方香玲[1]2008年在《昆虫病原线虫共生菌的鉴定、培养及其抑菌活性研究》文中认为昆虫病原线虫共生菌代谢产物在医药卫生和农业领域具有抗细菌、抗真菌、杀虫、杀线虫、抗病毒、抗癌等多种生物活性,是一类新型的具有较大开发潜力和广泛应用前景的生物资源。前期研究发现,从陕西杨凌、太白山筛选的3株昆虫病原线虫中分离的共生菌YL001、YL002和TB菌株代谢物具有较强的抑菌活性,为进一步确定其分类及系统进化地位,并为该生物资源的后续研究及开发应用奠定基础,本论文对其分类地位、培养及抑菌活性进行了研究,得出以下主要研究结果与结论:1. PCR扩增、克隆并测定了YL001、YL002和TB菌株16S rRNA全序列,将此序列与GenBank中该类菌部分已知种的16S rRNA序列进行同源性比较及聚类分析。在构建的系统发育树中,3株菌与嗜线虫致病杆菌(Xenorhabdus nematophila)种内菌株形成一个类群,序列同源性均大于99%,且位于不同分支。结合前期生理生化等特征的鉴定结果,认为YL001、YL002和TB菌株属于嗜线虫致病杆菌种内的不同菌株。2. 3株菌对供试的26种病原真菌均有不同程度拮抗作用,不同菌株对不同病菌的拮抗作用不同,但均对辣椒疫霉病菌有很强的拮抗作用;3株菌胞外代谢物对病原菌菌丝生长的抑制作用有较大差异,但其10倍稀释液对辣椒疫霉、番茄灰霉、油菜菌核和小麦根腐病菌的抑制率都在90%以上;对金黄色葡萄球菌抑制作用最强,抑菌圈直径达30 mm;活体组织试验表明3菌株对番茄灰霉病防效均在65%以上,不同菌株治疗和保护效果存在差异,其中YL002菌株治疗效果最好(77.31%),TB菌株保护效果最好(75.30%);对番茄灰霉病、辣椒疫霉病和黄瓜霜霉病的防效均在60%以上,其中YL001菌株对黄瓜霜霉病治疗效果最好(78.21%),YL002菌株对番茄灰霉病保护效果最好(77.73%),TB菌株对辣椒疫霉病保护效果最好(76.13%),TB菌株对小麦白粉病防效在60%以上,优于其他菌株,仅TB菌株对玉米大斑病有一定的保护效果。3株菌胞外代谢物甲醇提取物对供试菌菌丝生长均有较强抑制作用,其中YL001菌株对辣椒疫霉病菌、YL002菌株对番茄灰霉病菌、TB菌株对油菜菌核病菌菌丝生长的抑制作用最强,EC50分别为:35.11、42.16和18.95 mg/L;对供试菌孢子萌发亦有较强抑制作用,其中对玉米大斑病菌抑制作用最强,EC50分别为28.03、36.77和26.40 mg/L;1000 mg/L时,对番茄灰霉病的防效均在70%以上(活体组织法),对番茄灰霉病和辣椒疫霉病的防效均在65%以上,不同菌株治疗和保护效果存在差异(盆栽试验)。3株菌胞内代谢物乙醇提取物抑菌活性测定结果表明:1000 mg/L时,对辣椒疫霉病菌菌丝生长的抑制率在80%以上;不同菌株乙醇提取物对番茄灰霉病的防效不同,其中YL002菌株的治疗和保护效果最好,分别为79.16和61.66%(活体组织法);盆栽试验表明YL002菌株对番茄灰霉病、辣椒疫霉病和黄瓜霜霉病的治疗效果最好,分别为82.19%、70.75%和81.12%,TB菌株对其保护效果最好,分别为74.40%、65.87%和78.92%。3.培养特性研究结果表明YL001、YL002和TB菌株的生长符合细菌生长的一般规律,发酵液中主要营养成分还原糖和氨基氮含量的变化趋势相似:在培养前期还原糖和氨基氮含量均迅速下降,后期保持相对稳定;其适宜发酵周期分别为54、66和60h。4.综合运用Plackett–Burman设计和响应面等方法对TB菌株发酵工艺进行了整体优化。TB菌株最佳发酵培养基组成为(g/L):蛋白胨25.60、葡萄糖5.00、NaCl 5.00、K2HPO4 2.50;最佳发酵条件为:发酵时间54.07 h、初始pH 7.59、接种量9.95%、种龄(OD600: 2.00),装液量(100/250 mL)、转速150 rpm、温度25°C。最佳工业发酵培养基组成为(g/L):麸皮10.00、棉饼粉24.20、豆饼粉6.41、NaCl 5.00、K2HPO4 5.00;最佳发酵条件为:发酵时间72 h、种龄(OD600: 2.00)、装液量(50/250 mL)、初始pH 7.96、接种量10.02%、转速150 rpm。优化后TB菌株的抑菌活性较优化前分别提高了73.52%和82.58%。5.不同培养方式对TB菌株生长和抗菌活性的研究结果表明70L发酵罐培养最有利于TB菌株的生长,DCW达16.70 g/L,较摇瓶和5L发酵罐分别增加25.85%和41.41%;摇瓶培养最有利于抑菌物质的产生,抑菌活性达358.3 U/mL,较5L和70L发酵罐分别增加10.83%和14.36%。6.以番茄灰霉病菌和枯草芽孢杆菌为靶标菌,采用活性跟踪法,对TB菌株代谢物抑菌活性成分进行了分离。从胞内代谢物中分离出1种具有抑菌活性的化合物,结构已初步确定,为双(1-羟基-2-甲氧基乙酯)邻苯二甲酸酯;从胞外代谢物中分离出5种具有抑菌活性的化合物,其结构正在鉴定之中。活性测定结果表明:0.5 mg/mL时,4#和5#对番茄灰霉病菌菌丝生长的抑制作用较强,分别为69.1%和72.8%;4#、5#和6#对枯草芽孢杆菌的抑制作用较强,抑菌圈直径分别为10.9、11.6和10.2 mm。
孟亚莉[2]2004年在《昆虫病原线虫共生细菌高毒力菌株的筛选及杀虫活性物质的研究》文中研究表明为寻找新的杀虫毒素资源，开发新的杀虫毒素基因，本研究自九个昆虫病原线虫品系中分离共生菌菌株80株，用生物测定方法对共生菌菌株的杀虫活性进行评价，从中筛选高毒力菌株，研究其杀虫活性物质，初步开展了共生菌杀虫毒素的纯化工作，主要结论如下： 以玉米螟为供试昆虫，对80个菌株进行了胃毒毒力和体重抑制率的测定，从中筛选出A24-6R、A24-1B和A24-19B叁个菌株为高毒力菌株，进一步进行杀虫活性物质研究。 在血腔毒力测定中，叁个高毒力菌株在10cell／μl的菌液浓度下仅需10μl48h内就能使大蜡螟老熟幼虫在全部死亡。高毒力菌株中A24-1B为长杆形细菌，A24-6R为短杆形细菌。 在对叁个高毒力菌株相关影响因子的研究中表明，叁个高毒力菌株经高温50℃处理10min后，杀虫活性均有所降低，但对玉米螟幼虫仍有较高的体重抑制率；经高温100℃处理10min后，叁菌株均丧失了杀虫活性，对玉米螟幼虫体重抑制率较低；叁个高毒力菌株在18W紫外灯照射下，随着照射时间的延长，对玉米螟的杀虫死亡率和校正死亡率都呈逐渐下降的趋势，在紫外照射120min时，完全丧失杀虫活性。通过对叁个高毒力菌株生长曲线的测定，可知Ⅱ型菌A24-6R比Ⅰ型菌A24-1B和A24-19B的繁殖速度快。 以A24-19B为供试菌株，研究不同培养时间对高毒力菌株杀虫活性的影响，结果表明A24-19B菌株发酵液对玉米螟的杀虫校正死亡率和体重抑制率随着培养时间的延长呈波浪形升高趋势。A24-19B的发酵液对玉米螟初孵幼虫的LC_(50)为7.46×10~9 cell／ml。 测定了叁个高毒力菌株对小菜蛾(Plutella xylostella)、甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)、粘虫(Mythimna separata)、黄粉虫(Tenebrio molitor)幼虫的胃毒毒力，结果表明，除黄粉虫外，对其余叁种供试鳞翅目昆虫幼虫均表现较高的胃毒毒力，具有较广泛的杀虫谱。 提取了叁个共生菌高毒力菌株的杀虫活性物质，并初步进行了纯化，得到杀虫毒素粗提物，在提纯过程中，杀虫活性没有降低。
刘霞[3]2006年在《昆虫病原线虫共生菌YL001菌株的代谢产物及其抑菌活性研究》文中提出昆虫病原线虫共生菌Xenorhabdus和Photorhabdus能产生多种具有抑菌、杀虫、杀线虫、抗溃疡、抗肿瘤和抗病毒活性的代谢产物,因此在农业和医药卫生领域具有较大开发潜力和应用前景,已成为一类重要的新型生物资源。本研究以从陕西杨凌筛选的昆虫病原线虫Steinernema sp中分离鉴定的共生菌X. nematophila YL001菌株为试验材料,对其代谢产物的农用抑菌活性、抑菌活性成分的分离与鉴定、抑菌作用方式及作用机理和制剂等进行了系统研究,得出以下主要研究结果及结论:1.采用抑制菌丝生长速率法、抑制孢子萌发法、活体组织法和盆栽试验法系统测定了YL001菌株细胞外代谢产物对植物病原真菌的抑制作用。结果表明,在离体条件下,其对供试的15种植物病原真菌菌丝生长均有一定抑制作用,对番茄灰霉病菌和辣椒疫霉病菌的抑制作用最强,EC_(50)分别为53.54mg·L~(-1)和90.39mg·L~(-1);对供试的6种植物病原真菌的孢子萌发均有一定抑制作用,其中对番茄灰霉病菌和烟草赤星病菌孢子萌发有较强的抑制作用,EC_(50)分别仅为16.97mg·L~(-1)和21.87mg·L~(-1);活体组织法测定表明,在0.389g·L~(-1)剂量下,其对番茄灰霉病的保护效果为74.98%,治疗效果为63.50%;盆栽试验表明,对番茄灰霉病的保护效果为65.11%,治疗效果为54.64%。以上结果说明,YL001菌株的细胞外代谢产物具有较广的抑菌谱和较强的抑菌活性。2.采用抑制菌丝生长速率法、抑制孢子萌发法和活体组织法系统测定了YL001菌株细胞内代谢产物的乙醇提取物对植物病原真菌的抑制作用。结果表明,YL001菌株细胞内代谢产物的乙醇提取物对供试的10种植物病原真菌的菌丝生长有不同程度的抑制作用,其中对番茄灰霉病菌和辣椒疫霉病菌菌丝生长的抑制作用最强,72h的EC_(50)分别为54.29 mg·L~(-1)和58.96mg·L~(-1);对供试的7种植物病原真菌的孢子萌发均有一定的抑制作用,其中对番茄灰霉病菌和番茄叶霉病菌的孢子萌发抑制作用最强,EC_(50)分别是267.36mg·L~(-1)和96.48mg·L~(-1);供试浓度为10mg·mL~(-1)时对番茄灰霉病的保护效果为64.81%,治疗效果为62.03%。说明YL001菌株的细胞内代谢产物亦具有较广的抑菌谱和较强的抑菌活性。3.以番茄灰霉病菌和蜡状芽孢杆菌为示踪生物,对YL001菌株的细胞内代谢产物和细胞外代谢产物进行了抑菌活性成分的分离。从细胞内代谢产物中分离出5种具有抑菌活性的化合物,其中4种(1#,3#,4#和5#)结构已初步确定,分别为,6-α,β,γ亚甲基-N~2-1,3,N~2,N~4-环丁二内酰胺、2,3-二甲基-β-氨基丁酸-甘氨酸环二肽、β,γ亚甲基取代γ内酯和N-甲基-乙二酰胺,6#化合物的结构正在鉴定之中。生测结果表明,在0.5mg·mL~(-1)的供试浓度下,1#、3#、4#和5#化合物对番茄灰霉病菌菌丝生
王永宏[4]2005年在《昆虫病原线虫共生菌培养与活性研究》文中研究表明昆虫病原线虫共生菌是寄生于昆虫病原线虫肠道内的一类细菌,属肠杆菌科(Enterobacteriaceae ),包括致病杆菌属(Xenorhabdus)和光杆状菌属(Photorhabdus),分别与斯氏线虫属(Steinernema)和异小杆线虫属(Heterorhabditis)线虫共生。据报道,Xenorhabdus 和 Photorhabdus 能产生多种代谢产物,这些代谢产物不仅具有多种化学结构,而且在医疗卫生和农业上具有广泛的生物活性,如抑菌、杀虫、杀线虫、抗溃疡、抗肿瘤和抗病毒活性。特别是具有较高杀虫活性的胞外毒蛋白及其基因的发现,为生物农药的开发和抗虫基因工程提供了新的微生物杀虫资源和杀虫基因。昆虫病原线虫共生菌已成为一类新型的具有较大开发潜力和广泛应用前景的生物资源。关于昆虫病原线虫共生菌的代谢产物及其生物活性已有较广泛的研究,但对于昆虫病原线虫共生菌的培养发酵与次生代谢物产生关系的系统研究还是空白。因此,本研究以从陕西杨陵筛选的昆虫病原线虫 Steinernema sp YL001 和 Steinernema sp YL002 为材料,对其共生菌进行了分离鉴定,并对共生菌的培养发酵与生物活性进行了系统的研究,现将结果总结如下。 1. 昆虫病原线虫 Steinernema sp YL001 和 Steinernema sp YL002 共生菌的形态及生化特征分析表明,两种线虫共生菌的形态及生化特征分别与已描述的 X. nematophilus 和X.bovienii 种的特征基本一致,将其分别定名为 X. nematophilus YL001 和 X.bovieniiYL002。 2. X.nematophilus YL001 和 X.bovienii YL002 代谢物的生物活性研究表明,两菌株对大蜡螟和粘虫具有较高的血腔毒性,处理 48h 两菌株在不同培养时间的无菌滤液对大蜡螟的致死率均为 100%,粘虫的死亡率随共生菌培养时间的延长逐渐降低;对小菜蛾和棉铃虫的胃毒活性较低;两株共生菌的血腔毒素可能主要是蛋白类物质。 室内活性测定结果表明,YL001 和 YL002 对供试的 14 种植物病原真菌和 5 种病原细菌有不同程度的抑制作用。发酵液对烟草赤星菌、番茄早疫菌、南瓜枯萎菌、黄瓜炭疽菌、稻瘟菌、小麦纹枯菌和辣椒疫霉菌有较强的抑制作用,抑制率在 75～100%;无菌滤液仅对辣椒疫霉菌有较强的抑制作用,稀释 10 倍后的抑制率为 100%,EC50 分别为 16.3 ml/L 和 13.0 ml/L。盆栽实验表明,辣椒种子用 YL001 和 YL002 发酵液处理后,辣椒幼苗的疫霉病病株减退率分别为 60.6%和 73.2%;100ml/L 的发酵液处理土壤后,辣椒幼苗的疫霉病病株减退率分别为为 48.72%和 74.34%,而甲霜灵的病株减退率为64.10%。YL001 和 YL002 对水稻白叶枯菌和金黄色葡萄球菌有较强的抑制作用,对大肠杆菌和沙门氏菌抑制作用较弱。两菌株的抑菌活性物质对热较稳定,无菌滤液在 121℃(1.4Pa/cm2)处理 15min,对蜡状芽孢杆菌的抑菌圈直径较对照分别减小了 35.2%和
王欢[5]2002年在《昆虫病原线虫共生菌杀虫活性的研究》文中指出昆虫病原线虫共生细菌存在于昆虫病原线虫肠道内，二者互惠互生。该菌对昆虫有很强的致病力，特别是Bowen(1998)首次报道Photorhabdus luminescens的W-14菌株能产生对昆虫有胃毒活性和血腔活性的杀虫蛋白，引起了国际学者对共生细菌的关注，已成为国际研究热点。 本文从河北省内采集的斯氏线虫Steinernema sp.HB310、异小杆线虫Heterorhaditis sp.HB35、H.sp.HB89、H.sp.HB140共四个品系的昆虫病原线虫中，分离了124株共生菌菌株，生物测定结果表明，来自Steinernema sp.HB310线虫品系的共生菌胃毒毒力较高，对棉铃虫(Helicoverpa armigera)的生长有明显的抑制作用，平均体重抑制率可达96.30％，从这一品系的共生菌中选出高毒力菌株HB310-27，对其杀虫毒素进行了初步提取，杀虫毒素粗提物具有较高的胃毒活性，对棉铃虫的体重抑制率可达96.04％。 利用高毒力菌株对不同昆虫进行生物测定，结果表明高毒力菌株HB310-10、HB310-23对大蜡螟/Galleria mellonella)有较高血腔毒力，HB310-10的LC_(50)仅为10.19个细胞；HB310-19、HB310-27、HB310-37、HB310-59菌株对小菜蛾(Plutella xylostella)、菜粉蝶(Pieris rapae)幼虫均有很高胃毒毒力，HB310-59菌株72h可使小菜蛾的校正死亡率达100％，120h可使菜青虫的校正死亡率达100％；HB310-27、HB310-59菌株对粘虫(Mythimna separata)的生长有一定的抑制作用，平均体重抑制率可达50％左右；另外HB310-27菌株对玉米螟(Ostrinia nubilalis)、黄粉虫(Tenebrio molitor)幼虫均有一定的胃毒毒力，对玉米螟、黄粉虫的生长有明显的抑制作用，平均体重抑制率分别为83.06％、63.38％。 不同因素对杀虫活性的影响研究结果表明HB310品系昆虫病原线虫共生菌经50℃高温处理10min，日光照射1h、20W紫外灯照射60min杀虫活性仍很稳定。 昆虫病原线虫共生菌具有型态变异(phase variation)的特征，本研究对高毒力菌株的初生型(Ⅰ型)菌株和次生型(Ⅱ型)菌株的杀虫毒力进行了测定，结果表明：无论在胃毒毒力方面还是在血腔毒力方面，Ⅰ型菌的杀虫活性均明显高于Ⅱ型菌，在血腔毒力上的差异更为明显，Ⅱ型菌基本无血腔毒力。 根据HB310品系线虫的形态特点以及线虫杂交实验，对HB310品系线虫及其共生菌的分类地位进行了初步鉴定，HB310品系线虫与S.carpocapsae线虫品系杂交后能产生正常后代，初步认为同属一个种，与这一种线虫共生的细菌为Xenorhabdusnematophilus，其分类地位，还有待于进一步鉴定。
王勤英[6]2004年在《嗜线虫致病杆菌杀虫蛋白的分离纯化及杀虫蛋白基因克隆》文中认为昆虫病原线虫共生菌属于肠杆菌科、革兰氏阴性菌，包含两个属—Xenorhabdus和Photorhabdus，分别与Steinernematidae和Heterorhabditidae科的昆虫病原线虫互惠共生。二者联合可以侵染并快速杀死多种昆虫。通常共生菌依靠线虫将其携带进入寄主昆虫体内并释放到昆虫体腔中，共生菌在昆虫血腔内大量繁殖并产生杀虫毒素，导致寄主昆虫迅速死亡(约48h之内)。同时共生菌产生的抗生素抑制杂菌生长，为线虫生长、发育和繁殖提供理想的环境和合适的营养。昆虫病原线虫—共生菌复合体对昆虫具有的强致病力，共生菌在其中起着关键性作用。已有的研究表明许多共生菌不仅能产生血腔毒素，同时还能产生杀虫谱广、杀虫活性高的胃毒素。因此分离筛选高毒力的共生菌菌株、对其杀虫毒素及其杀虫基因进行深入研究，有助于发掘新的杀虫蛋白及杀虫基因，有可能为改变当前害虫防治和转基因抗虫植物的培育中杀虫蛋白或杀虫基因匮乏的局面开辟一条新的途径。 本研究利用大蜡螟和黄粉虫土壤诱集法，从河北省各地的719份土样中的28份诱集到了昆虫病原线虫，有线虫率为3.89％。经初步鉴定25个为异小杆属线虫(Heterorhabditis)、3个为斯氏属线虫(Steinernema)。土样有线虫率与植被有关。以果园内最高，为8.64％，其次为菜地7.27％，杂草等未耕地为3.28％，大田作物为1.68％。通过取被感染大蜡螟血淋巴涂平板的方法，分别从这28个线虫品系中分离出28个共生菌菌株。 对从河北省分离的28个菌株和4个本室保存的菌株的部分16S rDNA序列进行PCR扩增和测序，与共生菌已知种的同源序列进行比较分析，构建了系统进化树，初步确定了这32个共生菌的分类地位。这些菌株明显分成嗜线虫致病杆菌和发光光杆菌2个簇，区别Photorhabdus和Xenorhabdus两个属的DNA碱基差异在383和503的位置(E.coli numbering)，所有的Xenorhabdus为G和A，而所有的Photorhabdus为A和C。 从河北省分离到的发光光杆菌大部分与P.luminescens关系密切，归属于叁个亚簇。其中HB89和HBgy相似性达100％，二者与P.luminescens laumondii亚种相似性达99％。来自河北省的HBxhl、HBxh5、HB3、HB140、HB8、HB06、HB36、HB73、HB141、HB202、HB231、HB237、HB287、HB288、HB301和HB352菌株很有可能是P.luminescens中的新亚种或新种。GZ139与P.temperam相似性为100％，可能是该种的一个品系。D1菌株与已知的P.luminescens akhurstii亚种同源性很高，可能为同一亚种。HB310和HBml均为X.nematophila中的品系；gw15可能是Xenorhabdus中的一个新种。 HB310菌株的Ⅰ型菌与Ⅱ型菌部分16S rDNA序列的相似性是100％。但是HB310菌株的I型菌与n型菌的形态特点、生理生化指标测定及杀虫活性存在较大的差异。I型菌的胃毒活性和血腔活性远远高于n型菌。11型菌的蛋白组份发生了很大的变化，H型菌的native一PAGE蛋白图谱上没有发现叁种与杀虫活性有关的蛋白区带，但是从I型菌和n型菌的基因组DNA中都扩增出同样大小的毒素基因片段。 x nemat叩hila HB310、Srio、HBml、A24和p luminesense HB202、DI、HBgy等多株共生菌对棉铃虫和小菜蛾等有较高的口服胃毒活性，其中X nem“toPhila所有品系的杀虫活性均高于其它种类的菌株。不同属、种及同种不同品系的共生菌对同种昆虫的胃毒活性差别很大，同一菌株对不同昆虫的毒力差别也较大。小菜蛾对共生菌是比较敏感的，尤nematOPhila HB3 10、Srio、HBml和p luminesense HBZoZ、DI、HBgy等6个菌株的发酵液在72h均可100%杀死小菜蛾2龄幼虫。 对HB310菌株杀虫活性的深入研究表明，该菌的杀虫谱较广，对鳞翅目和鞘翅目的10种昆虫都有胃毒活性，特别是小菜蛾、菜粉蝶、云斑粉蝶和马铃薯二十八星瓢虫等幼虫有很强的胃毒活性，其发酵液对四种幼虫在72h的致死率达到100%。对棉铃虫、甜菜夜蛾、玉米螟等幼虫的生长有很强的抑制作用。HB310菌株在对数生长初期已开始产生杀虫毒素，在对数生长中后期(15h)其杀虫活性己达到最高。 HB310菌株发酵液中的细胞和胞外上清蛋白提取物中都含有较强的血腔注射杀虫活性物质和口服胃毒素。通过native一PAGE从胞内蛋白提取物中分离出2种有胃毒活吐的蛋白组份(toxinx和toxin 11)和1种血腔注射活性的蛋白组份(toxin 111)，同时从胞外蛋白提取物中也分离到这叁种毒素。SDS一PAGE电泳图谱显示两种胃毒素分别含有3一4个多肤，而血腔毒素只看到一条带，可能是一种单体蛋白。纯化的血腔毒素对5龄大蜡螟幼虫血腔注射LD50为1 81 .sng/头。血腔毒素耐70℃处理10 min;胃毒素耐50℃处理10 min，对其杀虫活性无影响。血腔毒素能够破坏血细胞成碎片。 构建了X nematoPhila HB310基因组DNA粘粒文库。通过生物测定方法从Xnematophila HB310中筛选到对棉铃虫初孵幼虫有口服胃毒活性的2个克隆:pwEBZ16和pWEB338，pWEBZ16克隆的杀虫活性显着高于pWEB33s。pWEBZ16克隆对棉铃虫幼虫的口服毒力LCS。为9.5xlo’ocells/mL。 根据GenBank中x nematoPhila PMF12%致病岛上5个杀虫基因序列，设计了9对引物。用pCR的方法对pWEB216和pWEB338两个克隆进行了鉴定，从pWEB216?
杨保军[7]2005年在《嗜线虫致病杆菌北京变种CB6菌株杀虫蛋白的分离和纯化》文中提出嗜线虫致病杆菌北京变种(Xenorhabdus nematophila var.pekingensis)CB6菌株是从北京郊区土壤中分离的小卷蛾斯氏线虫(Steinernema carpocaposae)肠道内所分离到的共生细菌,已经鉴定并定名。研究表明该菌株具有良好的杀虫活性。为挖掘这一本土细菌资源,本研究将其与另9个昆虫病原线虫共生细菌菌株进行了杀虫活性比较,对10个不同来源的昆虫病原线虫共生菌菌株胞内和胞外产物进行分离,将各产物的可溶性蛋白提取,并分别进行生物测定,结果表明CB6菌株产杀虫蛋白性能好。在此基础上以CB6菌株作为研究材料,分离纯化其胞内和胞外的杀虫活性蛋白,建立一套纯化该活性蛋白的技术参数,并对杀虫蛋白的特性进行了初步鉴定。现将主要研究结果总结如下: 1.测定的10个菌株发酵液均对棉铃虫和甜菜夜蛾幼虫有口服毒性,活性物质的产生部位在菌体胞内和胞外均有。不同菌种或同一菌种的发酵液、胞内或胞外产物和菌体碎片的杀虫活性不尽相同,一般胞内产物的活性要高于胞外。胞内胞外总蛋白的生测结果初步断定10个供试菌株所表现出的杀虫活性物质主要是蛋白类。 2.建立了一条有效纯化CB6菌株杀虫蛋白的技术路线,通过该纯化层析方案能获得纯化倍数较高的目标蛋白。其基本参数包括: 硫酸铵盐析:最佳硫酸铵饱和度为20～50%;离子交换层析:使用DEAE Sepharose FF层析柱,洗脱低盐为25mM Tris-HCl(pH7.4),高盐为1mol/L NaCl;洗脱高盐体积范围15～30%;疏水层析:使用Butyl FF层析柱,洗脱高盐为3mol/L NaCl+25mM Tris-HCl(pH7.4),低盐为25mM Tris-HCl(pH7.4)。凝胶层析:使用Sephacryl S-200 16/10层析柱,洗脱buffer:25mM Tris-HCl(pH7.4)。 通过该纯化技术路线所获得的目标蛋白浓度为4.134μg/mL,表现出对棉铃虫初孵幼虫97.9%的生长抑制率。 3.从CB6菌株胞内和胞外所获得的目标蛋白native-PAGE表明分子量都大于669kD,电泳带位置相同。该目标蛋白SDS-PAGE表明,2个目标蛋白都只出现一条分子量约为220kD的带。纯化该目标蛋白的层析技术完全相同。这说明CB6菌株胞内和胞外所产的目标蛋白可能是同一种蛋白。 4.目标蛋白的紫外吸收光谱在250～290nm下有吸收值。蛋白染色试验结果表明,目标蛋白不是脂蛋白,也不是糖蛋白。 CB6菌株发酵液中具有杀虫活性的物质为蛋白质,该种蛋白质具有较高的生物活性,严重抑制棉铃虫幼虫的取食和生长发育。本研究首次报道了CB6菌株胞内和胞外所产杀虫蛋白具有相似性,为开展胞内胞外杀虫蛋白的来源关系的研究奠定基础。本研究所建立的纯化该类杀虫蛋白的技术路线,为研究该菌株杀虫蛋白的作用机理以及为该杀虫蛋白基因的克隆提供了依据和基础。
房云[8]2010年在《昆虫病原线虫共生菌菌株09FLYB1的分离鉴定及其杀虫毒素蛋白的分离纯化与活性研究》文中指出昆虫病原线虫共生细菌寄生于昆虫病原线虫肠道内,二者互惠共生。昆虫病原线虫共生菌属于肠杆菌科、革兰氏阴性菌,包含3个属：致病杆菌属(Xenorhabdus)、发光杆菌属(Photorhabdus)和沙雷氏菌属(Serratia),分别与斯氏科(Steinernematidae)、异小杆科(Heterorhabditidae)和小杆科拟异小杆属(Heterorhabditidoides chongmingensis)线虫共生。利用大蜡螟幼虫诱捕线虫的方法从宜兴土样中的分离出一种昆虫病原线虫,标记为09FLY1。从该线虫体内分离到一株杀虫活性较强的共生菌菌株09FLYB1。该菌株为革兰氏阴性菌,有鞭毛,无芽孢,菌体呈短杆状。通过构建菌株09FLYB1 16S rDNA系统发育树,结合生理生化性状从而确定其为沙雷氏菌属细菌。16S rDNA同源性比对分析表明菌株09FLYB1与Serratia nematodiphila DZ0503SBS1T和Serratia marcescens subsp. Sakuensis KREDT的同源性最高,都是99.855%；菌株09FLYB1的生理生化性状与Serratia nematodiphilaDZ0503SBS1T最为接近,只有3个性状不同；数值分类结果显示菌株09FLYB1也与Serratia nematodiphila DZ0503SBS1T的相似性系数最大(0.86)；这些结果表明菌株09FLYB1是Serratia nematodiphila的一个菌株。共生菌菌株09FLYB1的生长曲线测定表明符合一般细菌的生长规律,共生菌在对数生长初期即产生胞外杀虫蛋白,在对数生长末期(28 h)血腔毒力达到最大,此时昆虫死亡率为100%,确定共生菌菌株胞外杀虫蛋白最优发酵时间为28 h。测定09FLYB1发酵液上清对大蜡螟初孵幼虫和老熟幼虫的毒力。当1 g人工饲料中添加100肛g发酵液脱盐冻干粉时,168 h后初孵幼虫的校正死亡率为32.6%,存活幼虫的体重抑制率为48.2%。发酵液上清液中的杀虫物质对蛋白酶K敏感,上清液经蛋白酶K水解处理后杀虫活力下降很大,死亡率仅为8.3%；表明发酵液中杀虫活性主要组分为蛋白质。用不同浓度的病原菌发酵液对大蜡螟老熟幼虫的血腔毒力测试结果表明,菌株发酵液中粗蛋白对大蜡螟老熟幼虫的半数致死浓度为1.7μg·μL-1。09FLYB1胞外杀虫蛋白粗提物冻干粉经Sephadex G-75凝胶层析出现2个峰,分别标记为09FLYB1G-Ⅰ和09FLYB1G-Ⅱ.1g人工饲料中分别添加100μg 09FLYB1G-Ⅰ和09FLYB1G-Ⅱ冻干粉检测胃毒活力,168 h后09FLYB1G-Ⅰ对昆虫的校正死亡率为52.8%,存活幼虫的体重抑制率为75.3%；09FLYB1G-Ⅱ对昆虫的校正死亡率为11.5%,存活幼虫的体重抑制率为25.6%。该结果显示09FLYB1G-Ⅰ为胃毒力活性峰。检测血腔毒力时,向每头大蜡螟体内注射10μL浓度为2μg·μL-1杀虫蛋白冻干粉溶解液,09FLYB1G-Ⅰ的校正死亡率为94.7%,09FLYB1G-Ⅱ的校正死亡率为25%,表明09FLYB1G-Ⅰ为血腔毒力活性峰。将09FLYB1G-Ⅰ过DEAE Sepharose FF阴离子交换柱,得到1个峰,标记为09FLYB1D-Ⅰ。检测胃毒活力时,按照1 g人工饲料中添加100μg冻干粉的比例添加09FLYB1D-Ⅰ,09FLYB1D-Ⅰ校正死亡率为53.6%体重抑制率为78.2%。检测血腔毒力时,向每头大蜡螟体内注射10μL浓度为2μg·μL-1杀虫蛋白冻干粉溶解液,09FLYB1D-Ⅰ校正死亡率为100%。非还原性SDS-PAGE图谱和还原性SDS-PAGE显示,杀虫蛋白经过分子筛和离子柱分离纯化后,在分子量50 kDa附近有一明显蛋白条带,表明该蛋白只有一个亚基。根据非还原性SDS-PAGE图谱计算该杀虫蛋白的相对分子质量约为53.24 kDa,标记为09FLYB1P53。进一步测定杀虫蛋白09FLYB1P53对大蜡螟幼虫致死中浓度(LC50),杀虫蛋白09FLYB1P53的血腔毒力半数致死浓度为0.4μg·μL-1;胃毒毒力半数致死浓度为96.94μg·g-1.
刘峥[9]2003年在《嗜线虫致病杆菌CB6菌株杀虫活性相关分子机制》文中研究说明致病杆菌属(Xenorhabdus)和光杆状菌属(Photorhabdus)细菌是一类与昆虫病原线虫共生的细菌，在20世纪90年代才确定其在肠杆菌科(Enterobacteriaceae)中的分类地位。1998年首次报道从发光光杆状菌(P.luminescens)W14菌株中分离到口服杀虫活性毒素蛋白基因，从此对该类细菌杀虫蛋白基因的研究成为本领域的热点。同时，共生细菌代谢物对害虫的杀虫和抑制生长活性也引起了新型微生物农药研究者的兴趣。为更好地开发昆虫病原线虫共生细菌这一新型杀虫微生物资源，有必要开展此类细菌杀虫活性相关分子机制的研究，国际上此类研究尽管活跃，也还处在起步阶段，国内尚未见有关此类细菌杀虫活性分子机制方面的研究报道。本研究在对30株共生细菌的杀虫活性进行生物测定的基础上，以研究组在北京郊区土样中分离到的小卷蛾斯氏线虫的共生细菌——嗜线虫致病杆菌(X.nematophila)CB6菌株为主要研究对象，利用PCR和AFLP指纹图谱分析等分子生物学技术，对嗜线虫致病杆菌CB6菌株的杀虫活性相关分子机制进行了研究。主要研究结果如下： 1) 对30株不同种共生细菌发酵液的口服杀虫活性测定结果表明，供试的大多数菌株对棉铃虫(Helicoverpa armigera)和菜青虫(Pieris rapae)幼虫具有一定的致死、抑制生长和拒食活性；不同种共生细菌杀虫活性不同，其中嗜线虫致病杆菌杀虫活性较高，对棉铃虫初孵幼虫的致死率为89.3％；同一菌株对不同龄期的昆虫毒性亦不同，嗜线虫致病杆菌CB6菌株对棉铃虫初孵幼虫的致死率为88.7％，对3龄幼虫的生长抑制率为95.1％，对5龄幼虫的拒食活性为83.6％。 2)利用特异引物从杀虫活性不同的4个菌株CB6、CB33、CB43和CB54中扩增到杀虫基因片断cb6A1、cb33A1、cb43A1和cb54A1，它们的核苷酸序列具有高度的同源性。并且发现在cb43A1、cb54A1的1038位点缺失1个碱基—鸟嘌呤G，造成移码突变。杀虫蛋白基因内部的点突变，可能是不同菌株杀虫活性不同的原因之一。 3)构建了嗜线虫致病杆菌CB6菌株杀虫蛋白基因片断cb6A1的非融合表达载体pBV221-cb6A1-1和融合表达载体pGEX-KG-CB6A1-2，并在大肠杆菌中获得表达，用含有非融合表达蛋白的人工饲料(20μg重组蛋白/g饲料)饲喂棉铃虫初孵幼虫，3天后幼虫死亡率为91．盯％，证明CMI杀虫蛋白基因片断表达蛋白具有一定的杀虫活性。4）通过对m6菌株I、I工型菌注射和日服杀虫活性的测定，证明I型菌比厂型菌具有较高的杀虫话性。以Cn6菌株为材料，首次对I、门型茵mS，RNA序列和杀虫蛋白基回片断序列进厅对比，发现I、工工型菌m厂MA序列存在差异，两者的同源性为99．8弧，而杀虫蛋白基回片断的核昔酸序列完全相同。5 ） 利用 AFLP技术对 CB6茵株 I、11型菌基因组MA进行指纹图谱分析，获得了8个I、11型菌DNA—AFLD差异片断。Ge。fis。k同源比对表明，其中7个基回片断在致病杆菌属（丫e。O厂人。b加 和光杆状菌属（尸hO ZO。h。b巾lJ细菌中为首次分离。推测的氨基酸序列分析表明，这8个差异基因片断是与细菌转录调节、能量代谢和膜蛋白生物合成及功能相关的基回片断。Ge。BaJ止 登录号分别为AY317150，AY：317151，AY317152，AY317153，AY321438，AY321439，AY321440，AY321441。这一结果发现了同一菌株的卜I工型菌在DNA水平上的差异，表明型态变异的发生是共生细菌遗传不稳定性的反［l山。
王立霞[10]2000年在《Xenorhabdus bovienii A54菌株杀虫物质的研究》文中认为昆虫病原线虫共生细菌寄生于昆虫病原线虫肠道内，二者互惠共生。该菌对昆虫有很强的致病力，大部分共生菌注射到昆虫血腔内，LD_(50)仅为1-10个活细胞。Bowen（1998）首次报道Photorhabdus luminescens的W-14菌株能产生对昆虫有胃毒活性和血腔毒性的杀虫蛋白，这一结果引起了国际学者对共生细菌的关注，因此有关该菌杀虫物质及其杀虫机制的研究日益成为国际研究的热点。我国对昆虫病原线虫的研究较多，但对其共生菌的研究十分薄弱，有关共生菌杀虫物质的研究在国内尚属空白。 本研究选取有代表性的11个菌株为实验材料，提取其胞外杀虫物质，检测胃毒活性和血腔毒性，筛选得到采自我国的Xenorhabdus bovienii A54菌株为高毒力的菌株。论文首次在国内外对X.bovienii产生的大分子胞外杀虫物质及其特性进行研究，该项目的研究可以提供新的杀虫资源，为杀虫物质的开拓作出贡献；同时这一研究也有助于揭示共生细菌的致病机制。现将主要研究结果总结如下：1.比较研究了11个菌株胞外分泌物的杀虫活性。结果表明，不同菌株产生的杀虫毒素不同；其中5个菌株能同时产生血腔和胃毒两种毒素，3个菌株只产生血腔毒素，3个菌株既无血腔毒素又无胃毒素的产生。另外，不同菌株杀虫毒素致病力强弱也各不相同：从血腔毒性上看，菌株HZL和15-2毒性最高，A54、BJ、ALL、CB-8、Meg毒性次之，D43毒性较差；从胃毒活性上看，A54致死活性最高，BJ、ALL、D43、15-2致死作用弱，仅对昆虫的生长有抑制作用。2.筛选出X.bovienii A54菌株为高毒力的菌株。粗提物注射大蜡螟老龄幼虫，96hr死亡率为93.3％；粗提物饲喂玉米螟和棉铃虫初孵幼虫，120hr死亡率分别为100％和90.7％。这一结果表明采自我国吉林的A54菌株有很好的杀虫活性，是很有利用价值的一种细菌资源。3.从胞外分泌物入手，研究比较A54菌株Ⅰ、Ⅱ型菌产生胞外蛋白的差异，首次开展共生菌的型态变异同其杀虫活性关系的研究。电泳结果表明，Ⅰ、 中囚农科院博十研究生学位论文 11型的产生的胞外蛋白存在很大差异：11型菌产生的胞外蛋白都能为1型 菌产生，而且1型菌的产生量要高于11型菌：另外，1型菌产生的胞外蛋 H种类也多十＊型菌。通过测定1、11型菌胞外产物的杀虫活性，发现1 型菌的胞外产物对昆虫有胃毒活性和血腔毒性，11型菌没有杀虫活性， 这 研究结果为今后本领域研究共生菌胞外杀虫物质的试验方法提出警 小，必须保证实验所用共生细菌不发生型变，否则将无法获得杀虫物质。4．色谱杜层析的结果表明，菌株M4产生的胃毒素和血腔毒素为两类不同 的杀虫物质：初步鉴定该胃毒素为多糖类物质，这一发现在国内外尚属 首次。对A54胃毒素的研究表明，该毒素可被85％饱和度的硫酸铰沉淀， 个能通过透析膜（截留分子量＞10kD）。采用饲喂棉铃虫初孵幼虫的杀虫 活性追踪检测，通过硫酸按盐析、阴离子交换柱层析、阳离子交换柱层 析等方法，对该毒素进行了分离纯化。用红外光谱初步鉴定，该毒素为 多糖类物质。经计算每升发酵液胃毒素的产量约为 1．ling。理化特性分析 表明，该毒素的分子量约为门兀D：在3炉＊一80”C范围内杀虫活性稳定： 对氯仿和正丁醇敏感，对甲醇相对稳定；随着胃毒素浓度的提高，棉铃 虫幼虫的死亡率增加，胃毒素对棉铃虫初孵幼虫的致死中浓度为30．08pg／g （胃毒素／饲料）。该毒素对较高龄期棉铃虫幼虫生长有一定的抑制作用。5．初步研究了胃毒素对棉铃虫的生理效应。通过对棉铃虫解毒酶的活力测 定分析，发现取食胃毒素后，棉铃虫体内。乙酸蔡酯酶的活力增加，乙 酚胆碱酯酶和谷脱甘肽转移酶的活力变化不大，结果说明a－乙酸蔡酯酶 是棉铃虫体内参与胃毒素代谢作用的一种解毒酶。比较对照棉铃虫和取 食胃毒素的感病棉铃虫体内总蛋白的含量，发现感病棉铃虫体内蛋白质 的含量明显卜降。酯酶同工酶的分析结果表明，与对照棉铃虫相比，感 病棉铃虫幼虫酯酶谱带数少，颜色浅，酯酶同工酶的活力减弱。︽首次从组织病理学的角度研究了胃毒素的杀虫机制。利用光学显微镜观察棉铃虫幼虫的中肠组织，发现取食胃毒素后，棉铃虫中肠组织发生病变，围食膜脱落，肠壁细胞逐渐降解，中肠细胞排列疏松混乱。利用电镜观察中肠细胞的超微结构变化，发现取食胃毒素后，棉铃虫中肠微绒毛肿胀、变形、脱落，内质网减少，中肠细胞自溶、出现空泡。 5 摘 要7．研究测定了A54胃毒素与Bt毒蛋白对棉铃虫的交互作用。结果发现随着 棉铃虫／’kJ料中 A54胃毒素和 Bt毒蛋臼浓度的增加，棉铃虫幼虫的死亡率 均显着卜升；方差分析的结果表明二者互有增效作用。这一结果为探索 穴小荫的胞外产物可成为Bt的增效剂提供了佐证。8．在囚内外召次揭示X bovienii A54菌株能产生对大蜡螟幼虫和棉铃虫幼虫 ?
参考文献：
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[2]. 昆虫病原线虫共生细菌高毒力菌株的筛选及杀虫活性物质的研究[D]. 孟亚莉. 沈阳农业大学. 2004
[3]. 昆虫病原线虫共生菌YL001菌株的代谢产物及其抑菌活性研究[D]. 刘霞. 西北农林科技大学. 2006
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[5]. 昆虫病原线虫共生菌杀虫活性的研究[D]. 王欢. 河北农业大学. 2002
[6]. 嗜线虫致病杆菌杀虫蛋白的分离纯化及杀虫蛋白基因克隆[D]. 王勤英. 河北农业大学. 2004
[7]. 嗜线虫致病杆菌北京变种CB6菌株杀虫蛋白的分离和纯化[D]. 杨保军. 中国农业科学院. 2005
[8]. 昆虫病原线虫共生菌菌株09FLYB1的分离鉴定及其杀虫毒素蛋白的分离纯化与活性研究[D]. 房云. 南京农业大学. 2010
[9]. 嗜线虫致病杆菌CB6菌株杀虫活性相关分子机制[D]. 刘峥. 中国农业科学院. 2003
[10]. Xenorhabdus bovienii A54菌株杀虫物质的研究[D]. 王立霞. 中国农业科学院. 2000