王莹 马武开(通讯作者)
（贵阳中医学院第二附属医院 贵州 贵阳 550003）
【摘要】 目的：研究益肾蠲痹丸对CIA模型大鼠关节滑膜细胞NF-KB表达的影响。方法：取Wistar大鼠40只，均分为4组，除空白组外，其余各组制作CIA大鼠模型。致炎后除模型组外，分别采用益肾蠲痹丸和雷公藤多苷灌胃治疗4周，后处死大鼠，采用Western blot法检测滑膜细胞中NF-κB/P65、NF-κB/P50、IκBα的表达。结果：与空白组相比，模型组的蛋白表达明显增强；与模型组比较，益肾蠲痹丸和雷公藤多苷组表达明显下降。
【关键词】 益肾蠲痹丸;胶原诱导性关节炎;滑膜细胞;NF-KB
【中图分类号】R28 【文献标识码】B 【文章编号】2095-1752（2015）33-0324-02
类分湿关节炎（RA）是临床最常见的风湿免疫病之一。关节滑膜是RA发病的靶器官，成纤维样滑膜细胞是滑膜组织的重要组成部分，在滑膜成纤维细胞的增殖过程中核周因子-κB(NF-κB)信号是启动致炎因子的主要“开关”，因此，控制NF-κB的非正常激活，下调炎症性细胞因子的表达，成为RA治疗的新途径。本实验通过益肾蠲痹丸对CIA大鼠关节滑膜细胞NF-κB蛋白活性影响的研究，探讨了中药复方益肾蠲痹丸对RA的药理作用机制。
1.材料与仪器
1.1 实验动物
6周龄Wistar大鼠40只，雌雄各半，由贵阳中医学院实验动物中心提供。
1.2主要实验试剂
牛II型胶原(美国Sigma公司)、弗氏完全佐剂(美国Sigma公司)、兔抗大鼠NF-κB P65多克隆抗体(美国millipore公司)；兔抗大鼠NF-κB(p105 /p50) 单克隆抗体(美国epitomics 产品)；兔抗大鼠 Ikappa B al-pha单克隆体(美国epitomics公司)。益肾蠲痹丸由地黄、当归、淫羊藿、全蝎、蜈蚣、蜂房、骨碎补、地龙、乌梢蛇、延胡索等二十味药材，加入蒸馏水配成混悬液（购与贵阳中医学院第二附属医院）。选用雷公藤多苷为对照，加入蒸馏水配成混悬液（购于贵阳中医学院第二附属医院）。
1.3主要仪器
高速分散均值匀浆机(A200-12G)、YLS-7B大鼠足趾容积测量仪(淮北正华生物仪器设备有限公司)、台式高速冷冻离心机(TGL-16M型)、电泳仪(DYY-7C 型)、凝胶成像分析系统(GE Healthcare)。
2.实验方法
2.1分组与模型制备
选取6周龄Wistar大鼠40只，雌雄各半，体重150-180g。将40只大鼠平均分为4组，每组10只：①空白对照组；②模型组；③益肾蠲痹丸组；④雷公藤多苷组。
除空白对照组外，其余各组参照文献[1]建立CIA模型。将牛II型胶原溶于0.1%的冰醋酸中，配制成胶原溶液，与等比例的弗氏完全佐剂混合并充分乳化，剪去大鼠尾根部和脊背部的毛，并进行消毒，采用皮内多点注射方式，每只大鼠注射0.4ml胶原乳剂，一周后加强免疫1次，与初次造模同法每只大鼠注射0.4ml胶原乳剂。
2.2给药
从造模开始，加强免疫后第二天灌胃给药，剂量按成人与大鼠体质量换算，即大鼠用药量=(成人一天用药量／成人体重)X6.25X大鼠体重[2]。益肾蠲痹丸组每只给药为0.42g/天，雷公藤多苷组每只给药为1.2mg/天，空白组和模型组均灌胃2ml生理盐水，各组均连续灌胃4周，每天1次。
2.3关节炎肿胀率测定
采用大鼠足趾容积测量仪测定大鼠的关节肿胀率。分别于造模完成给药前、给药1周、2周、3周、4周后测定大鼠右后肢踝关节毛际以下的容积，以第一次测定值为基准，以后每次测定值与之相比，计算关节肿胀率。
2.4 NF-κB测定
采用Western blot法检测RA模型大鼠关节滑膜细胞NF-κB/P65、NF-κB/P50、IκBα的表达及益肾蠲痹丸的调控作用。将关节滑膜组织低温匀浆后加蛋白裂解，后进行离心，取上清，经电泳、封闭、洗膜后，用Western blot印迹观察，测定各带吸光度值进行定量分析。
2.5统计学处理
采用SPSS 17统计软件，实验结果以x-±s表示，采用单因素方差分析对实验结果进行统计，P<0.05表示结果差异显著，P<0.01表示结果差异非常显著。
3.结果分析
3.1关节肿胀率变化情况
和空白组比较，各模型组在治疗前关节肿胀明显，治疗2周后，关节肿胀率开始下降，治疗3周后，和模型对照组同时点比较，肿胀率下降明显，经统计分析有明显差异性。但益肾蠲痹丸组合雷公藤多苷组并无显著差异。见表1。
3.2 NF-κB信号测定结果
经Western blot法检测，与空白组比较，模型组的NF-κB/P65、NF-κB/P50、IκBα蛋白活性检测显示表达显著增强(P<0.01)；与模型组比较，益肾蠲痹丸组和雷公藤多苷组，检测结果显示表达量明显下降(P<0.01)；与雷公藤多苷组比较，益肾蠲痹丸组表达虽有区别，但差异不具有统计意义。见表2。
4.讨论
关节滑膜是RA发病的靶器官，成纤维样滑膜细胞是滑膜组织的重要组成部分，其分泌高水平促炎性细胞因子、化学趋化因子、基质蛋白降解酶等，持续刺激滑膜细胞，作用于滑膜细胞信号传导途径的不同部位，引起细胞内蛋白激酶的持续激活，导致滑膜细胞信号传导异常及滑膜细胞的增殖与凋亡失衡。在滑膜成纤维细胞的增殖过程中核周因子-κB( NF-κB)信号是启动致炎因子的主要“开关”，其信号途径的激活，调节许多炎症基因的表达，如TNF-α、IL-1β等，这些炎症性细胞因子在RA发病中起到关键作用[3]。本次实验结果表明，在CIA大鼠关节致炎的情况下，NF-κB活性增强，表明NF-κB可能在某种程度上参与了RA的发病过程。同时，实验表明益肾蠲痹丸能改善大鼠关节肿胀，并能降低CIA大鼠的NF-κB/P65、NF-κB/P50、IκBα表达，一定程度上抑制NF-κB的活性，为益肾蠲痹丸临床研究提供依据。
【参考文献】
[1] Larson P. Homologous type II collagen induced arthritis in rats [J].Arthritis Rheum，1990，33( 5) : 693．
[2] 马武开，姚血明，唐芳等，难治性类风湿关节炎中医病因病机初探[J]．四川中医，2011，
29(4)：35—36．
[3] 沈晖，方秀斌，刘有世，佐剂关节炎大鼠滑膜组织中核因子-κB 表达的研究[J]．中国医科大学学报，2003，32(5)：386．
基金项目：贵州省中医药管理局中医药、民族医药科学技术研究课题（QZYY2012-21);贵阳中医学院科研项目（[2011]05号）；
论文作者:王莹,马武开
论文发表刊物:《医药前沿》2015年11月第33期
论文发表时间:2016/5/9
标签：大鼠论文; 关节论文; 模型论文; 细胞论文; 中医学院论文; 贵阳论文; 胶原论文; 《医药前沿》2015年11月第33期论文;