易大为[1]2003年在《银杏树内生真菌代谢产物中活性成分的研究》文中指出内生真菌长期生活在植物组织内部，与宿主协同进化，在演化过程中二者形成了互惠共生的关系，在宿主的生长发育和系统演化过程中起重要作用。内生真菌可产生一些重要的治疗人类疾病的药物，对内生真菌次级代谢产物的研究，可以筛选得到一些结构新颖、活性专一的物质。本文以银杏树内生真菌(Endophytic fungus of Ginkgo biloba L., EG)为研究对象，通过对内生真菌胞内产物的研究，定向筛选银杏内酯产生菌。 首先，从原始菌种EG_3出发，在筛选过程中分离得到菌株G_(3-1)、G_(3a)、G_(3b)、G_(AR)、G_(AY)、F_(1-3)和F_3，其中菌株G_(3b)、G_(AR)、G_(AY)、F_(1-3)和F_3经菌种鉴定，被归属为半知菌亚门、丝孢纲、瘤座孢目、瘤座孢科、镰孢菌属(fusarium)。 应用高效液相色谱法和电喷雾质谱法以及液相质谱联用技术，以银杏内酯标准品为对照，对G_3系列菌株的胞内产物进行了筛选和检测。由检测结果初步认定，菌株G_(3b)和F_3的代谢产物中含有银杏内酯A、银杏内酯B和白果内酯。 在菌株F_(1-3)的发酵液中，检测到有抗革兰阳性菌的物质存在，通过对活性成分的追踪，分离得到化合物F1-3A和F1-3B。经过质谱、~1H谱、~(13)C谱以及二维核磁共振波谱的测定和解析，确定化合物F1-3A的分子结构为： cyclo[Hiv-Me-Val-Hiv-Me-Val-Hiv-Me-Val]；质谱、~1H谱及~(13)C谱的数据与环肽类抗生素Enniatin B的文献值基本一致，认定二者同质。经过质谱测定和解析，化合物F1-3B可能与Enniatin B_1或Enniatin D同质。
柏钰[2]2015年在《银杏内生真菌的分离鉴定及代谢产物抑菌活性研究》文中研究说明植物内生真菌是一种具有潜在研究价值的微生物资源,不仅能促进宿主植物体内次生代谢产物的转化与合成,而且内生真菌本身所产生化学结构特殊活性多样的次级代谢产物,成为寻找新型生物活性成分的重要新资源,突破了日益枯竭的植物资源稀缺的限制,具有极大的开发潜力和应用价值本文选择银杏(Ginkgo biloba)这一我国特有的植物资源,从其健康组织分离其内生真菌,初步评价其活性;利用分子生物学方法进行分类鉴定;并以活性示踪为导向,对高活性菌株的代谢产物中抗菌作用成分进行分离纯化。主要研究结果如下:1.采用组织培养法,结合表面消毒验证试验从健康的银杏组织中分离得到55株内生真菌,36株来自叶片组织;19株来自根组织。以苹果炭疽病原菌(Pezicula malicorticis)、苹果腐烂病原真菌(Valsa mali)、辣椒疫霉病原菌(Ph XTophthora capasici)、番茄枯萎病原真菌(Verticillium tricorpsis)、小麦赤霉病原真菌(Fusar ium graminearum)和梨黑星病原真菌(Venturia nashicola)六种植物病原真菌为作用对象,采用平板对峙试验评价内生真菌的抑菌活性,测定内生真菌对供试病原菌拮抗作用,结果显示33株内生真菌对至少一株供试植物病原真菌具有拮抗活性,表明银杏组织中含有丰富的抗菌活性内生真菌。菌株GBT07对5种供试病原真菌表现出强烈的拮抗作用。2.通过形态学初步鉴定排除相似菌株后,采用ITS r DNA序列分析了33株内生真菌的分类归属,结果显示它们分别属于9个属:刺盘孢属(Colletotrichum spp.)9株;黑孢霉属(Nigrospora spp.)7株;小丛壳属(Glomerella spp.)5株;拟茎点霉属(Phomopsis spp.)3株;球座菌属(Guignardia spp.)3株;叶点霉属(Phyllos ticta spp.)2株;镰孢属(Fusarium spp.)2株;炭团菌属(Hypoxylon spp.)和黑管菌属(Bjerkandera spp.)各1株。确定内生真菌GBT07为腐皮镰孢(Fusarium sola ni),命名为腐皮镰孢GBT07(Fusarium solani GBT07)。3.以菌体生物量、发酵液抑菌活性为指标,分析了不同的碳、氮源,以及温度、初始酸碱度的摇瓶发酵条件,初步确定了适合其扩大培养的生长条件。选用可溶性淀粉、硝酸钠作为碳、氮源,28℃,初始p H=7,以此作为扩大培养的初选条件,获得含抑菌活性成分较多的发酵液和一定数量的菌体。采用机械搅拌式发酵罐扩大培养菌株,分别在若干个时间点取样,测试相应时间发酵液的抗菌活性及菌体生物量,并与摇瓶发酵做相应的比较。罐发酵3d时每100m L发酵液中菌体生物量达到最大(1.65±0.052)g,4d时抗菌活性最高为(33.56±1.34)%;摇瓶发酵5d时每100m L发酵液中菌体生物量达到最大(0.82±0.035)g,7d时抗菌活性最高为(53.20±0.76)%。4.液体发酵培养GBT07菌株,得到的菌丝体采用乙酸乙酯提取;发酵液利用大孔吸附树脂HPD600富集,甲醇洗脱。抑菌试验结果表明,浓度200mg·L-1时,GBT07菌丝和发酵液浸膏对苹果腐烂和苹果炭疽等病原真菌菌丝生长有着良好的抑制作用。以活性追踪为导向,选取苹果炭疽为指示菌株,采用硅胶柱层析法,菌丝浸膏经由2次柱层析,在乙酸乙酯:甲醇(v:v=20:1)部位分离得到的组分Fr2-9,对苹果炭疽病原菌的抑制作用十分明显,72h浓度20mg·L-1对苹果炭疽抑制率为(86.93±1.37)%,EC50值2.57mg·L-1,较之浸膏活性有了大幅提高;发酵液浸膏经由2次柱层析,在由叁氯甲烷:甲醇(v:v=30:1)部位分离得到组分Fr2-8,对苹果炭疽病原菌抑制作用强烈,72h浓度20mg·L-1对苹果炭疽的抑制率为(78.50±0.97)%,较之浸膏活性有了大幅提高。抗菌活性化合物在Fr2-9和Fr2-8两个组分中较为集中,推测很可能是同一种化合物。经p-HPLC分离纯化出一种已知化合物—β-腺苷(β-Adenosine)7mg,有文献报道它对植物幼苗生长有促进作用。
柏钰[3]2011年在《银杏内生真菌的分离及抑菌活性研究》文中研究说明植物内生真菌能够产生结构新颖、功能特殊的天然活性物质，是开发新型生物源农药的宝贵资源，在农业中具有广泛的应用前景。本文从银杏树中分离筛选得到2株内生真菌，编号为T-4和T-7，对几种重要的植物病原菌具有抑制作用，对其进行了生物学特性测定和代谢产物抑菌活性研究。主要研究结果如下：1.采用组织分离法，从银杏的茎、叶片和根皮组织内分离得到26株内生真菌。通过对峙试验，测定了26株内生真菌对辣椒疫霉病菌（Phytophthora capsici），番茄枯萎病菌(Fusarium oxysporum)，苹果腐烂病菌(Cytospora mandshurica)，苹果炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides），梨黑星病菌(Venturia pirina)，小麦赤霉病菌（Fusarium graminearum）6种植物病原菌的拮抗作用。结果表明17株内生真菌对6种供试病原菌有不同程度的抑制作用。其中T-4和T-7菌株作用较明显，对6种病原菌抑菌率均达到50%以上，对苹果腐烂病菌均达到90%以上；T-7对辣椒疫霉病菌的抑制率也达到90%以上。T-4对番茄枯萎病菌抑制率则在85%。2.内生真菌T-4和T-7的分类鉴定结果显示二者同为镰孢属（Fusarium sp.）,其中T-7经分子生物学鉴定为为腐皮镰孢菌(Fusarium solani)。生物学特性研究测定了不同温度、光照、酸碱度及碳源、氮源和培养基条件下两株菌的生长情况。试验结果表明两株菌生长的适宜温度范围在28℃-32℃；T-4和T-7菌株分别适合在pH值为7-9和6-10范围内生长；葡萄糖和麦芽糖是T-4菌株生长的最适碳源，乳糖是T-7的最适碳源；T-4菌株生长适用的氮源是胰蛋白胨，T-7为硝酸钠； PDA或PSA是T-4菌株生长的适宜培养基，牛肉膏培养基对于T-7更为适用；两者皆不受光照条件影响。3.采用抑制菌丝生长速率法测定了26株内生真菌代谢产物的抑菌作用。经摇瓶发酵得到的菌丝，用乙酸乙酯萃取，得到的粗提物在200mg/L浓度下对供试病原菌的抑制作用较弱。发酵液对6种供试病原菌抑菌活性测定发现，T-4和T-7菌株发酵液表现出对苹果腐烂病菌、苹果炭疽病菌、梨黑星病菌和小麦赤霉病菌和番茄枯萎病菌的抑制作用，对苹果腐烂病菌的抑制率分别达到90%和85%以上。二者对辣椒疫霉病菌都没有表现出抑制作用。检测T-4、T-7菌丝发酵液在辣椒幼苗上的抑菌作用，结果表明T-7发酵液对感染辣椒疫霉的幼苗有23.17%的保护作用和15.43%的治疗作用，表现出一定的防治效果。
参考文献：
[1]. 银杏树内生真菌代谢产物中活性成分的研究[D]. 易大为. 沈阳药科大学. 2003
[2]. 银杏内生真菌的分离鉴定及代谢产物抑菌活性研究[D]. 柏钰. 安徽农业大学. 2015
[3]. 银杏内生真菌的分离及抑菌活性研究[D]. 柏钰. 安徽农业大学. 2011