常州市第一人民医院心内科 江苏常州 213003
摘要：目的 探讨ghrelin对大鼠心肌梗死后心室重构的疗效及其作用机制。方法 采用结扎左冠状动脉前降支制作大鼠心肌梗死模型，48只SD雄性大鼠随机分为假手术组（n=16）、心肌梗死组（n=16）及ghrelin给药组（n=16）。给予ghrelin干预4周后分别行血流动力学、超声心动图检测大鼠心脏功能，采用Luminol和Lucigenin化学发光实验检测活性氧族生成水平；使用RT-PCR和Western blotting方法检测心肌核因子相关因子2其下游抗氧化因子醌氧化还原酶1、抗氧化酶血红素加氧酶1基因和蛋白表达水平。结果 Ghrelin干预心肌梗死大鼠后4周，左心室收缩压、左心室压最大上升速率、左心室压最大下降速率、射血分数和左心室短轴缩短分数均显著改善，左心室收缩末期内径和收缩末期容量亦明显提高。Ghrelin组心肌核因子相关因子2及其下游靶基因抗氧化因子醌氧化还原酶1、抗氧化酶血红素加氧酶1转录及蛋白表达相较于对照组显著升高。结论 Ghrelin能够改善心肌梗死大鼠心脏功能，其作用机制可能与调控Nrf2/ARE抗氧化信号通路有关。
关键词：心肌梗死；Ghrelin；核因子相关因子；氧化应激
心肌梗死发生后，由于血液动力学的介导及神经内分泌系统激活的作用，心室会发生重构，是发生慢性心功能不全的主要病理生理学基础，进而影响疾病转归。现有观点认为，心肌梗死后，活性氧族（Reactive Oxygen Species，ROS）是心室重构过程一系列级联反应的始动环节。前期研究表明，心肌梗死后OS水平明显升高，ROS生成增加，给予抗氧化剂干预后，可有效改善梗死后心室重构，抑制心衰进展[1]。Ghrelin是一种含有 28个氨基酸残基的小分子内源性脑肠肽，其主要由胃底泌酸腺的 X/A2细胞合成，但在心、肺、小肠、胰腺、肾脏、胎盘、脂肪组织等亦有分泌[2]。现有研究表明，ghrelin 除已公认的促进生长激素释放、改善食欲、调节胃肠动力、抑制胰岛素抵抗等生物学效应外，还具有其他潜在效能，如心血管保护功能[3]，但对心梗后心室重构的影响及其作用机制尚不清楚。本研究采用ghrelin干预大鼠心肌梗死模型，通过超声心动图判定其疗效，并通过观察ROS生成水平及心肌核因子相关因子2（Nrf2）/抗氧化反应元件（antioxidant response element，ARE）抗氧化通路表达变化研究其作用机制。
1. 材料与方法
1.1 主要材料和仪器
SD大鼠购自扬州大学实验动物中心；ghrelin购自美国Tocris bioscience公司；PCR引物由上海生工生物公司合成；兔抗鼠Nrf2、NQO1及HO-1 及内参兔抗鼠β-actin 抗体分别购自美国Santa Cruz及英国Abcam公司；Luminol和Lucigenin均购自美国Sigma-Aldrichi公司；多功能酶标仪购自美国Bio-Tek公司；高分辨率成像系统Vev02100购自加拿大VisualSonic公司；小动物呼吸机购自中国奥尔科特公司。
1.2 大鼠心肌梗死模型的建立和分组
用10 %水合氯醛（400 mg/kg）腹腔注射麻醉后，气管插管连接小动物呼吸机，暴露心脏，5-0丝线结扎冠状动脉左前降支近端，结扎后心室前壁局部变白，以心电图肢体导联ST段背弓抬高0.2mV以上为造模成功标志。假手术组只穿线，不结扎。实验用SD大鼠共48只，分为假手术组（n=16）、心肌梗死组（n=16）和ghrelin组（n=16）。术后ghrelin组采用ghrelin（100 μg/kg）腹腔注射，心肌梗死组和假手术组予等体积生理盐水腹腔注射，各组均予干预4周。
1.3 血流动力学评估
10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，游离结扎颈总动脉远端和近端，靠远心端结扎线处采用眼科剪剪一个“V”形小缺口，向心方向插入与压力换能器连接并充满肝素盐水的PE-50管约2.5cm，稳定15分钟后，采用多导生理记录仪测量左心室舒张期末压（left ventricular end-diastolic pressure，LVEDP）、左心室收缩压（left ventricular systolic pressure，LVSP）、左心室压最大上升速率（+dp/dtmax）及左心室压最大下降速率（-dp/dtmax）。
1.4 心脏超声心动图检测
造模4周后，10 %水合氯醛麻醉大鼠，采用小动物高频超声探头（15 MHz）行心脏形态和功能检测，取胸骨旁左室长轴和乳头水平短轴切面。在3个连续心动周期中测量取平均值，计算左心室舒张期末内径（left ventricular end-diastolic diameter，LVEDD）、左心室收缩 期末内径（left ventricular end systolic diameter，LVESD）、左心室后壁厚度、室间隔厚度（IVS）及左心室射血分数（LVEF）。
1.5 心肌ROS水平检测
采用Luminol和Lucigenin化学发光法测定心梗后心肌ROS水平。称取约50 mg的大鼠心肌组织样品，用眼科剪尽量将其剪碎。将样品浸润于预先配置好的PBS-HEPES 反应液（pH 7.2，20 mM HEPES in 0.5 M PBS）里，随后加入适量的 Luminol和Lucigenin，保证两者浓度至0.2 mM。充分混匀后迅速将其放入分光光度计中，反应时间为 5 分钟。结果标准化到每1 mg心肌组织的相对光单位。
1.6 心肌Nrf2通路及下游抗氧化酶mRNA表达
使用实时荧光定量PCR方法测定心肌梗死后心肌Nrf2及其下游抗氧化应激酶NQO1、HO-1、TRX基因水平。于相应时间点安乐死大鼠，取梗死灶周心肌组织，采用Trizol法提取总RNA，用微量分光光度计（Nanodrop 1000）测量总 RNA 纯度和浓度。逆转录为cDNA 模板，ABI 7500 型荧光定量PCR仪测定待测基因及内参照β-actin 扩增各循环荧光信号，计算其ΔCt值。各组均设副孔3个，重复实验3次。
1.7 心肌Nrf2通路及下游抗氧化酶蛋白表达
提取梗死灶周心肌组织蛋白，12 %聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，转膜后分别加一抗 Nrf2（1：1000）、HO-1（1：600）、TRX（1：1000）及β-actin（1：5000）4 ℃孵育过夜。加二抗室温下孵育2 h，洗膜后用增强型ECL显色液在暗室中曝光显影。采用Quantity One软件定量分析各组蛋白表达差异，分别计算Nrf2、HO-1、TRX与β-actin条带灰度值的百分比，作为蛋白表达量。
1.8 统计方法
数据均以均值±标准差来表示。统计分析用 SPSS16.0 统计软件分析。不同组间的数据统计采用 Student-Newman-Keuls 单因素方差分析。
期刊文章分类查询,尽在期刊图书馆P值小于0.05认为具有统计学显著性差异。
2. 结果
2.1 Ghrelin对血流动力学的影响
大鼠心肌梗死造模后4周内，造模组较假手术组大鼠均出现了精神萎靡、进食减少、毛发灰暗等表现。与假手术组相比较，心肌梗死组和ghrelin组大鼠 LVSP、+dp/dtmax及-dp/dtmax均出现明显下降（P＜0.05），但ghrelin组明显高于心肌梗死组（P＜0.05）。心肌梗死组和ghrelin组LVEDP均明显高于假手术组（P＜0.05），但ghrelin组明显低于心肌梗死组（P＜0.05）。
2.2 Ghrelin对超声心动图结果的影响
与假手术组相比较，心肌梗死组和ghrelin组大鼠IVS、LVEDD 和LVESD 均明显升高（P＜0.05），而LVEF明显下降（P＜0.05）；而ghrelin组IVS和LVEDD相较于较心肌梗死组均出现明显下降（P＜0.05），而LVEF相较于心肌梗死组明显升高（P＜0.05）。
2.3 Ghrelin对ROS的影响
心肌梗死组和ghrelin组大鼠心肌组织内 luminol及lucigenin相对光单位均高于假手术组（P＜0.05）。当结扎造模后给予ghrelin干预后，luminol及lucigenin 相对光单位均明显下降（P<0.01）。
2.4 Ghrelin对Nrf2通路及下游抗氧化酶mRNA表达的影响
与假手术组相比较，心肌梗死组和ghrelin组大鼠Nrf2及其下游NQO1、HO-1、TRX mRNA表达水平相较于对照组显著升高（P＜0.05）；ghrelin组Nrf2及其下游NQO1、HO-1、TRX mRNA表达水平相较于较心肌梗死组均出现明显增高（P＜0.05）。
2.5 Ghrelin对Nrf2通路及下游抗氧化酶蛋白表达的影响
心肌梗死组和ghrelin组大鼠心肌组织内Nrf2及其下游NQO1、HO-1、TRX 蛋白表达水平均高于假手术组（P＜0.05）；ghrelin组Nrf2及其下游NQO1、HO-1、TRX 蛋白表达水平相较于较心肌梗死组明显增高（P＜0.05）。
3. 讨论
心脏重塑是心肌梗死后的主要生理病理过程，其最直接的结果是导致心脏泵血功能的不断降低，进而发展为慢性心力衰竭导致死亡[4]。新近研究表明，心肌梗死后ROS大量生成，诱发氧化应激，造成脂质、蛋白质及DNA的氧化损伤，影响心肌细胞正常结构和功能，导致梗死后心室发生重构，而抑制ROS生成可有效扭转心梗后心室重构，改善预后。
近年来，多种疾病模型实验发现ghrelin具有清除 ROS和抑制氧化应激的能力，如肿瘤[5]、肥胖[6]及慢性肾损伤[7]等。Luminol和Lucigenin发光实验能够检测一系列的 ROS产物，如Luminol可以检测组织内 H2O2、HOCl、?OH等自由基水平，而Lucigenin能够检测氧自由基水平。本研究在大鼠心肌梗死模型中，给予100 μg /kg ghrelin治疗剂量4周，血流动力学和超声心动图证实可明显改善心梗后心室重构严重程度，Luminol和Lucigenin发光实验证明ghrelin可有效减少心梗后ROS生成，抑制氧化应激，从动物模型水平证明了ghrelin可通过减少ROS生成进而减轻心肌梗死后心室重构。
新近研究表明，Nrf2/ARE信号通路是机体内源性调控氧化应激的核心通路[8]。生理情况下，Nrf2与 Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白-1（kelch - like ECH - associated protein-1，Keap1）结合稳定，其抗氧化能力被抑制。但当机体处于病理氧化应激状态下，Nrf2 与Keap1解离，进入细胞核与核上ARE相结合，进而启动下游一系列抗氧化酶的转录，包括 NQO1、HO-1、TRX等。本研究采用ghrelin干预大鼠心肌梗死模型，发现ghrelin可明显上调 Nrf2及其下游抗氧化应激关键酶 HO-1、NQO1及TRX、的基因及蛋白表达，表明Nrf2 /ARE信号通路在心梗后对心室重构的逆转作用。然而，由于动物来源限制，本研究未在Nrf2基因敲除大鼠心肌梗死模型中验证ghrelin对梗死后心室重构的影响，此为本研究不足之处。
综上所述，本研究说明ghrelin可显著扭转大鼠心肌梗死后心室重构，其作用机制可能通过激活内源性Nrf2/ARE抗氧化信号通路，上调Nrf2下游靶向抗氧化关键酶清除ROS生成有关。
参考文献：
[1]Murino Rafacho BP，Portugal Dos Santos P，Goncalves AF，et al. Rosemary supplementation（Rosmarinus oficinallis L.）attenuates cardiac remodeling after myocardial infarction in rats. PloS One. 2017；12：e0177521.
[2]Muller TD，Nogueiras R，Andermann ML，et al. Ghrelin. Mol Metab. 2015；4：437-460.
[3]Lilleness BM，Frishman WH. Ghrelin and the cardiovascular system. Cardiol Rev. 2016；24：288-297.
[4]Seropian IM，Toldo S，Van Tassell BW，et al. Anti-inflammatory strategies for ventricular remodeling following ST-segment elevation acute myocardial infarction. J Am Coll Cardiol. 2014；63：1593-1603.
[5]Parthasarathy A，Gopi V，Devi K M S，et al. Aminoguanidine inhibits ventricular fibrosis and remodeling process in isoproterenol-induced hypertrophied rat hearts by suppressing ROS and MMPs. Life Sci. 2014；118：15-26.
[6]Buldak RJ，Pilc-Gumula K，Buldak L，et al. Effects of ghrelin，leptin and melatonin on the levels of reactive oxygen species，antioxidant enzyme activity and viability of the HCT 116 human colorectal carcinoma cell line. Mol Med Rep. 2015；12：2275-2282.
[7]Omrani H，Alipour MR，Mohaddes G. Ghrelin improves antioxidant defense in blood and brain in normobaric hypoxia in adult male rats. Adv Pharm Bull. 2015；5：283-288.
[8]Done AJ，Traustadottir T. Nrf2 mediates redox adaptations to exercise. Redox Biol. 2016；10：191-199.
论文作者:童德兵,王群立,孙建辉（通讯作者）
论文发表刊物:《健康世界》2017年21期
论文发表时间:2017/12/25
标签：心肌梗死论文; 大鼠论文; 心室论文; 心肌论文; 抗氧化论文; 下游论文; 水平论文; 《健康世界》2017年21期论文;