王雪云 胡守彬 董文娟
山东亦度生物技术有限公司 257000
摘要：以百日咳杆菌Prn蛋白作为抗原，免疫兔制备多克隆抗体，利用多抗与固相载体Sepharose 4B偶联，制备亲和免疫层析柱。结果显色，经三次免疫百日咳杆菌Prn蛋白，兔血清稀释倍数达到105，多克隆抗体与Sepharose 4B凝胶偶联制备获得了免疫亲和层析柱，通过该柱纯化Prn蛋白，纯化率90%以上。
关键词：百日咳杆菌Prn蛋白；纯化；免疫亲和层析柱
百日咳是一种由百日咳杆菌感染引起的急性呼吸道传染病，主要感染6岁以下的婴幼儿。对于该病的预防最经济有效的方法为注射疫苗。百日咳疫苗的分为全细胞百日咳疫苗、无细胞百日咳疫苗。无细胞百日咳疫苗除去了引起副反应的毒性物质，保留了起免疫保护作用的抗原性。无细胞百日咳疫苗的主要有效成分为百日咳毒素（PT）、丝状血凝素（FHA）、粘附素（Prn）、凝集原（AGG）等。Prn是一种非纤毛性的凝集原，具有较强的免疫原性，与抗Prn蛋白抗体水平与临床保护性呈正相关[1]。在欧美和我国的部分企业已将其作为百日咳疫苗的重要组分。
本实验提供一种纯化百日咳杆菌Prn蛋白的免疫亲和层析柱及蛋白纯化方法，是以Prn蛋白作为抗原，免疫兔制备多克隆抗体，利用多抗制备了纯化Prn蛋白的亲和免疫层析柱，可以特异性纯化Prn蛋白，为Prn蛋白的纯化提供了新方法。
1材料与方法
1.1试药试剂
百日咳CS株为本公司保存，百日咳杆菌Prn蛋白为本公司生产制备，Protein G Resin购自宝生物工程（大连）有限公司，Sepharose 4B凝胶及Quixstand中空纤维膜分离系统均购自GE。
1.2实验方法
1.2.1 抗Prn蛋白多克隆抗体制备
取制备的Prn蛋白作为免疫蛋白，选择SPF成年兔，免疫三次，免疫剂量为75μg/只，免疫间隔为2周，采血前一周加强免疫一次。
1.2.2 抗Prn蛋白多克隆抗体的纯化
离心获得血清，用饱和硫酸铵粗提抗体，利用Protein G Resin对多抗进行进一步纯化。
1.2.3 多克隆抗体与Sepharose 4B凝胶偶联
离心5ml Sepharose 4B（GE）干胶，用5g CNBr活化，活化完毕，分别用注射用水、丙酮各洗一遍，用碳酸氢钠溶液洗五遍，备用。
将纯化获得的多克隆抗体透析于碳酸氢钠溶液（0.2M、pH8.9）中，测浓度，10mg与活化的凝胶混合偶联，4℃孵育过夜。
1.2.4 分离纯化PRN蛋白
一、样品前处理
收集细菌培养上清经纯化FHA与PT蛋白后的流出液，用切向流系统浓缩至原来体积的十分之一，用50mM Tris-HCl，pH=7.5复溶，10000rpm离心10分钟，收集上清。
二、Prn蛋白的纯化
用10倍体积50mM Tris-HCl，pH=7.5平衡免疫亲和层析柱。将待纯化的4倍柱体积样品加入柱子中，加样完毕用5倍体积50mM Tris-HCl，pH=7.5，洗脱杂蛋白，用50mM Tris-HCl缓冲液，洗脱蛋白，迅速调pH值至7.5。用SDS-PAGE进行分析[5]。
2 结果
2.1兔三免血清检测
取三次免疫后倍比稀释至1：102，1：103，1：104和1：105的血清作为一抗，二抗为1：4000 稀释的HRP 标记的羊抗兔单抗。兔三免后血清稀释倍数达到105，满足多克隆抗制备所需。
2.2抗Prn蛋白多克隆抗体的纯化
获得的兔血清经过硫酸铵粗提取，及Protein G Resin纯化后，经SDS-PAGE分析抗体纯度，可以用于后试验。
2.3多克隆抗体与Sepharose 4B凝胶偶联
将纯化获得的多克隆抗体透析于碳酸氢钠溶液（0.2M、pH8.9）中，10mg与活化的凝胶混合偶联，4℃孵育过夜。偶联液2000rpm离心5分钟取沉淀，收集上清。用20ml碳酸氢钠溶液重悬，依次用20ml碳酸氢钠溶液、碳酸氢钠-氯化钠混合液（0.2M碳酸氢钠、0.5M 氯化钠）、碳酸氢钠溶液洗一遍。用乙醇胺（50mM）溶液4℃封闭4小时。用PBS洗三遍裝柱备用。
2.4 Prn蛋白的纯化
将4℃保存的层析柱取出，用10倍体积50mM Tris-HCl平衡层析柱。将样品加入柱子中，加样完毕用5倍体积50mM Tris-HCl，pH=7.5，洗脱杂蛋白，用50mM Tris-HC缓冲液，洗脱蛋白，迅速调pH值至7.5。用SDS-PAGE进行分析，如图2，可以看出蛋白纯化效果较好，纯化率90%以上。
1泳道为上样前样品；2泳道是过柱流出液
3泳道是洗脱液；4泳道是标准Prn蛋白r
图 SDS-PAGE分析PRN蛋白纯化效果
3 讨论
Prn为一种非纤毛性的凝集原，存在于百日咳杆菌表面，它在百日咳杆菌侵袭宿主呼吸系统上皮细胞的感染粘附过程发挥着重要的作用。
Prn蛋白产量小，对于它的纯化有很多方法。如 Sepharose Fast Flow层析柱吸附，用高盐洗脱的方法。该方法为非特异性吸附，杂蛋白较多，且引入较多盐类。现在大部分企业先利用硫酸铵多步沉淀，来浓缩目的蛋白，再利用层析柱过滤，用高盐洗脱。该方法步骤繁琐，耗时较多，非特异性吸附，引入杂蛋白污染。
本实验利用多克隆抗体与Sepharose 4B凝胶偶联制备获得了免疫亲和层析柱，洗脱纯化Prn蛋白，纯化率90%以上。
参考文献：
[1]King AJ，Berbers G，Van Dirschot HF，et al. Role of the Polymorphic region I of the Berdetella pertussis protein pertactin in inmmnity. Mierobiology，2001，147（11）；2885-2895.
[2]徐颖华，谭亚军，张庶民，侯启明.无细胞百日咳疫苗质量控制方法的建立.中国生物制品学杂志，2009，02（22）；165-167.
论文作者:王雪云,胡守彬,董文娟
论文发表刊物:《健康世界》2018年6期
论文发表时间:2018/5/30
标签：蛋白论文; 层析论文; 百日咳论文; 免疫论文; 抗体论文; 碳酸氢钠论文; 杆菌论文; 《健康世界》2018年6期论文;