（浙江大学医学院附属儿童医院 浙江 杭州 310000）
【摘要】 目的：利用MTT法筛选赶山鞭抑制血管生成的活性成分。方法：采用MTT实验法检测quercetin(1),rutin(2),hyperin(3),quercertin-3-O-α-L-arabinofurano side(4),quercertin -3-O-β-D-glucoside(5)五种赶山鞭单体化合物对HUVEC细胞的抑制血管生成活性；化合物浓度梯度为0.1、1、5、10、50、100μg/mL。结果：在此浓度梯度范围内,化合物1、2 均抑制HUVEC生长，化合物1浓度<1μg/mL时不显著，≥1μg/mL时极显著(P<0.01)，化合物2均极显著(P<0.01)。化合物3、4浓度≤5μg/mL时抑制生长，≤0.1μg/mL时有极显著生长抑制效应(P<0.01)，>5μg/mL时有极显著的生长促进效应(P<0.01)。化合物5浓度<1μg/mL时抑制生长，≤0.1μg/mL时有显著生长抑制效应（P<0.05），>5μg/mL时促进生长，>10μg/mL有显著的生长促进效应(P<0.05)， >100μg/mL有极显著的生长促进效应(P<0.01)。结论：化合物1、2有抑制HUVEC生长的作用;化合物3、4、5低浓度(<5μg/mL)抑制HUVEC生长，高浓度(>5μg/mL)促进HUVEC生长。
【关键词】 赶山鞭；HUVEC； MTT
【中图分类号】R284.2 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2017）16-0346-02
血管生成是指单个成血干细胞或内皮细胞从已形成的微血管网以出芽方式延伸，经重组改建形成更成熟的血管的过程[1]，在糖尿病视网膜病变、晚期肿瘤病变中有重要作用。抗血管生成药物主要有内源性血管生成抑制因子、外源性血管生成抑制剂、以VEGF为靶点的抗肿瘤血管药物[2]。目前该领域主要致力于寻找机制明了、效果明确、价格低廉的新药。研究发现许多中药抑制血管作用明显、价格低廉，但成分复杂，机制不明确，因此抗血管生成新药的寻找倾向于在抑制血管疗效确切的中药中寻找活性成分。赶山鞭系藤黄科金丝桃属植物[3]，该属植物在我国分布广泛，价格低廉，抑制血管 [4]疗效确切。赶山鞭是其国内特种药材，研究其抑制血管生成活性成分对寻找抗血管生成新药有重要意义。HUVEC源于新生儿脐带内皮细胞，是进行血管抑制研究的最常用细胞[5-6]，MTT法[7-9]通过检测细胞增殖来筛选活性成分，快速、经济、适用范围广。以HUVEC为对象，通过MTT法筛选赶山鞭抑制血管生成活性成分。
1.材料
赶山鞭（甘肃宕昌县，样本保存在浙南特色中药重点实验室）；化合物1～5（赶山鞭中分离得到，经温州医科大学董建勇教授鉴定）；RMPI-1640 培养液（吉诺生物医药技术有限公司）；胎牛血清（杭州四季青公司）；MTT（Sigma 公司）； 人脐静脉内皮细胞（HUVEC，中国科学院上海细胞生物学研究所）；96孔培养板（NakgeNuncInternational，Denmark）；0.25%胰酶溶液（吉诺生物医药技术有限公司）；培养瓶（Corning，USA）。
FormaⅡWater Jacketed CO2 In cubator（ThermoElectron，USA）；Nikon Elipse TS100 倒置显微镜（Niko n，Japan）；ELX800酶标仪（Bio-TEK公司）；Air Tech超净工作台（苏净集团安泰公司）；华威BCD－190冰箱（温州华威电器公司）；FA-2004 电子天平（上海精科天平公司）；电热手提压力蒸汽消毒器（上海精胜科学仪器有限公司）。
2.方法与结果
2.1 细胞培养
HUVEC在5% CO2，37℃下，分别用含10％胎牛血清的RPMI-1640培养液传代培养，取对数生长期细胞。
2.2 目标化合物浓度确定与制备[10]
通过预实验和前期实验人员经验设定样品浓度梯度0.1、1、5、10、50、100μg/mL。分别称取适量样品，用10%胎牛血清的1640培养液溶解分别制成样品药液，4℃冰箱保存。
2.3 MTT测定样品抗HUVEC增殖作用[10]
吸弃培养瓶中培养液，用适量PBS缓冲液洗净，用0.25％胰酶溶液消化贴壁生长细胞3min，加入10%血清培养液中止消化，吹打细胞使细胞全部脱落，分散到培养液中。用1640培养液吹打混匀，调整细胞浓度为8.0×104个。取96孔培养板，设实验组与对照组，实验组各组为一种化合物，每种化合物六个浓度，每个浓度设四个复孔；对照组，每孔接种100μL细胞悬液，于培养箱（5％CO2，37℃）中培养24h，待细胞贴壁。吸弃上清液，实验组每组分别加入已配置好的0.1、1、5、10、50、100μg·mL-1化合物溶液各100μL，对照组加入培养液100μL，培养24h。加入5mg·mL-1 MTT 20μL，孵育4h后，吸弃上清溶液，加入100μL DMSO ，振荡10分钟，使其充分混匀，酶标仪测定其吸光度，吸收波长为570nm，按以下公式计算抑制率：抑制率（%） =（对照孔OD值- 实验孔OD值）/对照孔OD值×100%
2.4 统计分析
采用SPSS16.0统计软件处理实验数据，数据以（－）\s\do 4（Ｘ）±s）表示，用One-Way ANOVA检验法对各实验组均数与对照组进行比较，α=0.05
2.5 实验结果
表1结合图1：在浓度梯度范围内，化合物1、2对HUVEC均有生长抑制效应，化合物1浓度<1μg/mL时不显著，≥1μg/mL时极显著（P<0.01），化合物2均极显著（P<0.01）。化合物3、4浓度≤5μg/mL时有生长抑制效应，≤0.1μg/mL时有极显著生长抑制效应（P<0.01），>5μg/mL时有极显著的生长促进效应（P<0.01）。化合物5浓度<1μg/mL有生长抑制效应，≤0.1μg/mL时有显著生长抑制效应（P<0.05），>5μg/mL时有生长促进效应，>10μg/mL有显著的生长促进效应（P<0.05），>100μg/mL有极显著的生长促进效应（P<0.01）。
3.分析和讨论
本实验为分析赶山鞭抗血管生成活性提供初步依据，体外测试：化合物1、2抑制HUVEC生长；化合物3、4、5低浓度（<5μg/mL）抑制HUVEC生长，高浓度（>5μg/mL）促进HUVEC生长。体内使用的问题有待进一步研究。化合物均为黄酮类化合物，提示黄酮类可能是抑制血管的活性成分。
【参考文献】
[1]兰海燕，侯梅.抗肿瘤血管治疗的耐药性[J].West China Medical Journal，2008，23（1）:190-191.
[2]吴万桂，袁捷，林惠华.肿瘤抗血管生成治疗的研究进展[J].中国肿瘤临床与康复，2010，17（1）:76-77.
[3]中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志[M].北京:北京科学出版社，1990:69-70.
[4]李勇，熊元君，刘军，等.金丝桃属植物的研究进展[J].新疆中医药，2006，24（1）:55-56.
[5]龙惠东，林云恩，曾昭华.醛固酮对人脐静脉内皮细胞血管内皮生长因子表达的影响[J].中国动脉硬化杂志，2010，18（10）:779-782.
[6]李红艳，夏启胜，徐梅，等.MTT、MTS、WST21在细胞增殖检测中最佳实验条件的研究[J].中国康复医学杂志，2005，20（11）:824-826.
[7]汤淙淙，秦坤良，黄可新.温郁金茎叶化学成分及抗肿瘤活性[J].温州医学院学报，2007，37（2）:111-112.
论文作者:吴梦华,董建勇
论文发表刊物:《医药前沿》2017年6月第16期
论文发表时间:2017/6/22
标签：化合物论文; 抑制论文; 生长论文; 血管论文; 浓度论文; 培养液论文; 细胞论文; 《医药前沿》2017年6月第16期论文;