刘苏[1]2002年在《胃癌细胞蛋白转运和细胞凋亡诱导的相关性及其信号转导途径》文中研究指明蛋白激酶C(Protein Kinase C,PKC)是一族结构相似的丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶，在细胞增殖、分化、凋亡、基因表达、膜转运和信号转导等过程中起着重要的调节作用。到目前为止，在哺乳动物中已发现了至少11个PKC家族成员，它们的基本结构相似，在不同的外界信号刺激下，不同细胞中的各种PKC家族成员在细胞凋亡诱导中发挥了不同的作用。早期认为，PKCα是具有抗凋亡作用的生存因子，它可以抑制HL-60细胞、唾液腺上皮细胞、32D骨髓母细胞、成胶质细胞瘤U87和A172等细胞的凋亡。然而，随着研究的深入，在其它一些细胞，如LNCaP和唾液腺泡细胞中，都发现PKCα扮演了完全相反的角色——诱导细胞凋亡。 本论文致力于研究胃癌细胞中PKC的转运和细胞凋亡诱导的关系。TPA诱导的胃癌细胞凋亡不是通过上调PKC α,PKCβI，PKCζ或PKCλ的蛋白表达水平实现的，因为TPA不影响BGC-823中PKC α,PKCβI，PKCζ和PKCλ的蛋白表达水平。用免疫荧光法在激光共聚焦显微镜下观察发现，在对照组BGC-823细胞中，PKCβI和PKCλ定位在细胞核，PKCζ在胞浆中丰富表达，PKCα定位于胃癌细胞线粒体及其周围胞浆。TPA不能诱导PKCβI，PKCλ和PKCζ在细胞中转运。但能诱导PKCα由线粒体和胞浆逐渐向细胞核转运，TPA处理48h，PKCα完全进入细胞核。这一诱导过程和TPA诱导的胃癌细胞凋亡密切相关，因为当用PKC抑制剂wort。或P.I.P阻断PKCα在细胞中的转运时，TPA诱导细胞凋亡率分别降低至7.1％和6.4％，接近对照组水平。TPA诱导BGC—823细胞的Bcl-2和BCL-XL表达下调，Bax、Caspase3和Caspase9表达上调，更重要的是这些蛋白表达水 刘苏硕士论文 摘要02－06－22 在细胞中的转运。这些结果都表明，TPA诱导的Nur77 mRNA表达和转运受％C信 号途径调控，并且它可能在Nur77参与的细胞凋亡的调节中扮演了重要角色。 本论文的创新点： 1 我们不仅首次在胃癌细胞中观察到PKC a定位于线粒体中；并能在 TPAd诱导下向细胞核转运，并且揭示了 PKC a的转运和TPA诱导的细胞凋亡之 问的联系。这将为深入了解细胞凋亡的机制提供新的思路。 2，在本论文中，我们还研究了核孤生受体Nur77和1‘肚信号途径问的联 系，并成功地证实了VA诱导的Nur77 mRNA表达和转运受队C信号途径调控。 这一发现在世界上也尚属首次。 刘苏硕士论文 摘要02－06、22 平的变化与 PKC a转运有关，一旦 PKC a转运被抑制，TPA就不能诱导这些蛋白表 达水平。这些结果说明，PKC a脱离线粒体和胞浆进入细胞核对于细胞凋亡诱导 可能有着机制上的内在关联。 Nur77（也称m3）是一个由立早基因 NR4AI编码的核孤生受体。Nur7？既能 以单体形式结合到其DNA识别元件NBRE上，还可以自身形成同源二聚体或与其 他Nu r 7 7家族成员形成异源＝聚体而结合到其另一识别位点NurRE，Nur77还可 以与视黄酸互受体＊etinoid X receptor，RXR）形成异源＝聚体，并结合在视黄 酸结合兀件 RARE（retionic acid response element）上．而发挥转录活性。 Nu r 7 7 的转录活性受到自身转录表达和翻译后修饰的水平上多个层次的调节。 Nu r 7 7在细胞的生长、分化、细胞凋亡等众多生理过程都发挥了重要的调节作 用。它参与了肺癌细胞、B细胞、前列腺癌细胞、T细胞杂交瘤和T淋巴细胞等 许多细胞细胞凋亡的调节。长期以来，Nur77参与的对细胞凋亡的诱导都被认为 与其转录活性激活有关。 本论文证实，TPA诱导的胃癌细胞凋亡与的mRNA表达和l转运有关，而与其转 录活性的激活无关。在饥C－823细胞中，TPA能够上调Nur77mRNA的表达水平， 并诱导Nur刀蛋白由细胞核向线粒体转运，由此引发线粒体上细胞色素c的释 放。但 TPA不能激活 Nur77的转录活性，我们用 CAT ass。沙检测发现，当含有 Nu r 7 7结合位点的CAT报告基因瞬时转染BGC－823细胞后，再用TPA处理，Nur77 的转录活性不会发生改变。Nur？7 的mRNA表达对TPA的凋亡诱导是必须的，当 antisense Nur77表达载体转染到 BGC－823细胞后，Nur77表达被抑制，此时TPA 就不能诱导细胞凋亡。TPA诱导的胃癌细胞凋亡还和Nur7：’的转运密切相关。当 LMB抑制了Nur77的转运时，TPA诱导的细胞凋亡率降低至对照组水平。 而且，我们还证实TPA诱导的Nur？7mRNA表达和蛋白转运受到PKC信号途径 调控，PKC特异性抑制剂可以抑制 TPA诱导的 Nur77 mRNA表达和Nur刀蛋白转 运。首先，Wort和 P．I．P可以显着抑制 TPA上调 Nur77 mllNA表达水平。其次， 免疫荧光发和western blot的结果都显示 Wortmannin和 P．I．P可以阻断 Nur77
张鸣青[2]2009年在《肿瘤细胞中PKCs的表达及阿霉酮A对胃癌细胞的作用》文中研究指明肿瘤是一种基因疾病，其发生机理及抗肿瘤药物的研发是当前生命科学研究的热点。本文应用现代生物学技术，观察乳腺癌、胃癌组织中PKCs表达及与肿瘤分化程度的相关性，研究PKCαsiRNA和阿霉酮A在体内外对胃癌细胞BGC-823的作用，对探索肿瘤发生、发展的分子机理和开发抗肿瘤药物及新技术具有重要的学术意义和潜在的应用价值。首先，研究了蛋白激酶C(Protein Kinase C，PKC)和乳腺癌分化及转移的相关性。通过免疫组织化学方法检测48例乳腺癌病人手术标本PKC同功酶蛋白表达，发现PKCα和PKCβ与乳腺癌分化程度无显著相关性；PKCη与乳腺癌分化程度显著相关；PKCζ与乳腺癌分化程度极显著相关；通过HE染色显示的乳腺肿瘤组织与PKC免疫组化的结果进行对照，发现PKCη、PKCζ的表达量在大多数乳腺浸润性导管癌细胞中明显增多，且在乳腺肿瘤组织胞浆中的表达与肿瘤的分化程度高低呈正比关系，与肿瘤的恶性程度呈反比关系。其次，采用免疫组织化学卵白素生物素过氧化物酶连接法对80例胃癌标本蛋白激酶C同工酶，包括PKCα等蛋白的表达水平进行对比研究，探讨它们在胃癌中的表达水平与肿瘤分化程度的相关性。结果表明，在Ⅰ-Ⅱ型与Ⅲ型胃癌中，PKCα阳性率分别为67.5％与19.1％(P＜0.05)，在胃癌未转移的病例中，PKCs蛋白表达水平普遍较高，PKCα与肿瘤转移关系有极显著意义(P＜0.01)。此外，PKCs蛋白表达水平与肿瘤患者的年龄无关。接着，研究了PKCαsiRNA在体内外对人胃癌细胞BGC-823的作用。构建了表达PKCαsiRNA的载体，将之转染入人胃癌细胞BGC-823中，发现PKCαsiRNA特异性地抑制目的基因的表达和人胃癌细胞的增殖，与细胞增殖相关基因c-myc、PCNA表达也出现下调，提示了PKCα水平变化可影响肿瘤细胞的正常生长，且抑制肿瘤细胞中肿瘤生长相关基因的表达。PKCαsiRNA经阳离子脂质体Oligofectamine包裹，采用瘤内注射处理，经PKCαsiRNA处理后的细胞在裸鼠皮下形成移植瘤的时间延长，具有较高的肿瘤抑制率，但随着时间的延长，其抑瘤率又逐渐下降，与对照组的差别逐渐缩小，可能是导入细胞内的siRNA逐渐降解而失去活性，提示反义基因治疗需连续给药或加用其它治疗才能达到最佳效果。最后，研究了本实验室从海洋微生物分离获得的化合物阿霉酮A在体内外对胃癌细胞BGC-823的作用。结果表明，阿霉酮A在体外能抑制胃癌细胞BGC-823的生长，当浓度为10μg／mL时其抑制率为80％，且胃癌细胞BGC-823的凋亡率随着阿霉酮A浓度的增加而逐渐升高。将胃癌细胞BGC-823注射到裸鼠皮下诱发肿瘤(移植瘤)，通过腹腔注射阿霉酮A13mg／kg(2次／周，连续四周)，阿霉酮A可抑制裸鼠体内移植瘤的生长。进一步的研究表明，阿霉酮A能够诱导内源TR3核浆转运，该结果证实了本实验室早期工作的结果，阿霉酮A能够在体内和体外诱导TR3表达和核浆转运，从而抑制胃癌细胞恶性生长。
贾浩源[3]2017年在《hucMSC-exosome来源的14-3-3ζ活化自噬在预防顺铂毒中的作用及机制》文中研究说明目的:顺铂是一种常见的临床化疗药物,但肾毒性限制了其应用。课题组前期研究显示人脐带间质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hucMSC)来源的外泌体(exosome)(简称hucMSC-ex)在体内外模型中可以降低顺铂诱导的肾脏过氧化损伤及细胞凋亡,但hucMSC-ex预处理在顺铂诱导的肾损伤中的作用以及对顺铂抗肿瘤效果的影响研究甚少;本研究旨在揭示体内外模型中hucMSC-ex在顺铂诱导的肾毒性中的预防作用及机制,为肾损伤的预防提供新的策略。方法:(1)贴壁法分离培养hucMSC,并用试剂盒法提取exosomes,通过Nanosight纳米颗粒分析仪对exosome的大小及浓度进行检测分析;采用成像流式观察hucMSC-ex表面标记CD9和CD63的表达。(2)使用CM-Dil染料对hucMSC-ex染色后与NRK-52E细胞共孵育,超分辨显微镜观察NRK-52E细胞对hucMSC-ex的摄取。建立体外hucMSC-ex预防顺铂诱导肾小管上皮细胞(NRK-52E)损伤模型,分为3组:Control组,NRK-52E细胞不加任何处理;PBS组,与hucMSC-ex相同体积的PBS作用于NRK-52E细胞24h,顺铂损伤16h;hucMSC-ex组,hucMSC-ex作用于NRK-52E细胞24h后,顺铂处理16h。流式细胞仪Annexin V/PI双染法分析NRK-52E细胞的凋亡情况;Western blot方法分析bax、Cyclin D3蛋白的表达;免疫荧光技术检测核增殖抗原(PCNA)的表达情况。NRK-52E细胞转染mRFP-GFP-LC3双标腺病毒,超分辨显微镜观察不同组别中自噬小体的形成;免疫荧光技术及Western blot分析自噬相关蛋白LC3B的表达;Western blot检测14-3-3ζ蛋白的表达。构建体内hucMSC-ex预防顺铂诱导的SD大鼠急性肾损伤模型,分为3组:Control组,SD大鼠背部切开不加处理再缝合;PBS组,SD大鼠双侧肾脏肾被膜注射PBS 24h后腹腔注射顺铂作用3d;hucMSC-ex组,SD大鼠双侧肾脏肾被膜注射hucMSC-ex 24h后腹腔注射顺铂作用3d。每天收集血液样本,检测血清尿素氮(BUN)和肌酐(Crea)的水平。顺铂作用3d后将大鼠处死,留取肾组织。HE染色观察肾组织的损伤情况;免疫组织化学染色检测PCNA的表达;TUNEL染色分析肾小管上皮细胞的凋亡情况;westernblot检测大鼠肾组织凋亡相关蛋白bax的表达情况,综合评价hucmsc-ex对急性肾损伤的预防作用。westernblot分析大鼠肾组织lc3b的表达;免疫组织化学染色及westernblot检测肾组织中14-3-3ζ的表达。(3)体外顺铂作用于胃癌细胞之前,用hucmsc-ex预处理,通过流式细胞技术分析胃癌细胞的凋亡情况及细胞周期改变;transwell实验分析胃癌细胞的迁移能力;平板克隆形成实验检测胃癌细胞的增殖能力。(4)通过14-3-3ζ腺病毒过表达或慢病毒shrna干扰hucmsc中的14-3-3ζ并收集上清提取exosomes,分别为ad-gfp-ex、ad-14-3-3ζ-ex、shgfp-ex、sh14-3-3ζ-ex。荧光显微镜检测hucmsc细胞中绿色荧光强度;westernblot分析hucmsc及hucmsc-ex中14-3-3ζ的表达;超分辨显微镜观察nrk-52e细胞对ad-14-3-3ζ-ex(exosomes以cm-dil标记,14-3-3ζ蛋白表达gfp)的内化情况。分别用pbs、ad-gfp-ex、ad-14-3-3ζ-ex、shgfp-ex、sh14-3-3ζ-ex预处理nrk-52e细胞24h后顺铂损伤16h,超分辨显微镜观察细胞中自噬小体的形成情况;westernblot检测细胞中14-3-3ζ和lc3b的表达;免疫荧光技术观察细胞中pcna的表达;tunel或流式细胞术分析细胞的凋亡情况。在体内control组、pbs组、ad-gfp-ex组、ad-14-3-3ζ-ex组中,免疫组织化学技术检测肾组织中14-3-3ζ的表达;westernblot分析lc3b的表达;血清学检测bun、crea的水平;he染色观察肾组织的病理形态;tunel染色分析肾小管上皮细胞的凋亡情况;westernblot检测大鼠肾组织凋亡相关蛋白caspase3的表达情况;免疫组织化学染色检测pcna的表达。(5)通过免疫共沉淀技术和超分辨显微镜检测14-3-3ζ与自噬相关蛋白atg16l之间的相互作用。结果:(1)人脐带间质干细胞来源的exosome,nanosight分析发现其是直径为97nm左右的囊泡;成像流式检测发现hucmsc-ex表达cd9和cd63,阳性率约为80%。(2)hucmsc-ex预处理减少顺铂诱导的nrk-52e细胞凋亡数量,降低bax的表达,增加cyclind3和pcna的表达。在体内hucmsc-ex降低肾小管细胞tunel阳性细胞数量及bax的表达,增加pcna阳性细胞数。在体外hucmsc-ex预防模型中,发现hucMSC-ex可以被转运到靶细胞中。在NRK-52E细胞中hucMSC-ex预处理增加自噬小体的数量及LC3B蛋白的表达。在体内hucMSCex预处理具有相同的作用。(3)在顺铂处理的胃癌细胞模型中,hucMSC-ex预处理不会改变顺铂诱导的细胞凋亡及周期阻滞,胃癌细胞迁移和增殖能力与单独顺铂处理组相比无明显差异。(4)液相质谱分析(LC-MS/MS)发现hucMSC-ex携带14-3-3ζ蛋白,并且将其转运至NRK-52E细胞中。在体内外模型中hucMSC-ex预处理促进14-3-3ζ蛋白表达升高。HucMSC-ex中14-3-3ζ过表达明显增加NRK-52E细胞中自噬小体的形成和LC3B的表达,同时降低顺铂诱导的NRK-52E细胞凋亡并促进细胞增殖。在体内AD-14-3-3ζ-ex降低血清BUN、Crea的水平以及肾脏TUNEL阳性细胞数量。敲减hucMSC-ex中14-3-3ζ减弱自噬并加重顺铂诱导的NRK-52E细胞凋亡,抑制细胞增殖。(5)在体外模型中HucMSC-ex预处理促进NRK-52E细胞ATG16L蛋白的表达。超分辨显微镜结果显示14-3-3ζ促进ATG16L蛋白的表达和聚集。免疫共沉淀结果显示14-3-3ζ可以与ATG16L相互作用。结论:HucMSC-ex可以通过转运14-3-3ζ蛋白增强自噬从而预防顺铂诱导的急性肾损伤,同时不影响顺铂的抗肿瘤效果;14-3-3ζ与ATG16L相互作用,可以促进自噬小体的形成。本研究为预防顺铂诱导的急性肾损伤及扩展顺铂临床应用提供了新的思路和依据。
陈艳[4]2002年在《TPA/ATRA调控胃癌细胞周期的分子机制及其信号调控途径》文中进行了进一步梳理丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-acivated protein kinase,MAPK)是一种高度保守的丝氨酸／苏氨酸激酶，可被多种刺激因子活化，是细胞内的重要信号传递者。在哺乳动物细胞中，当前研究核心是叁条平行的MAPK途径：ERK(extracellular Signal-regulated kinase)途径、JNK(c-jun N-terminal kinase)途径和P38途径。在不同的外界因子刺激下，不同类型的细胞可能选择不同的信号途径，产生不同的生理应答。 佛波酯(12-o-tetradecanoyl-phorbol-13-acetate,TPA)是一种生长因子，与细胞生长，分化，凋亡及细胞周期停滞密切相关。TPA是蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)的激活剂，激活PKC后能够调控细胞生命活动。全反式视黄酸(all-trahs retinoic acid,ATRA)是一类维生素A衍生物，主要通过以下几个方面发挥作用：1 抑制细胞增殖；2 诱导细胞分化：3 诱导细胞凋亡；4 免疫调节；5 抑制血管形成；6 影响癌基因或抑癌基因的表达。在某些类型的肿瘤细胞中，TPA与ATRA之间可能存在协同作用，而在另一些类型的肿瘤细胞中，ATRA可以有效拮抗TPA的作用。 本文工作以胃癌细胞BGC-823为材料，运用分子细胞生物学手段，研究TPA／ATRA对胃癌细胞MAPK信号转导途径中一些激酶的调节作用，以及对细胞周期调控因子的调节作用。为进一步了解胃癌发生及发展的可能机制提供理论依据。 首先，用MTT法检测TPA／RA对BGC-823细胞生长的作用，发现TPA和ATRA均有效地抑制BGC-823细胞生长，且具有浓度依赖性，说明TPA从TRA在BGC-823的生长抑制中存在着协同作用。进一步检测TPA／ATRA对细胞周期分布的影响，发现大量细胞滞留在G0／G1期，共同处理时，阻断效应也相应增强，表明TPA／ATRA对胃癌细胞生长的抑制作用与细胞滞留在G0／G1期有关。为此，采用western blot法检测TPA／ATRA对一些重要的G1／S期调控蛋白表达水平的影响。结果表明：cyclinD1与CDK2稳定表达，不被调控；TPA／ATRA处理时，cyclinE和磷酸化的RB蛋白水平呈下调趋势，共同作用时，基本抑制 Cycl mE的表达，但对 pRb抑制的协同作用不明显；TPA以时间依赖方式上调P21wafl 和P53的蛋白表达，与ATRA共同处理时，上调趋势增强．表明TPA八TRA可以通过调节细胞周期调控分子的蛋白表达水平，抑制 cyclin｛DK激酶活性，使Rb蛋白去磷酸化，诱导细胞滞留在GO／GI期，从而抑制细胞的生长． 其次，我们前期研究结果发现，BGC1 2 3细胞经 TPA处理后发生凋亡，呈现典型的凋亡形态变化。本文进一步检测JNK蛋白表达，TPA处理后，JNK水平迅速上升，3h时达到最高峰，其后略有下降，但蛋白表达水平始终高于对于对照组．检测 c刁un mRNA的表达，观察到类似的现象．瞬时转染和 CAT a s s ay检测，观察到 TPA以剂量依赖的方式上调AP＜蛋白的转录活性．用PKC抑制剂wortamanin预处理细胞后，TPA诱导的JNK的蛋白表达量低于TPA单独处理组，细胞凋亡数量也同样远远低于TPA单独处理组，说明TPA通过PKC途径激活JNK。以上结果不仅证实TPA诱导的凋亡与通过PKC途径激活的州K相关，而且显示BGC亿n细胞中JNK途径对于TPA诱导的细胞凋亡是必需的． 通过检测 TPA八TRA作用下 P38和上游激酶Mc习的蛋白表达水平，发现PA以时间依赖的方式抑制两种激酶的蛋白表达水平，用特异性抑制剂SB2m190阻断P38途径，检测细胞周期调控分子P21wafl和CyclinE蛋白表达水平，观察到ATRA诱导的P21wafl蛋白表达水平下降，而CyclinE则呈现上调趋势，进一步证明P38途径在ATRA调节胃癌细胞周期调控因子的表达中具有重要的调节作用，从而引起细胞周期停滞，抑制胃癌细胞的生长． 最后，我们还检测了TPA八TRA对ERK途径的调节作用，观察到ERK的蛋白水平基本不变；TPA先是以时问依赖方式上调p卫RK，24h达到最高峰，随之下降，48h时蛋白表达水平则低于对照组。ATRA则抑制P－ERK蛋白的表达，TPA八TRA共同处理时抑制作用明显加强．同时 TP＾以时间依赖的方式诱导Ras蛋白，ATRA处理和TP＊从A处理时不能诱导Ms的表达．抑制剂PD98“9阻断矾K途径时，可以显着下调wA和ATRA诱导的P21wafl的表达．因此证明皿K途径参与TPVATRA对邵C－823细胞周期和细胞生长过程的调控． 综上所述，本论文工作表明，TPA一方面激活JNK途径，诱导转录因子AP刁的转录活性，启动一系列凋亡相关基因的表达；诱导细胞发生凋亡；另一方面通过ERK途径将生长抑制信号传递至细胞中，通过调控细胞周期相关因子的表达，使Rb蛋白去磷酸化而导致细胞滞留在GO／GI期，从而抑制胃癌细胞生长；ATRA则主要通过ERK和P38途径传递生长抑制信号，产生与TPA的抑制作用类似的效应来抑制胃癌细胞的恶性生长．
吴乔, 刘苏, 丁亮, 叶晓峰, 苏文金[5]2002年在《PKCα由线粒体向细胞核转运与胃癌细胞凋亡诱导密切相关》文中认为PKC在细胞生长、分化、凋亡和信号转导调节中具有重要作用.通过激光扫描共聚焦显微镜证实:在胃癌BGC-823细胞中,一部分PKCα定位于线粒体,一部分定位在胞浆,细胞经TPA处理后,位于线粒体和胞浆的PKCα向细胞核转运;Western blot检测则发现PKCα蛋白表达水平在TPA处理前后没有发生变化.此外,应用凋亡诱导剂和特异性PKC抑制剂的实验结果进一步证实:胃癌细胞内PKCα由线粒体和胞浆向细胞核转运与细胞凋亡的诱导密切相关.提示PKCα在细胞内的定向转运可能是与细胞凋亡过程相关联的重要事件之一.
孙力[6]2003年在《MGr1-Ag介导胃癌细胞多药耐药性的分子机制》文中认为胃癌是我国死亡人数最高的消化系统恶性肿瘤。化疗失败是导致手术后胃癌患者死亡的主要原因。这是因为肿瘤细胞具有原发性或继发性多药耐药(multidrug resistance, MDR)现象。已发现的耐药相关分子(诸如P-gp、MRP、LRP、BCRP、GST、PKC、TopoⅡ等)尚不能完全解释胃癌的MDR，提示胃癌细胞中存在着未知的耐药分子和耐药机制。MGrl-Ag是本研究所借助杂交瘤技术在胃癌长春新碱耐药细胞SGC7901／VCR上发现的耐药相关分子。先前的研究证实，MGrl单克隆抗体可部分逆转SGC7901／VCR细胞的多药耐药性。深入探讨MGrl-Ag的功能及其作用机制，将有助于全面理解胃癌MDR的发生和调节机制。 目的：了解MGrl-Ag在胃癌组织及正常胃组织中的表达分布和意义，观察MGrl-Ag在部分胃癌耐药及药敏细胞系中的表达水平，制备MGrl-Ag表达上调和下调的胃癌细胞亚系，探讨MGrl-Ag在胃癌MDR的发生和调节过程中的作用及其分子机制。 方法：1)利用组织芯片和免疫组化检测MGrl-Ag在胃癌组织及正常胃组织中的表达和分布。2)Western blot检测MGrl-Ag在部分胃癌耐药及药敏细胞系中的表达水平。3)通过RT-PCR从胃癌耐长春新碱细胞系SGC7901／VCR中扩增MGrl-Ag的编码cDNA，将PCR产物克隆入pUCm-T 第四军医大学硕士学位论文载体，经酶切鉴定并以测序证实。4）将MGr1Ag的编码CDNA亚克隆入pcDNA3．1，VS－His 载体构建MGrl人g 的真核表达载体pcDNA3二／MGrl－Ag，将MGrl＊g的编码cDNA反向亚克隆入pcDNA3．l／VS－His载体构建＊o1－＊ 的反义RN A表达载体pC＊＊＊3．1／Ch＊GC卜＊。5 ）借助脂质体将真核表达载体pcDNA3二／MGr1Ag转入MGC803细胞，将反义RNA表达载体转入SGC7901／VCR细胞，同时将空载体pCDNA3。l／VS－HIS转入MGC803细胞和SGC7901／VCR细胞作为对照细胞株。6）通过Westernblot检测MGrlAg在转染细胞中表达水平的改变。7）通过MTT法绘制转染细胞及其对照细胞的细胞生长曲线。8）通过流式细胞仪分析转染细胞其对照细胞的细胞周期，并计算细胞的增殖指数一roliferous index，PI人9）通过MTT试验进行体外药物敏感性分析，比较转染细胞及其对照细胞对阿霉素等8种化疗药物敏感性的差异并计算细胞对化疗药物的IC50值。10）借助流式细胞仪比较阿霉素在转染细胞及其对照细胞中蓄积和潞留的差异，并以Western blot检测药物转运相关蛋白卜gp和MRP在转染细胞及其对照细胞中表达水平的差异。11）借助 Annexin／PI染色对转染细胞及其对照细胞的细胞凋亡差异进行分析并计算细胞凋亡指数，以 Western blot检测凋亡相关蛋白Bcl－2和Bax在转染细胞及其对照细胞中表达水平的差异。 结果：I）免疫组化结果表明，在144例胃癌组织中，MGrl叭g阳性92例历3．89％人在 72例正常胃组织中，MGrl叭g阳性 52例枯0．56％人MGrlAg在胃癌组织及正常胃组织中的阳性表达率有显着差异p刀5入其中分化程度诊断明确的病例有68例，高分化腺癌阳性表达率为83．33％；中分化腺癌阳性表达率为62．50％；低分化腺癌组织阳性表达率为58．97％；其中morlag在高分化和低分化腺癌组织中的阳性表达率具有显着差异（＜0刀1X而在中分化和低分化腺癌组织中的 MGrl人g阳性表达率无显着差异p 0刀5＼在癌组织浸润胃壁全层的病例中MGrl叭g阳性表达率为 3 第四军医大学硕士学位论文82．35％；癌组织浸及浆膜层的阳性表达率为57，14％；癌组织浸及肌层的阳性表达率为47．83％；癌组织浸及粘膜下层的阳性表达率为25．00％，MGr IAg在不同浸润程度的胃癌组织中的阳性表达率有显着差异（功刀匀。2）Western blot结果显示，MGrl人g在胃癌耐长春新碱细胞系SGC7901／VCR和耐阿霉素细胞系SGC7901帆R的表达明显高于胃癌药敏细胞系SGC旭m、MGC803、AGS、W 5；而在胃癌药敏细胞系中以MGC803细胞系的MGrl叭g的表达为最低。3）通过RTPCR克隆了MGrlAg基因全长序列，并且测序证实无误。4）通过 Western blot证实，转染正义真核表达载体的细胞MGC803MGrl－Ag中MGrl－Ag的表达明显高于空载体转染细胞 MGC803／pCDNA3＊及其亲本细胞 MGC803；转染反义RNA表达载体的细胞SGC7901／VCR－antiMGrl叭g中MGr1Ag的表达明显低于空载体转染细胞SGC790lfVCR中CDNA3＊ 及其亲本细胞SGC7901／VCR。5）流式细胞仪检测结果显示，MGC803 ／M／M GrGrl－Ag细胞与对照细胞相比，细胞周期缩短，增殖加快；而SGC7901／VCR个CDNA3l细胞与对照细胞相比，细胞周期延长，增殖减慢。6）体外药物敏感性分析结果显示，与对照细胞相比，MGC803／MGri叭g细胞对阿霉素、丝裂霉素。环磷酚胺、顺铂、长春新碱，足叶乙贰的敏感性明显降低；而SGC7901／VCR－antiMGrlAg细胞对上述药物的敏感性明显升高。7）流式细胞仪检测细胞内阿霉素的蓄积和醋留显示，与对照细胞相比，MGC803肋GrlAg细胞内药物的蓄积和缩留明显减少，药物泵出率增大；
佚名[7]2004年在《肿瘤药理与化疗》文中研究说明5-氟尿嘧啶纳米微球抗肿瘤作用的实验研究姜文奇李苏王安训管忠震中山大学肿瘤防治中心内科目的:研究载5-氟尿嘧啶(5-Fluorouracil,5-Fu)的聚乙二醇.聚谷氨酸苄酯PEG-PBLG)纳米微球对口腔鳞癌及结肠癌的体内抗瘤作用。方法采用超透析法制备-FU/PEG-PBLG纳米胶束,透射电镜观察纳米微球的形态,应用5-FU/PEG-PBLG纳米微球治疗口腔鳞癌或结肠癌裸鼠移植瘤,观察移植瘤的生长状态及组织病理学改变。结果5-FU/PEG-PBLG纳米微球为核-壳型结构,大小约230 nm;于对照组比较,
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