC1),对照无关序列细胞(scramble)。采用荧光实时定量(Real-time, RT) PCR和Western blot方法检测细胞株中MACC1的mRNA及蛋白含量,鉴定是否成功构建MACC1过表达及沉默的稳转细胞株。3.检测MACC1表达改变对胃癌细胞株侵袭和迁移的影响。采用Transwell实验方法比较MACC1不同表达水平的稳转细胞之间侵袭能力的差异,采用划痕实验比较迁移能力的差异。4.检测MACC1表达水平改变对EMT相关基因表达的调控。采用RT-PCR和Western blot实验方法检测MACC1不同表达水平的稳转细胞EMT相关基因的表达情况,包括E-钙粘蛋白、α-连环蛋白、纤连蛋白、MMP2、 MMP9、波形蛋白、CD44基因的mRNA和蛋白含量。5.统计学方法所以结果都应用SPSS16.0软件进行统计学处理。MACC1蛋白表达与胃癌患者术后无疾病进展生存(Disease free survival,DFS)时间关系用Kaplan-Meier法,MACC1蛋白表达与临床病理学参数(性别、年龄、肿瘤分期、患者复发状态)之间的关系用x2检验。风险比(Hazard ratio, HR)用Cox模型计算。PCR及Western blot结果采用Student's-T检验。所有P值<0.05被认为有统计学差异。研究结果1. MACC1在胃癌患者癌组织中的表达(1)在264例胃癌患者中,75.4%的患者癌组织MACC1表达阳性,24.6%表达阴性。(2) MACC1表达与患者性别(P=0.266)、年龄(P=0.446)无关,与临床分期相关。在Ⅰ期患者中,MACC1表达阳性率为62.8%,但Ⅱ-Ⅲ期患者中阳性率达77.8%,两者间的差异有统计学意义(P=0.036)。(3) MACC1与胃癌患者术后复发相关,其中在发生复发的患者中,84.2%的患者MACC1表达阳性,在未发生复发的患者中,MACC1表达阳性占60.6%,P<0.001,有统计学差异。(4) MACC1表达阳性胃癌患者术后DFS明显短于表达阴性患者,尤其在Ⅱ-Ⅲ期的患者中,MACC1是影响胃癌DFS的独立因素。2. MACC1促进胃癌细胞的侵袭和迁移与对照组相比,MACC1过表达组细胞通过Transwell小室的细胞数量更多,MACC1沉默组细胞通过Transwell小室的细胞数量则较少,表明MACC1表达量越高,胃癌细胞侵袭能力越强。在划痕实验中,MACC1过表达组细胞向划痕边缘爬行速度最快,划痕宽度明显变窄,而MACC1沉默组细胞向划痕边缘爬行速度最慢,残留的划痕宽度最宽,表明MACC1表达越高,胃癌细胞迁移能力越强。3. MACC1可调控EMT相关基因的表达与对照组相比,MACC1过表达组细胞上皮细胞标志E-钙粘蛋白、α-连环蛋白mRNA和蛋白含量较低,间叶转化相关的纤连蛋白、波形蛋白、MMP2、MMP9、 CD44的mRNA和蛋白含量明显升高；MACC1沉默组细胞的结果则与之相反,统计分析P值均<0.05,具有统计学差异。研究结论1.MACC1与胃癌根治术后患者分期及复发相关,可促进胃癌术后复发,缩短复发时间,是胃癌术后复发的独立危险因素。2.MACC1可促进胃癌细胞的侵袭和迁移。3.MACC1可能是通过调控EMT的发生而影响胃癌的恶性生物学行为。
杨冰[8]2017年在《MicroRNA-21表达与前列腺癌临床病理特征及预后相关性的临床和机制研究》文中进行了进一步梳理研究背景及意义前列腺癌是威胁男性健康的常见恶性肿瘤之一。早期前列腺特异性抗原(Prostate specific antigen,PSA)筛查存在一定的假阴性和假阳性,因此寻找更合适的前列腺癌筛查指标具有重要意义。核糖核酸(Ribonucleic acid,RNA)型生物标志物具有检测方便、准确性高、在血液循环中稳定存在等诸多优势,是十分有潜力的生物标志物。微小RNA-21(microRNA-21,miR-21)可通过调节下游靶基因,促进细胞增殖、侵袭和迁移等机制,影响包括前列腺癌在内的多种恶性肿瘤。现有研究主要集中在前列腺肿瘤组织中的miR-21表达情况。由于在临床中需通过侵袭性操作获得前列腺组织活检样本来测定miR-21表达,程序复杂,易对患者造成伤害且较难获得连续性的动态监测数据,因此需要一种更加敏感特异,能够预测前列腺癌进展,并且易于获得样本进行连续性检测的生物标志物。近期大量的研究证实,外周血循环中的miRNA异常表达有肿瘤相关特异性和高度的敏感性,因此miRNA可能成为一种潜在的生物标记物。前列腺癌早期症状隐匿,晚期可发生远处转移尤其是骨转移。因此,研究前列腺癌转移机制,寻找潜在的治疗靶点,对于抑制前列腺癌,减少前列腺癌相关死亡具有重要意义。miRNA在前列腺癌发生和转移中的作用和机制是目前研究的焦点之一,已有研究证实miR-21与前列腺癌进展具有相关性,可能在前列腺癌的发生、转移中发挥重要作用。虽然前列腺癌的诊治已经有了许多新进展,但是目前对于前列腺癌转移机制仍不明确。本研究分为两部分。第一部分,首先观察外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC)miR-21在前列腺癌患者的表达情况,然后探讨其表达程度与前列腺癌临床病理特征的相关性,最后分析PBMC中miR-21的表达与前列腺癌诊断及术后生化复发的关系。第二部分研究miR-21下调与前列腺癌细胞的增殖、侵袭和迁移的相关性,同时观察和分析与肿瘤细胞增殖和迁移相关蛋白的表达变化情况,以进一步探讨miR-21表达与前列腺癌进展的关系。第一部分研究目的:研究PBMC中miR-21的表达与前列腺癌Gleason评分、PSA水平、TNM分期等临床病理特征的相关性,及其与前列腺癌诊断和术后生化复发的关系,探讨miR-21成为前列腺癌诊断和预测的生物标志物的可能性。研究方法:利用实时定量聚合酶链式反应技术(Quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)检测92例前列腺癌患者、85例良性前列腺增生(Benign prostatic hyperplasia,BPH)患者及97例健康对照的PBMC中miR-21的表达情况,统计分析PBMC中miR-21的相对表达量与年龄、Gleason评分、PSA水平、TNM分期、前列腺癌危险因素分级的相关性,ROC曲线分析miR-21对前列腺癌的诊断价值,Kaplan-Meier方法及log-rank检验对根治性前列腺切除术后患者无生化复发生存率进行分析,同时利用Cox风险回归模型分析生化复发的影响因素及相对危险度。研究结果:qRT-PCR结果显示,前列腺癌患者PBMC中miR-21相对表达量(2.61±0.88),较 BPH 患者(1.34±0.50)和对照组(1.24±0.47)显着增高(P<0.001)。在92例前列腺癌患者中,Gleason评分≤7分和Gleason评分>7分的两组患者PBMC 中 miR-21 相对表达量分别为 2.38±0.82 和 2.76±0.88(P<0.05)。在 T1、T2、T3、T4各期患者中,PBMC中miR-21相对表达量分别为2.28±0.83、2.44±0.50、2.74±1.12 和 3.62±0.64(F=7.249,P<0.001)。区域淋巴结转移(N1)患者PBMC中miR-21的相对表达量高于无区域淋巴结转移(N0)患者(2.94±0.98 VS2.41±0.75,P<0.01)。远处转移(M1)患者PBMC中miR-21相对表达量高于无远处转移(M0)患者(4.30±0.83VS2.45±0.69,P<0.001)。此外,PBMC中miR-21在低、中、高危前列腺癌患者中的相对表达量分别为1.74±0.41、2.51±0.86 和 2.89±0.81(F=15.192,P<0.001)。不同年龄段和不同血清 PSA 水平患者PBMC中miR-21相对表达量无明显差异(P>0.05)。根据所有前列腺癌患者和BPH患者PBMC中miR-21表达水平绘制ROC曲线,曲线下面积(Area under the curve,AUC)为0.917,敏感度和特异度分别为84.8%和83.5%,临界值(Cut-off值)1.838。根据所有前列腺癌患者和健康对照组PBMC中miR-21表达水平绘制ROC曲线,AUC为0.938,敏感度和特异度分别为87.0%和86.6%,Cut-off值1.755。对于PSA≤1Ong/ml的前列腺癌患者和BPH患者,根据PBMC中miR-21表达水平绘制ROC曲线,AUC为0.862,敏感度和特异度分别为76.9%和74.7%,Cut-off值1.728;根据PSA水平绘制ROC曲线,AUC为0.868,敏感度和特异度分别为76.9%和75.9%,Cut-off值4.750;联合miR-21和PSA两种检测结果,并根据logistic回归方程计算出的联合预测因子绘制ROC曲线,AUC为0.946,敏感度和特异度分别为92.3%和86.7%,Cut-off值2.793。Kaplan-Meier生存曲线显示,miR-21相对低表达组的1年、3年、5年无生化复发生存率分别为100%、92.4%和65.7%,miR-21相对高表达组的1年、3年、5年无生化复发生存率分别为92.9%、39.0%和20.8%,两组经log-rank检验P<0.001。Cox风险回归模型显示,PBMC中的miR-21表达水平、Gleason评分和临床T分期是影响患者术后生化复发的危险因素,其相对危险度Exp(B)分别为 3.940(P=0.006)、5.645(P=0.008)和 3.618(P=0.016)。研究结论:miR-21在前列腺癌患者PBMC中表达增高,其表达异常程度与Gleason评分、肿瘤TNM分期和前列腺癌危险因素分级具有相关性。PBMC中miR-21的异常表达对前列腺癌具有较高的诊断价值,联合PSA检测可提高对PSA≤10ng/ml患者前列腺癌诊断的敏感性和特异性。PBMC中miR-21表达增高,前列腺癌根治术后患者生化复发风险增高,是影响术后生化复发的因素之一。综上所述,PBMC中miR-21与前列腺癌的临床病理及术后生化复发具有明确相关性,可能成为前列腺癌诊断和预测术后生化复发的潜在生物标志物。第二部分研究目的:观察miR-21表达下调对前列腺癌细胞增殖、侵袭和迁移的影响,并探讨miR-21低表达对非受体蛋白酪氨酸磷酸酶14(Tyrosine protein phosphatase non-receptor 14,PTPN14)、同源性磷酸酶-张力蛋白(Phosphatase and tensin homolog,PTEN)、基质金属蛋白酶 2(Matrix metalloprotease2,MMP2)和基质金属蛋白酶9(Matrix metalloprotease9,MMP9)表达的影响,探索前列腺癌治疗的潜在靶点。研究方法:首先采用qRT-PCR方法检测了正常前列腺上皮细胞系PrEC及前列腺癌细胞系LNCap、PC3、DU145中miR-21的表达情况,然后利用RNA干扰(RNAinterfereing,RNAi)技术制备 miR-21 低表达的 DU145-AMO 细胞,同时以DU145-SCR为阴性对照,DU145为空白对照,进行噻唑蓝比色分析细胞增殖,Tanswell小室侵袭实验对肿瘤细胞的侵袭能力进行观察、划痕实验对细胞迁移能力进行验证,同时采用Western Blot蛋白检测方法对PTPN14、PTEN、MMP2和MMP9的表达情况进行观察。研究结果:前列腺癌细胞系LNCap、PC3、DU145中miR-21的相对表达量,均显着高于正常前列腺上皮细胞PrEC(P均<0.05)。噻唑蓝比色分析显示,低表达miR-21的DU145-AMO细胞,生长曲线OD值显着低于对照组的DU145细胞,生长速度减慢(P<0.05)。Tanswell小室侵袭实验显示滤膜下室面DU145-AMO细胞数量少于DU145和DU145-SCR组的细胞数(均P<0.01)。细胞划痕实验显示划痕中央迁移的DU145-AMO组的细胞数少于DU145-SCR组的细胞数(PP<0.05)。Western Blot结果显示敲低miR-21表达的DU145-AMO细胞中,PTPN14和PTEN的表达量较DU145分别增高78%(P<0.01)和98%(P<0.001),较 DU145-SCR 分别增高 79%和 57%(P均<0.01),而 MMP2、MMP9表达较DU145分别下降71%和61%(P均<0.001),较DU145-SCR分别下降 70%和 64%(P 均<0.001)。研究结论:miR-21在前列腺癌细胞中高表达,下调miR-21的表达可抑制前列腺癌细胞DU145的体外增殖、侵袭和迁移,这种抑制作用可能是通过上调PTPN14和PTEN表达,以及下调MMP2和MMP9表达实现的。因此miR-21可能成为前列腺癌治疗的潜在靶点。本课题研究结论前列腺癌患者PBMC中miR-21表达显着增高,其异常表达程度与Gleason评分、肿瘤TNM分期和前列腺癌危险因素分级具有相关性。PBMC中miR-21的异常表达对前列腺癌有较高的诊断价值,联合PSA化验可提高对PSA≤10ng/ml患者前列腺癌诊断的敏感性和特异性。PBMC中miR-21表达增高,前列腺癌根治术后患者生化复发风险增高,是影响术后生化复发的因素之一。miR-21在前列腺癌细胞中高表达,下调miR-21的表达可抑制前列腺癌细胞DU145的体外增殖、侵袭和迁移,这种抑制作用可能是通过.上调PTPN14和PTEN表达,以及'下调MMP2和MMP9表达实现的。综上所述,miR-21与前列腺临癌临床病理特征及前列腺癌细胞的增殖、侵袭和迁移具有相关性。希望今后通过大样本的研究,进一步探讨miR-21在前列腺癌诊断、预测预后及治疗中的作用。
唐南洪[9]2008年在《蛇毒半胱氨酸蛋白酶抑制剂联合蛇毒金属蛋白酶抑制剂抗肝癌细胞（MHCC97H）的侵袭转移作用》文中指出原发性肝癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一,病死率高,复发转移是影响预后的最主要因素。肝癌细胞的侵袭转移能力与其产生降解细胞外基质(ECM)的蛋白水解酶能力密切相关。目前针对ECM相关蛋白酶的生物治疗已经成为肝癌治疗研究的热点,其中蛇毒活性成分的药用价值更是不断得到认可。我们前期克隆了蛇毒半胱氨酸蛋白酶抑制剂(sv-Cystatin)和蛇毒金属蛋白酶抑制剂(BJ46a)基因,初步证明其各自具有抑制小鼠黑色素瘤细胞B16的侵袭转移功能。鉴于sv-Cystatin和BJ46a抑制肿瘤侵袭转移作用的靶点不同,我们设想二者联合表达存在协同作用的可能。为此,我们应用双基因真核表达载体将sv-Cystatin和BJ46a同时导入人的高转移肝癌细胞株MHCC97H,通过体外和动物在体实验研究各自的抗肝癌侵袭转移作用、协同作用和存在的新功能,探讨两种基因的表达对肝癌细胞影响的可能分子机制,并利用重组sv-Cystatin与BJ46a腺病毒观察体内应用的初步治疗效果。一、表达sv-Cystatin或/和BJ46a基因的MHCC97H细胞株的建立利用分子克隆技术构建了重组表真核达载体pBudCE4.1/sv-Cystatin、pBudCE4.1/BJ46a和pBudCE4.1/sv-Cystatin+Bj46a;经Western Blot证实建立的细胞株MHCC97H/sv-Cystatin、MHCC97H/BJ46a和MHCC97H/sv-Cystatin+Bj46a可以分别稳定表达sv-Cystatin、BJ46a和同时表达sv-Cystatin和BJ46a,为后续研究提供了实验材料。二、sv-Cystatin或/和BJ46a表达对MHCC97H细胞生长、侵袭转移功能的影响体外细胞活力和裸鼠皮下肝癌细胞原位瘤重分析表明,表达sv-Cystatin能显着地抑制MHCC97H细胞的体外、体内增殖能力,但sv-Cystatin和BJ46a共同表达时没有协同作用。细胞培养中发现表达sv-Cystatin可以使MHCC97H细胞具有聚集成团倾向,细胞间连接更为紧密,并具有抑制MHCC97H细胞体外趋化的作用。利用Transwell--Matrigel实验和裸鼠皮下肝癌细胞肺转移模型证实表达sv-Cystatin和BJ46a具有各自抑制MHCC97H细胞体外、体内侵袭转移的作用,共表达时具有协同作用。叁、sv-Cystatin或/和BJ46a表达对MHCC97H细胞生长、侵袭转移影响的分子机制流式细胞检测、电镜观察和TUNEL实验证实诱导凋亡是表达sv-Cystatin的MHCC97H细胞生长增殖能力降低的原因,其可能的机制为sv-Cystatin的表达下调Twist表达,降低Twist所介导的抑制P53分子通路的保护细胞作用,直接导致促凋亡作用的P53表达升高及其靶分子Bax的上调,启动凋亡线粒体通路级联反应。BJ46a不具有此功能,故sv-Cystatin和BJ46a共表达时没有体现诱导凋亡的协同作用。细胞培养上清通过荧光分光光度检测Cathepsin B、明胶酶谱分析MMPs,培养细胞通过凝胶迁移分析转录因子Twist活性及其相关的E-cadherin和N-cadherin表达等证明:(1)MMP2和MMP9的活性的下降是表达BJ46a的MHCC97H细胞侵袭能力减弱的直接原因;(2)CathepsinB、MMP2和MMP9活性的同时下降,Twist活性减弱导致的E-cadherin表达上调和N-cadherin表达下调共同促成了表达sv-Cystatin的MHCC97H细胞侵袭能力的抑制;(3)以上二者因素的协同作用导致同时表达sv-Cystatin和BJ46a的MHCC97H细胞的侵袭能力最弱。四、重组sv-Cystatin和BJ46a腺病毒治疗转移性肝癌的实验研究利用腺病毒载体pShuttle-IRES-hrGFP-1构建了携带sv-Cystatin和BJ46a基因的重组腺病毒。通过裸鼠皮下肝癌细胞肺转移模型的瘤内注射治疗实验证实Ad/sv-Cystatin可以降低MHCC97H细胞的肺转移率30.4%,而联合注射Ad/sv-Cystatin和Ad/BJ46a可降低28%,未见协同作用;瘤内注射Ad/sv-Cystatin在一定程度上具有抑制MHCC97H细胞生长的作用。
周森君[10]2017年在《NEDD9促进肝细胞肝癌侵袭转移的作用研究DIXDC1在肝细胞肝癌中的表达及其与预后的相关性》文中研究指明目的肝细胞肝癌是目前全球主要的恶性肿瘤之一,尽管目前肝癌的诊断及治疗手段的进步已使更多患者获得了延长生命的机会,但是肝癌术后的复发转移仍严重影响着患者的预后。NEDD9是一种与实体肿瘤转移密切相关的细胞内支架蛋白。最近研究发现NEDD9在肝细胞肝癌标本中表达上调,但NEDD9在肝细胞肝癌中的具体作用仍未阐明。因而我们通过体内外实验,探索NEDD9在肝细胞肝癌侵袭转移方面的具体作用以及可能的潜在机制。方法在肝癌细胞株以及140对肝细胞肝癌标本中,采用qPCR、Western blot以及免疫组化等多种方式检测NEDD9的表达情况,并结合患者临床病理资料分析NEDD9与患者临床特征以及预后的相关性。分组分析非侵袭性肝癌以及侵袭性肝癌中NEDD9的表达差异。构建NEDD9敲减以及过表达细胞株,通过MTS细胞增殖实验Transwell细胞迁移及侵袭实验以及裸鼠体内脾脏注射-肝转移模型,观察NEDD9对肿瘤增殖、侵袭、转移能力的影响。运用qPCR、Western blot、免疫荧光、免疫组化等多种方法初步探究NEDD9在促进肝细胞肝癌侵袭转移方面的潜在机制。结果qPCR以及Western blot检测发现NEDD9在肝癌细胞株中的表达较正常肝细胞株中表达上调。140对肝细胞肝癌标本通过免疫组化检测发现NEDD9在肝细胞肝癌中表达升高,且与患者的血清AFP浓度(p=0.008)、肿瘤癌栓(p=0.005)和肿瘤TNM病理分期(p=0.014)有明显相关性。根据肝癌患者是否合并肿瘤癌栓将患者分成非侵袭性肝癌组以及侵袭性肝癌组,发现两组之间NEDD9表达存在差异。结合肝癌患者的随访数据,采用Kaplan-Meier生存分析发现NEDD9高表达者较低表达者有更短的无瘤生存期和总生存期,COX多因素回归分析提示NEDD9是肝癌术后复发的独立危险因素。成功构建NEDD9过表达慢病毒质粒,并在肝癌细胞株HCC-LM3和Huh7中成功构建NEDD9敲减以及过表达细胞株。MTS细胞增殖实验提示NEDD9敲减能明显抑制肝癌细胞的生长。Transwell细胞迁移及侵袭实验提示,NEDD9敲减能明显抑制肝癌细胞的迁移及侵袭能力,NEDD9过表达能增强肝癌细胞株的迁移及侵袭能力。裸鼠体内脾脏注射-肝转移模型发现,NEDD9过表达组裸鼠较对照组在肝脏表面形成更多的转移结节。机制方面,我们发现在肝癌细胞以及肝癌组织中,NEDD9能反向调控E-cadherin的表达,FAK参与了 NEDD9对E-cadherin表达的调控。结论NEDD9在肝癌细胞株及肝癌组织中均表达上调。NEDD9与肝癌临床的侵袭转移特性有一定的相关性。NEDD9能明显增强肝癌细胞的侵袭及转移能力。NEDD9能反向调控肝癌中E-cadherin的表达,可能是NEDD9促进肝癌侵袭转移的潜在机制。目的肝细胞肝癌术后复发严重影响着肝癌患者的预后,肿瘤标记物作为一种从分子生物学角度参与评估肿瘤患者预后的新方法也具有潜在的重要意义。DIXDC1是一种含有DIX结构域的支架蛋白,作为Wnt信号通路的正向调控因子参与神经系统的发育。尽管DIXDC1已经在某些恶性肿瘤中进行了研究,但是目前在肝细胞肝癌中尚无任何的相关报道,因而我们本次研究目的主要是探究DIXDC1在肝癌中的表达及其临床意义。方法通过生物信息学的方法从Oncomine数据库中检索关于DIXDC1在肝细胞肝癌中表达情况的数据。采用qPCR、Western blot等方法检测25对新鲜肝细胞肝癌标本中DIXDC1的表达情况。进一步在140对肝细胞肝癌标本中,通过免疫组化的方法评估DIXDC1的表达,并结合患者临床病理资料分析DIXDC1与患者临床病理特征以及预后的相关性。结果Oncomine数据库中叁个独立的检测数据提示,肝细胞肝癌中DIXDC1的mRNA表达水平较正常肝组织表达下调。在25对新鲜肝细胞肝癌组织中,通过qPCR以及Western blot检测发现DIXDC1在大部分肝癌组织中表达下降。在140对肝细胞肝癌标本中,通过免疫组化评估发现DIXDC1在肝细胞肝癌中低表达,且与肿瘤大小(p=0.024)、肿瘤细胞分化程度(p<0.001)、肿瘤癌栓(p=0.019)、肿瘤TNM病理分期(p=0.019)及肝癌巴塞罗那临床分期(p=0.008)等患者疾病进展相关指标有密切关系。更重要的是,Kaplan-Meier生存分析发现DIXDC1低表达患者较高表达者有更短的无瘤生存期和总生存期,COX多因素回归分析提示DIXDC1是肝癌患者总生存期的独立预后因子。结论我们首次揭示DIXDC1在肝细胞肝癌中表达下调。低表达DIXDC1与患者的临床疾病进展状况以及较差的预后有明显相关性。DIXDC1可作为一个新的肿瘤标记物来预测肝细胞肝癌患者术后的临床转归情况。
参考文献：
[1]. 番木瓜种子提取物异硫氰酸苄酯对肝癌细胞恶性行为的影响及其作用机制[D]. 朱明月. 海南大学. 2015
[2]. SPOCK1对人神经胶质瘤细胞的作用及其分子机制的体外实验研究[D]. 于杉. 吉林大学. 2016
[3]. 基质金属蛋白酶MMP-2和MMP-9的基因表达与肝癌侵袭和转移的关系[D]. 张红东. 浙江大学. 2001
[4]. 放疗联合介入栓塞对VX2兔肝肿瘤MMPs和VEGF表达的影响[D]. 卢奕宇. 南方医科大学. 2016
[5]. Ezrin在肝细胞癌侵袭转移中的作用及吴茱萸碱对人肝癌细胞株HepG2 Ezrin生物学行为的影响[D]. 周琳. 中南大学. 2013
[6]. MMP9、CD147与宫颈鳞状细胞癌生物学行为关系的研究[D]. 宋恩霖. 南昌大学. 2007
[7]. MACC1基因在胃癌术后复发中的临床意义及其可能机制探索[D]. 武雅君. 南方医科大学. 2013
[8]. MicroRNA-21表达与前列腺癌临床病理特征及预后相关性的临床和机制研究[D]. 杨冰. 山东大学. 2017
[9]. 蛇毒半胱氨酸蛋白酶抑制剂联合蛇毒金属蛋白酶抑制剂抗肝癌细胞（MHCC97H）的侵袭转移作用[D]. 唐南洪. 福建医科大学. 2008
[10]. NEDD9促进肝细胞肝癌侵袭转移的作用研究DIXDC1在肝细胞肝癌中的表达及其与预后的相关性[D]. 周森君. 浙江大学. 2017
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