（长沙医学院基础医学院医学生物细胞学教研室 湖南长沙 410219）
目的 研究MMP-9、TIMP-3蛋白在胃癌、癌前病变及癌旁组织中的表达情况，探讨其与胃癌侵袭、转移的相关性。方法 收集手术后胃癌标本30例，相应癌旁正常胃粘膜组织30例，癌前病变标本20例，用SABC免疫组化方法检测不同标本中MMP-9，TIMP-3蛋白表达水平的变化。结果1.MMP-9蛋白的阳性表达率为（76.7%)，高于癌前病变组织（30%)及癌旁正常胃粘膜组织（20%)，差异有统计学意义（P<0.05)。TIMP-3蛋白在胃癌组织中阳性表达率为(50%)，低于癌旁正常胃粘膜组织（80%)，差异有统计学意义（P<0.05)，与癌前病变组织（60%)相比，差异无统计学意义（P>0.05);2.双变量相关性分析显示：胃癌组织中MMP-9蛋白TIMP-3蛋白的表达呈负相关。癌旁正常胃粘膜组织及癌前病变组织中MMP-9蛋白与TIMP-3蛋白的表达呈正相关。结论：MMP-9蛋白的过表达及TIMP-3蛋白的低表达可能与胃癌的侵袭密切相关，对判断胃癌患者的病情进展有参考价值。
关键词：MMP-9；TIMP-3;胃癌；免疫组化
胃癌是发生率居世界的第四位，且死亡率居世界第二位的恶性肿瘤。肿瘤细胞的高侵袭及转移能力是其预后差的重要原因。近十余年来，随着肿瘤预防、治疗措施的不断发展，胃癌的死亡率有所下降。随着肿瘤分子生物学的深入研究，分子靶向药物治疗成为目前肿瘤治疗的一个热点。化疗联合靶向药物治疗已经开始进行临床试验，更多的肿瘤标记物将用于胃癌检测。进一步阐明胃癌发生发展机制，以助于胃癌的早期诊断，为临床上分子靶向治疗药物的选择提供参考，已成为胃癌研究的重要课题。
细胞外基质的降解是肿瘤的侵袭和转移过程中一个关键性的步骤。肿瘤细胞的侵袭力取决于基质金属蛋白酶（Matrix metalloproteinases，MMPs)及其抑制物的活性[1]。MMPs是能降解细胞外基质组分的锌离子依赖性内肽酶类。MMPs的活性在多个过程中受到控制，包括转录，转录后，翻译后，同样可由它们的内源性抑制物TIMPs控制。MMPs可由肿瘤细胞产生，它们可能与肿瘤进展有关，包括侵袭、转移、血管生成。在MMPs家族中，MMP-9及MMP-2因能够降解IV型胶原，在恶性细胞的迀移中扮演着重要的角色。MMP-9是MMPs家族的重要成员，MMP-9的可以降解IV、V型胶原、明胶及纤维连接蛋白和弹性蛋白，IV型胶原是基底膜的主要成分，因此，MMP-9不但可降解ECM还可降解基底膜，这是MMP-9促进肿瘤侵袭转移的重要机制[2]。Belguise等的研究发现Fra-1能直接与MMP-1和MMP-9启动子结合，诱导其转录。有研究证明[3]，MMP-9与肿瘤的发生、肿瘤细胞向脉管迀移、淋巴结及远处转移关系密切。
金属蛋白酶组织抑制剂(tissue inhibitor of metalloproteinases, TIMPs)是由四个家族成员（TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3、TIMP-4)组成的MMPs的内源性抑制剂，通过与MMPs的催化部位结合，抑制MMPs活性形式及活化过程从而抑制肿瘤的侵袭转移[4]。其中TIMP-3是全功能MMPs抑制剂，位于22q12.3号染色体，能抑制肿瘤生长、血管生成、侵袭，并且可以促进细胞凋亡。有研究表明，其在肿瘤细胞中的表达下调或缺失。还有研宄报道，TIMP-3的表达缺失与其基因启动子5’CpG岛甲基化有关，TIMP-3基因启动子的甲基化会促进食管癌及胃腺癌的发生。
目前MMP-9、TIMP-3蛋白各自在恶性肿瘤中的表达情况可见报道。但关于这两种蛋白在胃癌组织中的表达，以及这两者表达间是否存在相关性的研究较少见。本课题收集30例胃癌组织标本，30例癌旁正常胃粘膜组织标本，20例癌前病变组织标本，运用免疫组化方法检测MMP-9、TIMP-3蛋白的表达情况，并探讨其与胃癌侵袭的关系，为判断胃癌的病情进展趋势提供有参考价值的分子学指标。
1.实验方法
1.1标本的收集
收集我校23所附属医院2016-2019年期间30例住院手术的胃癌病人，所有病人均为胃腺癌患者，术前均未经放、化疗且经病理确诊。其中，男17例，女13例；年龄60岁者16例，<60岁者14例，中位年龄58.2岁（范围40-75岁）；肿瘤直径大于2cm者14例，小于2cm者16例；有淋巴转移者17例，无淋巴转移者13例；有远处转移者13例，无远处转移者17例；TNM分期I、II期者14例，III、IV期者16例；分化程度高、中分化者10例，低、未分化者20例。同期癌前病变者20例，其中男12例，女8例；年龄＜60岁者11例，<60岁者9例；中位年龄55.7岁（范围40-75岁）。两组之间在性别、年龄方面无统计学差异。
1.2标本取材及处理
术中切取胃癌及正常胃黏膜组织，10%福尔马林液固定；癌前病变组织均由门诊胃镜钳取，10%福尔马林液固定，送活检确诊。所有标本经石蜡包埋，每个石蜡块按4^m连续切片8张，4张用于免疫组织化学法（SABC法）检测Fra-1、MMP-9、TIMP-3并行阴性对照，1张HE染色，3张备用。
1.3 HE染色
用多聚赖氨酸防脱载玻片捞片后，置60°C烤箱30-60分钟，使蜡溶解，再放入二甲苯中脱蜡（I、II)分别15分钟；梯度酒精脱水（100%、95%、90%、80%、70%各5分钟）；蒸馏水洗3-5分钟；稍甩干水分，用苏木精染色约15分钟；自来水冲洗；冲洗后用1%盐酸酒精镜检分化，直至出现满意染色；用自来水稍冲洗，浸入1%氨水酒精约10余秒后迅速取出，用蒸馏水冲洗；甩干水分，1%伊红染色约3分钟；蒸馏水稍洗后，梯度酒精脱水（70%、80%、90%、95%、100%各2分钟）；二甲苯+乙醇（1:1)5分钟；二甲苯（I、II)各5分钟；将染色完成的切片取出，确保二甲苯未干燥，中性树胶封片。
1.4免疫组化染色SABC法
赖氨酸防脱载玻片捞片后，置60°C烤箱30-60分钟，使蜡溶解，再放入二甲苯中脱蜡（I、II、III)分别20分钟、10分钟、10分钟；梯度酒精脱水（100%、95%、90%、80%、70%各两分钟），蒸馏水洗5分钟，PBS洗5分钟X3次；3%双氧水室温孵育15分钟，以消除内源性过氧化物酶活性，PBS洗2分钟X4次；抗原修复：将组织切片浸入0.01M枸橼酸盐缓冲液（pH=6.0)，于压力锅中煮沸，上气后继续加热1分钟，自然冷却至室温；滴加一滴5%BSA封闭液，恒温箱37C孵育20分钟，甩去多余液体，不洗；滴加适当稀释的抗体（本实验MMP-9、TIMP-3抗体均用PBS以1:50稀释），放入湿盒中4C过夜；将切片从4C冰箱取出后于室温环境下复温30分钟，PBS洗3分钟X3次。滴加生物素标记的二抗，恒温箱37C孵育20分钟，PBS冲洗5分钟X3次；滴加SABC试剂一滴，恒温箱37C孵育20分钟，PBS洗5分钟X3次；DAB显色液显色，室温显色，显微镜下控制反应时间，直至细胞膜出现棕黄色，蒸馏水冲洗干净；苏木素复染30秒，自来水冲洗干净；烘烤干后用中性树胶封片。
1.5系统对照
PBS代替抗体做阴性对照，乳腺癌阳性片做阳性对照。
1.6结果判断
各组免疫组化片由两名病理科主治医师用双盲法进行综合评分。1.表达面积：①阳性表达细胞数为0记为0分；②阳性表达细胞数<25%记为1分；③阳性表达细胞数为26-50%记为2分；④阳性表达细胞数占51-75%记为3分；⑤阳性表达细胞数>75%记为4分。2.表达强度：①无阳性信号，记为0分；②阳性信号较弱，呈淡棕色，细颗粒状，记为1分；③阳性信号中等，呈棕色，粗颗粒状，记为2分；④阳性信号强烈，呈棕褐色，小块状，记为3分。两项相加，0-1分为阴性(-)，2-3分为弱阳性(+)，4-5分为中度阳性(++)，6-7分为强阳性(+++)。
2.相关评价指标
将患者性别、年龄、肿瘤大小、分化程度、TNM分期、淋巴结转移以及远处转移纳入胃癌相关性分析，以探讨MMP-9及TIMP-3表达在胃癌中表达及其与临床病理参数的相关性。
3.统计学分析
采用SPSS21.0统计软件对本实验数据进行统计分析，各指标在不同组织中阳性表达比较采用卡方检验。胃癌组织中各指标阳性表达率与临床病理参数之间的关系使用Hsher确切概率法；同时指标间用双变量相关分析。P<0.05为具有统计学意义。
4.结果
胃癌组织，癌旁正常胃粘膜组织及癌前病变组织中MMP-9、TIMP-3的阳性表达均主要定位于细胞膜或胞浆，呈现棕黄色或棕色颗粒。
4.1 MMP-9、TIMP-3蛋白在不同组织中的阳性表达（见表1）
4.1.1 MMP-9蛋白在胃癌组织中的阳性表达率为76.7%，高于癌旁正常胃粘膜组织组20%，x2=19.288，P=0.000，差异有统计学意义。高于癌前病变组30%，x2=10.728，P=0.001，差异有统计学意义。
4.1.2TIMP-3蛋白在胃癌组织中的阳性表达率50%，低于癌旁正常胃粘膜组织组80%，x2=5.934，P=0.015，差异有统计学意义。低于癌前病变组53.3%，X2=0.483，P=0.343，差异无统计学意义。
4.1.3 MMP-3、TIMP-3蛋白在癌前病变组和癌旁正常胃粘膜组织组中的阳性表达率差异均无统计学意义(P＜0.05)。
4.2 胃癌组织中MMP-9、TIMP-3蛋白阳性表达率的双变量相关性分析
4.2.1 胃癌组织中MMP-9蛋白与TIMP-3蛋白的表达之间存在相关性，两者之间呈负相关（X2=6.708,p<0.05)，见表2。
4.2.2 癌前病变组织及癌旁正常胃粘膜组织中MMP-9蛋白与TIMP-3蛋白表达之间存在相关性，两者之间呈正相关（X2=5.084，P<0.05)，见表3。
5.讨论
胃癌是我国常见的一种恶性肿瘤，肿瘤细胞通过侵袭转移扩散到远隔部位是导致胃癌患者死亡的主要原因，因此进一步研究胃癌侵袭、机制，针对某些中间环节施加影响可能成为我们治疗胃癌的新策略。本组研究用免疫组化方法检测MMP-9、TIMP-3蛋白在胃癌组织、癌旁组织、及癌前病变组织中的表达，结果显示FMMP-9、TIMP-3在上述三种不同组织中有不同程度的表达。
5.1MMP-9蛋白在胃癌组织中的表达与胃癌的侵袭
基质金属蛋白酶（Matrix metalloproteinases，MMPs)是一组重要的细胞外基质降解酶。它们作为一种钝化酶（MMPs蛋白），在水解其分子的前肽区之后，转化为活性形式。大多数MMPs在细胞外被其他已活化的MMPs或丝氨酸蛋白酶类活化[5]。多数MMPs在正常组织中的活性是很低的，然而，它们的表达受炎性因子，生长因子，激素及细胞与细胞间的相互作用的影响。活化的MMPs催化基底膜水解，降解或改变细胞外基质成分，参与肿瘤侵袭、转移及血管生成[6]。MMPs主要在肿瘤周边的间质细胞和肿瘤细胞中产生，肿瘤细胞可以通过可溶性递质或膜结合分子和间质细胞进行信息交换，协同产生和调节MMPs，这在肿瘤细胞侵袭和转移机制中具有重要意义。之前已有研究证明[7]，MMPs的过表达能促进肿瘤细胞的脱落和转移，与肿瘤的恶性发展密切相关。MMP-9是MMPs家族的重要成员，MMP-9的主要作用底物是明胶、IV、V型胶原及纤维连接蛋白和弹性蛋白，IV型胶原是基底膜的主要成分，因此，MMP-9不但可降解ECM还可降解基底膜，这是MMP-9促进肿瘤侵袭转移的重要机制。洪志等认为MMP-9不但可以通过降解、破坏表面基底膜中的胶原，从而促进肿瘤细胞沿着被破坏的基底膜向周围组织进行浸润侵袭，还可以通过新生血管生成来达到促进肿瘤生长、扩散的目的。研究显示[8]，MMP-9与胃癌发生、浸润、淋巴结转移、远处转移关系密切。本研究发现，MMP-9蛋白在胃癌组织中的阳性表达率高于癌前病变组织及癌旁组织，差异有统计学意义（P<0.05）。提示MMP-9在胃癌组织中表达上调且其表达可能与胃癌的侵袭相关。
5.2 TIMP-3蛋白在胃癌组织中的表达与胃癌的侵袭
金属蛋白酶组织抑制剂(tissue inhibitor of metalloproteinases, TIMPs)是由四个成员（TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3、TIMP-4)组成的特异性抑制MMPs蛋白活性的家族。TIMPs被认为是一种肿瘤抑制剂，因为TIMPs能抑制肿瘤生长、侵袭、血管生成，并且可以促进细胞凋亡。其机制可能是通过抑制MMPs活性形式及活化过程，从而维持基膜的完整性及抑制细胞外基质的降解，阻止内皮细胞迀移，并阻止肿瘤细胞进入血液循环形成转移灶。TIMPs作为MMPs主要的天然抑制剂，正常情况下两者维持平衡状态，当TIMPs表达下调或缺失，或MMPs过表达时，两者平衡被打破，影响细胞的粘附、运动、侵袭能力，从而促进肿瘤的侵袭及转移。TIMP-3是一种全功能的MMPs抑制剂，对MMP-9、MMP-2、胶原酶-1及基质溶素均有抑制作用。有研究表明，癌变时，MMPs和TIMPs的表达均上调，但是TIMPs的增高程度不足以抑制MMPs活性，二者之间的平衡被打破，导致ECM过度降解。Anand-Apte B的研究表明TIMP-3在胃癌组织中的表达有所减低，且有侵袭转 移的胃癌倾向于更高的表达缺失率。TIMP-3启动子区的甲基化被证实与其蛋白表达的减少或缺失相关。本研究发现，TIMP-3蛋白在胃癌组织中的阳性表达率低于癌旁正常组织，差异有统计学意义（P＞0.05)。其阳性表达率低于癌前病变组织，但差异无统计学意义（P＞0.05)。TIMP-3蛋白在胃癌组织中的表达情况在国内外研究中仍有争议，还需进一步研究，但值得肯定的是，多数研究表明，肿瘤的发生、发展有赖于MMPs与TIMPs之间的平衡学说，MMPs与TIMPs的失衡可能是导致胃癌发生及侵袭转移的重要因素。
5.3胃癌组织中MMP-9、TIMP-3蛋白表达的相关性
有研究表明[9]，TIMP-3作为MP-9的特异性组织抑制物，能够抑制胃癌的侵袭和转移，TIMP-3通过与MMP-9以1:1的比例特异性结合，抑制MMP-9活性的表达，从而抑制肿瘤的侵袭及转移。通常上调MMPs都会引起TIMPs的上调，当TIMPs的上调到达一定程度，不足以抑制MMP-9的活性时，两者之间的平衡被打破，从而导致ECM过度降解。改变MMPs与TIMPs之间的平衡被证实与大量的良性和恶性病理学表现有关。
本组研究中，在癌前病变组织及癌旁组织中，MMP-9蛋白与TIMP-3蛋白的阳性表达率呈正相关；而在胃癌组织，随着肿瘤细胞淋巴结与远处转移，临床分期靠近晚期，MMP-9蛋白的阳性表达率增加，而TIMP-3蛋白的阳性表达率下降，与MMP-9的表达趋势相反，两者呈负相关。两者可能存在抑制与被抑制的关系，提示TIMP-3在各组织中有对抗MMP-9的作用，且其表达的失衡可能与胃癌的发生及侵袭、转移相关。
综上所述，本文结果显示检测MMP-9、TIMP-3蛋白的表达对判断胃癌的病情进展有一定的参考价值。
参考文献
[1]陈昌英. MMP-3，MMP-9和TIMP-3在食管鳞癌中的表达及临床意义[D].东南大学,2017.
[2]Hrabia Anna,Wolak Dominika,Kwaśniewska Maria,Kieronska Anna,Socha Joanna K,Sechman Andrzej. Expression of gelatinases (MMP-2 and MMP-9) and tissue inhibitors of metalloproteinases (TIMP-2 and TIMP-3) in the chicken ovary in relation to follicle development and atresia.[J]. Theriogenology,2019,125.
[3]Łanocha-Arendarczyk Natalia,Baranowska-Bosiacka Irena,Gutowska Izabela,Kolasa-Wołosiuk Agnieszka,Kot Karolina,Łanocha Aleksandra,Metryka Emilia,Wiszniewska Barbara,Chlubek Dariusz,Kosik-Bogacka Danuta. The Activity of Matrix Metalloproteinases (MMP-2, MMP-9) and Their Tissue Inhibitors (TIMP-1, TIMP-3) in the Cerebral Cortex and Hippocampus in Experimental Acanthamoebiasis.[J]. International journal of molecular sciences,2018,19(12).
[4]陈昌英,姜藻,柏社香,胥荣.MMP-3、MMP-9和TIMP-3在食管鳞癌中的表达及临床意义[J].现代医学,2018,42(11):1287-1292.
[5]郑会聪,沈波,聂玉强,杜艳蕾.原发性肝癌中MMP-9、MMP-13和TIMP-3的表达及意义[J].广东医学,2018,34(13):1995-1998.
[6]Giuseppa Martinez,Giuseppe Costantino,Anna Clementi,Michele Puglia,Silvia Clementi,Giuseppina Cantarella,Leonardo De Meo,Mario Matera. Cisplatin-induced kidney injury in the rat: l -carnitine modulates the relationship between MMP-9 and TIMP-3[J]. Experimental and Toxicologic Pathology,2018,61(3).
[7]Bodh I. Jugdutt,Arivazhagan Palaniyappan,Halliday Idikio,Richard R.E. Uwiera. Temporal changes in MMP-9, TIMP-3 and iNOS after myocardial infarction with or without reperfusion in the rat[J]. Journal of Molecular and Cellular Cardiology,2017,42(6).
[8].Effect of CD86 blockage on the expressions of TGF-β1,MMP-9,TIMP-3 and PAI-1 proteins and outcome of pregnancy in murine abortion-prone model[J].Journal of Microbiology and Immunology,2016(02):137-145.
[9]张士胜,王康孙,王玲,朱彩红,石海云.MMP-9及TIMP-3在小鼠脉络膜新生血管形成中的作用[J].上海第二医科大学学报,2017(03):206-209.
论文作者:郑建军 盛力翔 熊文武 龚厚武
论文发表刊物:《医师在线（学术版）》2019年第17期
论文发表时间:2019/10/28
标签：胃癌论文; 组织论文; 蛋白论文; 阳性论文; 肿瘤论文; 细胞论文; 统计学论文; 《医师在线（学术版）》2019年第17期论文;