葛君1 黄文宇1 杨峰1 马玲1 翟惠虹2(通讯作者)
（1宁夏医科大学 宁夏银川 750004）
（2宁夏医科大学总医院消化内科 宁夏银川 750004）
【摘要】目的：检测Th17细胞在DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠结肠组织中的表达及其在溃疡性结肠炎发病机制中的意义。方法： 正常组小鼠和DSS组慢性溃疡性结肠炎小鼠模型，记录小鼠的体重变化及结肠组织病理改变；流式细胞术检测Th17细胞的表达情况。结果：与正常组小鼠相比较，DSS组小鼠的体重明显下降（P＜0.05），结肠黏膜变薄，隐窝出现分支、萎缩、扭曲等结构改变，肠壁内有淋巴细胞、浆细胞浸润；正常组小鼠结肠组织中Th17的相对表达量为（0.013±0.003）%，DSS组小鼠结肠组织中Th17的相对表达量为（0.09±0.02）%，差异具有统计学意义（P＜0.05）。结论：Th17细胞在DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠结肠组织中的表达量增加，并可作为溃疡性结肠炎的重要治疗靶点。
【关键词】溃疡性结肠炎；Th17细胞；DSS
【中图分类号】R656.9 【文献标识码】A 【文章编号】1007-8231（2018）22-0141-02
Expression and significance of Th17 cells in ulcerative colitis Ge Jun1, Huang Wenyu1, Yang Feng1, Ma Ling1, Zhai Huihong2.
1 Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, Ningxia Hui Autonomous Region,China; 2 Department of Gastroenterology, General Hospital of Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, Ningxia Hui Autonomous Region, China
【Abstract】Objective The expression of Th17 cells in the colon tissue of mice with ulcerative colitis induced by DSS was detected and it is significance in the pathogenesis of ulcerative colitis. Methods Normal group mice and the mice model of chronic ulcerative colitis in the DSS group was used to record the weight and pathological changes of the colon. Flow cytometry was used to detect the expression of Th17 cells. Results Compared with normal mice, DSS group mice's body weight decreased significantly (P<0.05), the colon mucosa became thin, and the crypts showed branching, atrophy, and twisted structures. Lymphocytes and plasma cells infiltrated in the intestinal wall. The relative expression of Th17 in the normal mice was (0.013±0.003)%, and the relative expression of Th17 in the colon of DSS mice was (0.09±0.02)%. The difference was statistically significant (P<0.05). Conclusion Th1 cells have increased expression in colon tissues of DSS-induced ulcerative colitis and may serve as an important therapeutic target for ulcerative colitis.
【Key words】Ulcerative colitis; Th17 cells; DSS
溃疡性结肠炎（Ulcerative colitis, UC），是病因尚未明确的慢性复发性肠道炎症性疾病，近年来在发达国家UC的发病率虽有所减缓，但仍处于缓慢上升状态，在中国等发展中国家UC的发病率持续上升，已成为我国消化系统的常见病[1,2]。目前，UC的传统治疗药物副作用大、新型生物制剂价格昂贵，不能有效提高患者生活质量[3,4]。因此，进一步探讨溃疡性结肠炎的发病机制，特别是炎症细胞的分化趋势，能够为寻找有效治疗靶点奠定基础。Th17细胞是目前备受瞩目的在溃疡性结肠炎发病过程中发挥重要作用的免疫细胞，但其在慢性溃疡性结肠炎中的表达情况仍有争议[5]。本研究制备慢性溃疡性结肠炎的小鼠模型，检测Th17细胞在慢性溃疡性结肠炎和正常小鼠结肠组织中的表达，旨在探讨Th17在慢性溃疡性结肠炎发病过程中的重要意义。
1.材料与方法
1.1 一般材料
SPF级的健康C57BL/6雌性小鼠（6～8周，20g左右）50只。实验动物由北京友谊医院实验动物中心提供，实验过程给予小鼠自由饮水、饮食，实验操作符合动物伦理学要求。吸入乙醚致死法处死小鼠，取结肠，部分10%中性福尔马林固定，石蜡包埋；部分剪碎放入含有0.5MM EDTA的磷酸盐缓冲液中，磁力搅拌器上轻微振荡40分钟，分离结肠黏膜组织中的固有层细胞（LPC），含DNA酶和胶原酶-IV的消化液消化30分钟，80%和40%的Percoll液梯度离心，获取纯化的结肠组织内CD4T+ 细胞。
1.2 主要试剂
葡聚糖硫酸酯钠盐（DSS）（西安元森生物公司）；苏木素伊红染色试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）；RPMI 1640培养基（Hyclone公司）；抗体（eBioscience公司）。
1.3 造模
DSS组饮用1.5% DSS溶液7天后停10天，之后给5天DSS，5天蒸馏水，交替3次，过程中记录小鼠体重。
1.4 苏木素伊红染色（HE染色）
蜡块4um连续切片，制片后根据HE染色试剂盒说明书要求，进行染色，光镜下观察。
1.5 流式细胞术
RPMI1640培养基调节CD4+T细胞浓度为2×106细胞/ml置于六孔板内培养，每孔内加入佛波酯及离子酶的混合物PMA/Ionomycin（250×）2ul、蛋白转运抑制剂 BFA/Monensin Mixture（250×）2ul，培养6小时后，收集细胞。每个5ml流式管中加入100ul含1×106个细胞的细胞悬液，加入适量荧光标记的表面抗体（anti-mouse CD4 FITC），室温避光45min进行孵育。1mL PBS振荡清洗后，加入100µL/管FIX&PERM Mdeium A固定剂，室温避光孵育 15min；3ml/管流式染色缓冲液，300g离心5分钟后弃上清；100µL/管FIX&PERM Mdeium B破膜剂及胞内抗体（anti-mouse/Rat IL-17A Pecp-cyanine5.5）和相应的同型对照，避光室温孵育抗体30分钟。加入3ml/管流式染色缓冲液，300g离心5分钟，弃上清；0.5ml流式染色缓冲液，混匀细胞上流式细胞仪检测。细胞仪进行检测Th17细胞数量。
1.6 统计学方法应用
GraphPad Prism Software 6.0对数据进行分析、作图。首先，对所有计量数据进行t检验分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。
2.结果
2.1 体重变化
DSS组小鼠体重低于正常组，且二者之间差异有统计学意义（P＜0.05）。正常组小鼠体重随着小鼠的生长逐渐增加，而DSS组小鼠体重在饮用DSS期间下降，饮用蒸馏水期间下降趋势减缓或有所回升，见图1。
3.讨论
目前，溃疡性结肠炎是由基因和环境等原因引起免疫系统异常应答造成的肠道炎症，与辅助性T细胞（Th细胞）的分化密切相关，但Th17细胞与溃疡性结肠炎的发病机制之间的关系仍有争议[5]。本研究表明：Th17细胞在DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠结肠组织中的表达量增加，可为溃疡性结肠炎的治疗研究奠定基础。
溃疡性结肠炎的发生和发展是一系列复杂的免疫激活过程。其患者肠黏膜组织内有大量激活的免疫细胞浸润，如巨噬细胞、中性粒细胞、树突状细胞、辅助性T细胞和浆细胞等，表达高水平促炎症细胞因子等，这些因子相互作用诱导肠粘膜局部炎症应答，造成肠黏膜损伤[6]。本研究结果表明Th17在慢性溃疡性结肠炎的免疫激活过程中发挥一定的作用。
CD4+细胞决定了UC的发展方向和病变程度。各类抗原提呈细胞激活的初始T细胞在相关因子的刺激下会分化为多种效应细胞，并分泌多种细胞因子参与UC病理生理过程。最先发现的是CD4+T细胞在接受刺激后通过分化为Th1或Th2 细胞并分泌相应细胞因子，使得下游信号分子识别，而后通过各自不同的信号通路影响其他细胞因子、蛋白表达，影响UC的病理生理过程。近年来，新发现Th17这一CD4+T细胞分化亚型，其可能在IL-6和TGF-β的刺激下分化形成，并且视黄酸相关的孤儿受体γt（RORγt）是其相关通路的关键转录因子[7-9]。本研究结果表明，慢性溃疡性结肠炎的小鼠模型的结肠组织中Th17细胞的相对表达量高于正常小鼠，提供了Th17与溃疡性结肠炎相关的证据。
综上所述，Th17于慢性溃疡性结肠炎的发病机制中发挥重要作用，但其作用的具体调控因子仍需要进一步研究，从而为UC的靶向治疗奠定基础。
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基金项目：宁夏自然科学基金（NZ15153）
论文作者:葛君1,黄文宇1,杨峰1,马玲1,翟惠虹2(通讯作者
论文发表刊物:《心理医生》2018年8月22期
论文发表时间:2018/8/14
标签：溃疡性论文; 细胞论文; 小鼠论文; 结肠炎论文; 结肠论文; 组织论文; 缓冲液论文; 《心理医生》2018年8月22期论文;