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【摘要】目的：建立HPLC法测定盐酸法舒地尔注射液中异构体的含量 。方法：色谱柱为YMC-Pack Pro C18(4.6×250mm, 5μm)；流动相：[1.5%三乙胺（pH5.4）：乙腈=87∶13]-乙腈，进行梯度洗脱；流速：1.0ml/min；柱温：30℃；检测波长：275nm进样量：20μl。结果在选定的条件下,法舒地尔与异构体1和异构体2分离度良好;2个杂质的平均回收率分别为100.1%2和103.3%,RSD分别为3.8%2和3.1%。结论：经方法学验证,本法简便、专属、准确,可用于盐酸法舒地尔注射液中异构体的测定。
【关键词】盐酸法舒地尔；异构体；HPLC法
【中图分类号】R944 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2019）28-0255-02
盐酸法舒地尔是由日本旭化成株式会社研制开发，是一种异喹啉磺胺衍生物[1]，也是一种蛋白激酶抑制剂。盐酸法舒地尔不仅对蛛网膜下腔出血后脑血管痉挛有较强的抗痉挛作用，对缺血脑组织也有一定的保护作用，所以盐酸法舒地尔现已成为改善及预防蛛网膜下腔出血术后的脑血管痉挛及随之引起的脑缺血症状的首选药物。
根据处方、生产工艺及质量研究的相关文献资料显示［2-8]，盐酸法舒地尔的有关物质来源主要为工艺杂质、副产物和降解杂质。目前主要对异喹啉－5－磺酸、异喹啉、法舒地尔二聚体、N－氧化物、高哌嗪等已知杂质进行了相关质量研究和控制。
盐酸法舒地尔的起始物料为5-异喹啉磺酸[1]，该起始物料中可能含有磺化异喹啉杂质；导致在合成盐酸法舒地尔的过程中，产生磺化异构体的衍生物，即法舒地尔的异构体杂质。
目前盐酸法舒地尔注射剂的质量标准中未收录异构体杂质的质控方法，而国内仅研究了盐酸法舒地尔原料中一种异构体的检测方法[9]。
本研究通过建立一种有效可行的HPLC法对盐酸法舒地尔注射液中的2种异构体杂质（1位异构体衍生物和8位异构体衍生物）的含量进行测定，为更好地控制盐酸法舒地尔注射液的质量提供依据。
盐酸法舒地尔及其异构体杂质的化合物结果见图1。
1.仪器及试药
SHIMAZDU LC20AD高效液相色谱仪（日本岛津公司）；XPE26电子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；FE20型pH计（瑞士梅特勒-托利多公司）盐酸法舒地尔注射液（昆药集团股份有限公司）；盐酸法舒地尔1位异构体对照品（深圳博尔特公司，含量97.81%）；盐酸法舒地尔8位异构体对照品（深圳博尔特公司，含量97.61%）；乙腈和三乙胺为色谱纯；磷酸为分析纯；水为自制双蒸水。
2.方法与结果
2.1 色谱条件
采用十八烷基键合硅胶为填充剂的YMC-Pack Pro C18色谱柱（4.6×250mm,5μm），以1.5%三乙胺pH5.4：乙腈=87∶13为流动相A，乙腈为流动相B，流速：1.0ml/min，柱温：30℃
检测波长：275nm，进样量：20μl，稀释剂：1.5%三乙胺pH5.4：乙腈=85∶15，按下表1进行梯度洗脱。
2.2 溶液配制
2.2.1 1.5%三乙胺pH5.4：精密移取15ml三乙胺至985ml水中，用磷酸调pH至5.4，用0.22μm的水膜抽滤。
2.2.2 1.5%TEA (pH5.4)/乙腈（87/13,V/V）：量取1.5%三乙胺（pH5.4）溶液870ml与乙腈130ml，混匀。
2.2.3稀释剂（空白溶剂）：量取850ml 1.5%三乙胺（pH5.4）与150ml乙腈，混匀。
2.2.4空白辅料溶液：取氯化钠15mg，精密称定，置50ml量瓶中，用稀释剂溶解稀释至刻度，摇匀，作为空白辅料溶液。
2.2.5异构体杂质储备液（5μg/ml）：分别取异构体杂质1与异构体杂质2对照品各5mg，精密称定，置100ml量瓶中，用稀释剂溶解稀释至刻度，摇匀；精密移取5ml，置50ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，作为杂质储备液。
2.2.6对照品溶液（0.005mg/ml）：取盐酸法舒地尔对照品5mg，精密称定，置10ml量瓶中，用稀释剂溶解稀释至刻度，摇匀；精密移取1.0ml，置100ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。
2.2.7供试品溶液（0.48mg/ml）：取盐酸法舒地尔注射液10支并混匀，精密移取10ml置25ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀；精密移取2ml置25ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。
2.3专属性试验
取空白溶剂、空白辅料溶液、异构体杂质储备液和对照品溶液各20μl，照上述色谱条件进样，记录色谱图(见图2)，盐酸法舒地尔峰与相邻杂质峰，各杂质峰间均能良好分离，空白溶剂色谱图在各杂质以及主峰保留时间处无干扰，专属性溶液中主峰与相邻杂质以及各杂质之间分离度符合要求。本方法的专属性良好。
2.4 线性和范围
分别取盐酸法舒地尔1位异构体杂质和盐酸法舒地尔8位异构体杂质对照品各5mg，加稀释剂溶解稀释成各杂质浓度为0.25、0.41、0.51、0.76、1.01和1.521的异构体杂质系列溶液，分别精密量取上述溶液20μl注入液相色谱仪，记录色谱图；以相应对照品的浓度(C)为横坐标，对应的峰面积(A)为纵坐标，进行线性回归。
结果显示：盐酸法舒地尔1位异构体在0.2539μg/ml～5.0780μg/ml浓度范围内的线性关系良好，线性方程为y=0.1583 x+0.0044，相关系数r为0.9998；盐酸法舒地尔8位异构体在0.2227μg/ml～1.3360μg/ml浓度范围内关系良好，线性的线性方程为y=14669.9311x- 63.7465，相关系数r为0.9999。
2.5 定量限与检测限
在选定的色谱条件下，分别取盐酸法舒地尔1位异构体和盐酸法舒地尔8位异构体的对照品溶液逐级稀释，按信噪比3∶1和10∶1分别确定检出限和定量限。
结果显示：盐酸法舒地尔1位异构体的定量限浓度为0.4062μg/ml，相对应的百分比含量为0.081%，检测限浓度为0.1270μg/ml，相对应的百分比含量为0.025%；盐酸法舒地尔8位异构体的定量限浓度为0.2227μg/ml，相对应的百分比含量为0.045%，检测限浓度为0.1114μg/ml，相对应的百分比含量为0.022%。
2.6 准确度
精密移取8.0ml盐酸法舒地尔注射液，置25ml量瓶中，用稀释剂溶解稀释至刻度，摇匀，作为供试品储备液。按2.2.5项下杂质储备液配制方法配制杂质储备液，精密移取5.0ml，置50ml容量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，作为准确度杂质储备液。照限度水平为0.05%、0.2%以及0.3%的各准确度溶液，每个浓度水平配制3份，精密量取空白供试品溶液以及各准确度溶液20μl，按要求注入高效液相色谱仪，记录色谱图，并计算回收率。
结果显示：盐酸法舒地尔1位异构体的单个回收率在93.21%～102.13%；9份溶液的平均回收率为98.30%，RSD为3.29%。盐酸法舒地尔8位异构体的单个回收率在93.5%～102.6%；9份溶液的平均回收率为99.5%，RSD为4.0%。表明本方法准确度良好。
2.7 精密度
2.7.1重复性 照2.2.5项下配制方法配制0.2%浓度水平加标溶液，平行配制6份。取空白供试品溶液以及各加标溶液20μl按要求分别注入高校液相色谱仪，记录色谱图，并计算每份溶液的回收率以及RSD。结果显示：盐酸法舒地尔1位异构体的回收率的RSD为3.0%；盐酸法舒地尔8位异构体的回收率的RSD为2.1%。
2.7.2中间精密度 在不同天、不同的分析人员、不同的液相系统，按重复性试验项下的方法制备空白供试品溶液以及0.2%浓度水平加标溶液进行测定，计算每份溶液的回收率及RSD。
结果显示：盐酸法舒地尔1位异构体的回收率的RSD为3.63%。盐酸法舒地尔8位异构体的回收率的RSD为2.4%。表明本方法具有较好的精密度。
2.8 溶液稳定性
取“重复性”下0.2%浓度水平的加标溶液分别置于室温和冰箱（约5℃）中，精密量取上述溶液各20μl，分别于不同时间注入液相色谱仪，记录色谱图。
结果显示：与0小时相比，加标样品溶液在室温条件下放置9小时，盐酸法舒地尔1位异构体的最大绝对差值为0.01%，盐酸法舒地尔8位异构体的绝对差值为0.01%；与0小时比较，加标样品溶液在5℃条件下放置2天，盐酸法舒地尔1位异构体的最大绝对差值为0.02%，盐酸法舒地尔8位异构体的绝对差值为0.00%。加标样品溶液在5℃条件下2天内稳定，加标样品溶液在室温条件下24小时内稳定。
2.9 耐用性
取“重复性”项下方法配制加标供试品溶液。改变色谱条件，测定供试品有关物质的量，见表2。
结论：异构体杂质的绝对差值均小于0.1%，该方法在检测波长273nm～277nm范围内，柱温在30℃～35℃范围内，流动相pH在5.3～5.5范围内，方法耐用性良好。
2.10样品的检测
按“2．2”配制杂质对照溶液与3批供试品溶液，按“2．1”项下色谱条件进样测定，按外标法计算盐酸法舒地尔原料中异构体的含量。结果3个批号(批号：17EC01、17EC02、17EC03)注射剂样品的异构体含量均未检出。
3.讨论
本试验研究的盐酸法舒异构体为原料起始原料中引入的异构体衍生物，为盐酸法舒地尔的非对映异构体。由于该异构体杂质毒性数据未知，且本制剂为注射剂，必须严格控制原料中该杂质的含量，从而保证临床用药的安全性。
通过对方法的专属性、线性与范围、检测限与定量限、准确度，精密度、耐用性、溶液稳定性的方法学研究，表明方法可用于盐酸法舒地尔注射液中异构体杂质含量的检测。
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论文作者:高宏涛,杨建玲,朱泽,陈云建
论文发表刊物:《医药前沿》2019年28期
论文发表时间:2019/11/13
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