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摘要:自1975年杂交瘤单克隆抗体技术的出现，单克隆抗体迅速在生命科学研究和临床检测诊断中得到了广泛的应用，为许多领域的发展作出了不可估量的贡献。然而，单克隆抗体技术自问世以来，在临床治疗方面进展缓慢，主要因为目前单克隆抗体大多是鼠源性的，而在应用于人体治疗时，鼠源单抗存在诸多问题。随着技术的发展，出现了人-鼠嵌合抗体制备技术、噬菌体展示技术、核糖体展示技术、转基因小鼠技术、单细胞抗体制备技术和双功能抗体技术，这些技术有效地解决了单克隆抗体鼠源性等问题，使单克隆抗体凭借自身高度特异性和均一性的特点在治疗肿瘤、自身免疫性疾病和器官移植等方面显出了独特的优势和良好的应用前景，故单克隆抗体制备技术的发展也就显得尤为重要。
关键词: 单克隆抗体；制备技术；核糖体；转基因小鼠
引言：1975年德国科学家Kohler和英国科学家Milstein利用杂交瘤技术将产生抗体的B淋巴细胞同骨髓瘤细胞融合，成功的建立了单克隆抗体制备技术，由于单克隆抗体在生命科学领域的巨大贡献，此技术获得1984年的诺贝尔医学和生理学奖；1994年Winter等创建了以噬菌体抗体库技术为代表的基因工程抗体，是单克隆抗体技术的又一重要进步，该技术是按人工设计所重新组装的新型抗体分子，使不经免疫既可获得任何一种动物（包括人）的特异性抗体成为可能，目前基因工程抗体在疾病的预防、诊断、及治疗方面已获得广泛应用。
1、单克隆抗体（monoclonal antibody，McAb）的研究现状
1.1 鼠源性单抗
鼠杂交瘤单克隆抗体主要是将来源于免疫接种过的小鼠的B 细胞与骨髓瘤细胞融合，继而筛选出既能无限增殖又能分泌抗体的鼠杂交融合细胞，进而进行筛选、抗体制备和抗体纯化。目前所生产的单抗大多数是鼠源性的。其在临床应用方面还存在着很大的弊端，一方面，鼠源单抗与自然杀伤细胞等免疫细胞表面Fc段受体亲和力弱，产生的抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用较弱，对肿瘤细胞的杀伤能力较弱，人血循环中的半衰期短，它发挥细胞毒作用作用的时间较短；另一方面，鼠McAb还具有免疫原性，产生人抗鼠抗体，既降低单抗的治疗效果，又诱发变态反应。
1.2 嵌合抗体
嵌合抗体是通过基因重组技术用人McAb的恒定区基因替换鼠 McAb的恒定区基因，从而编码产生的McAb，也就是将鼠源性单抗在保留其抗原结合活性的基础上，尽可能去除鼠源化部分或代之以人源化片段，减少了鼠源性抗体的免疫原性，从而尽可能减少单抗的异源性，同时保留了亲本抗体特异性结合抗原的能力。但嵌合抗体仍保留了30%的鼠源性，可诱发人抗鼠反应。
1.3 人源化抗体
人源化改造主要是重构抗体和表面重塑抗体。重构抗体分为互补决定区( complementarity determining region，CDR) 移植抗体和特异性决定残基( specificity-deter mining residue，SDR) 移植抗体。CDR移植抗体将鼠源单抗上的6个CDR，通过分子克隆的方法，克隆到人抗体相应的框架区。仍残存少量异源基因，仍可引起免疫排斥反应。并不是整个CDR都参与抗原的特异性识别，在CDR区中仅一部分氨基酸残基与抗原结合，这些氨基酸残基决定抗体的特异性，被称之SDR。SDR移植抗体仅将异源抗体CDR区内与抗原结合关系密切的SDR，移植到人抗体相应位置上，使人源化抗体的免疫原性进一步降低。但 SDR移植抗体和CDR移植抗体一样往往存在亲和力和特异性降低的缺点。目前重构抗体是对鼠源性单抗人源化改造最常用、最基本的方法。表面重塑抗体是对鼠抗体框架区表面氨基酸的残基进行重塑或替换，该技术仅改造或替换与人抗体有明显差异的表面氨基酸的残基。在维持抗体活性和减少异源性基础上选用与人抗体表面残基相似的氨基酸残基替换，使抗体与抗原结合具有更好的亲和力和特异性。
1.4. 噬菌体抗体库技术
噬菌体抗体库技术是迄今发展最成熟、应用最广泛的抗体库技术。它是一种基因表达产物和亲和选择相结合的技术，它以改构的噬菌体为载体，把待选基因片段定向插入噬菌体外壳蛋白质基因区，使外源多肽或蛋白质表达并展示于噬菌体表面，进而通过亲和富集法表达有特异肽或蛋白质的噬菌体，该技术实现了基因型和表型的转换。通过这种方式，形成获得一个具有上亿个体外方式制得的不同抗体的基因数据库，使从真实的抗原中迅速分离高度相似的同族抗体成为可能。但该技术也存在一定的缺陷，如从非免疫抗体库获得的抗体亲和力不高；免疫抗体库的库容量不足，难以涵盖一些动物抗体的多样性；在淘选过程中会出现高亲和力低拷贝的特异性噬菌体抗体的丢失等。
1.5 核糖体展示技术
核糖体展示技术是一种完全在体外合成并筛选蛋白质的技术。该技术利用聚合酶链反应扩增含目的基因的cDNA文库，同时引入启动子、核糖体结合位点及茎环结构，在转录/翻译耦联系统作用下，形成“蛋白质-核糖体-mRNA”三元复合物，构成核糖体展示的抗体库，再用相应的抗原对翻译混合物进行筛选并从中分离mRNA，通过反转录-聚合酶链反应富集目的基因，并将目的基因导入表达载体，从而获得库容量大、特异性强、亲和力高的人源基因工程抗体库。
1.6 基因工程小鼠制备全人抗体
制备全人抗体的基因工程小鼠包括人外周血淋巴细胞-严重联合免疫缺陷小鼠(hu-PBL-SCID小鼠)、基因小鼠和转染色体小鼠制备人抗体技术。hu-PBL-SCID小鼠是将已产生一定免疫反应的供者或癌症患者的人的外周血淋巴细胞移植于严重联合免疫缺陷小鼠，经抗原免疫后可获得人源抗体。转基因小鼠制备的基本原理是将改建后的目的基因(或基因组片段)导入小鼠的受精卵(或着床前胚胎细胞)，然后将此受精卵(或着床前胚胎细胞)再植入受体动物的输卵管(或子宫)中，使其发育成携带有外源基因的转基因小鼠，将编码人抗体的基因序列转化鼠细胞已形成转基因鼠，在抗原的刺激下，该转基因鼠可分泌合成人抗体。由转基因小鼠产生的McAb经历了正常装配和成熟的过程，产生的抗体具有较高的亲和力。转染色体小鼠是通过微细胞介导法(MMCT方法)将人14号染色体上产生IgH的胚系片段和2号染色体上5～50Mb的κ轻链片段转染到ES细胞，获得小鼠经人血清清蛋白免疫之后，可产生抗人血清清蛋白的人Ig，再次免疫后产生IgM。
1.7 单细胞抗体制备技术
单个B细胞抗体制备技术是一种新发展的体外克隆和表达单个抗原特异性B细胞抗体基因技术，区别于传统的杂交瘤技术，不需要进行淋巴B细胞和骨髓瘤细胞融合，自然没有融合筛选阳性细胞的问题，这种方法保留了轻重链可变区的天然配对，具有基因多样性好、效率高、全人源、需要的细胞量少等优势。可以根据需要选择B细胞的来源，且分离B细胞操作简单，有显微操作法，荧光激活细胞分选法，将分离得到的B细胞进行扩增和克隆抗体。
期刊文章分类查询,尽在期刊图书馆该技术制备的抗体特点是具有全人源性、自身高度特异性，在自身免疫性疾病、肿瘤、器官移植等方面都有非常广阔的应用前景。效率更高、全人源更好、基因多样性更丰富是单个B细胞技术的优势。可仍受到一些约束，如高通量PCR扩增技术抗体基因仍不够完善、某些目标抗原难以制备、人源合适的供体需求量较多等。
1.8 双功能抗体
由于传统的单克隆抗体只能分别单一的抗原分子，在临床应用中需要能同时检测两种或两种以上的抗原分子，因此双功能抗体应运而生。我们都知道免疫球蛋白IgG由两条重链（H链）和2条轻链（L链）组成的Y字型结构，重链可变区VH、轻链可变区VL与抗原特异性结合相关。Knobs-into-holes异源二聚体技术是一种经典制备双功能抗体技术，即在CH3的突变界面能促使两个来源不同亲本抗体的半抗体（一个是knob突变的，另一个是hole突变的）组装成一个新的双功能抗体。半抗体非常的不稳定，是因为重链会快速二聚化，为了防止重链的自我组装和保持半抗体的蛋白性质，在抗体CH3引入T366W (knob) or T366S, L368A and Y407V (hole)突变，从而使空间位阻改变，还有在CH3区形成的共价键能使半抗体重组，这就是该技术的关键。
2、单克隆抗体在临床上的应用
2.1 用于疾病诊断方面
利用单抗进行疾病的诊断现已被广泛应用。(1)可用以检测淋巴细胞表面分子，以区分不同分化阶段的淋巴细胞，用于鉴别淋巴细胞。(2)可用于鉴定病原体，准确诊断感染性疾病。将病原体的抗原分离，再同骨髓瘤细胞杂交建立相应的杂交瘤细胞株，分泌单克隆抗体，可以同病原体发生特异性的抗原-抗体反应，通过免疫荧光试验或ELISA试验对疾病进行诊断。(3)可以用于肿瘤的诊断和分型。某些单抗具有在肿瘤部位蓄积的特性，可用于肿瘤的诊断。目前已批准使用的诊断剂有:用于结肠癌的votomab和arcilumonab，用于探测感染部位的sulemab，用于卵巢癌的igovomab，用于黑色素瘤的tecnemabK- 1。(4)激素类单抗可用于测定体内激素含量，判断内分泌的功能状态。
2.2 用于疾病的治疗
目前利用单抗对疾病进行治疗已取得了很大的成果，主要是将单抗同药物耦联，再与病原体或肿瘤的特异抗原结合后发挥作用。
2.2.1 抗细胞表面分子单抗，可抑制同种免疫反应，主要用于移植排斥反应的防治。莫罗单抗(muromonab-CD3，OrthocloneOKT3)是FDA批准用于肾移植病人防止异体排斥反应的第一只鼠源型单克隆抗体。
2.2.2 抗细胞因子单抗，可抑制自身免疫反应，主要用于自身免疫性疾病的治疗。单克隆抗体通过清除激活的细胞、阻滞其功能、或将升高的促炎细胞因子水平降至正常而抑制过度的免疫病理学反应。如TNF阻滞剂，用于治疗类风湿性关节炎和节段性回肠炎取得了较好的效果。阿达木单抗(Adali-mumab)是继伊那西普(etanercept)和英夫利昔单抗(infliximab)之后第三代TNF-α拮抗剂，法国生产的，是最新研制的用于治疗类风湿性关节炎的单克隆抗体。
2.2.3 抗肿瘤单抗，可用于肿瘤的导向治疗。第一个获准用于癌症治疗的嵌合型IgG-1单克隆抗体是rituximab(Mabthera)，其作用标靶为CD 20(即在前B淋巴细胞和成熟B淋巴细胞上的跨膜蛋白)。多中心临床研究显示，本品能有效治疗复发的低度滤泡型非何杰金淋巴瘤。
2.2.4 单克隆抗体在用于免疫治疗时的局限性。
2.2.4.1 单克隆抗体的特异性:由于肿瘤特异性抗原较少，缺乏对肿瘤有严格特异性的单抗，而且有些对正常组织也有交叉反应。
2.2.4.2 异种抗体反应:鼠源性单抗用于人体，仍然是一种异体物质，可导致机体产生异源性超敏反应。
2.3 用作研究工具
单克隆抗体及制备技术在抗原的分析纯化、抗原决定簇的定位、蛋白质相互作用位点的确定、特异调节分子的分离和人工抗体和疫苗的制备、诊断技术、酶抑制剂的研究开发、多肽药物的研制等生物技术研究的不同领域得到了应用，并对这些领域产生了深远的影响。
3、结语
单抗具有高度均一、生物活性单一和与抗原结合的特异性强等优点。在过去的40多年里，从鼠源性单抗到全人源性抗体，单抗在制备技术上取得了较大的进展。但是，鼠源性单抗的免疫源性导致机体产生一系列的急性反应，使药物的功效降低，因此单抗的人源化是单抗药物的发展趋向。目前，如何提高抗体的生产效率，同时保持其优良特性，且能同时解决免疫原性这一问题，是该领域的热点和难点，相信不久的将来，随着重组DNA技术的进一步发展，可以根据不同需要实现人-人、人-动物、人-植物和动物-动物等多种抗体重新组合，借助于杂交瘤细胞产生嵌合抗体、重组型抗体、单链抗体、单区抗体、全套抗体以及抗体酶，将单克隆抗体的生产效率、质量以及应用提升到一个更高的水平。
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论文作者:蓝彩凤
论文发表刊物:《防护工程》2018年第23期
论文发表时间:2018/12/14
标签：抗体论文; 技术论文; 抗原论文; 特异性论文; 细胞论文; 小鼠论文; 免疫论文; 《防护工程》2018年第23期论文;