赖红星
珠海冀百康生物科技有限公司
摘要：【目的】设计含有新型前导肽的人胰岛素原分子，构建高效表达人胰岛素原的基因工程菌。【方法】通过化学合成人胰岛素原的编码基因，用限制性内切酶XhoI和NotI插入到诱导型分泌表达载体pPICZαA的α-factor信号肽序列的下游，构建重组表达载体，线性化处理后电击转化到毕赤酵母X-33感受态细胞，经Zeocin抗性筛选和摇瓶筛选得到人胰岛素原基因工程菌株X-33/pPICZαA-INS。用20L发酵罐对该工程菌进行高密度发酵，表达人胰岛素原。【结论】20L罐高密度发酵时人胰岛素原产量达到5.9g/L，实现了高效分泌表达，为重组人胰岛素、地特胰岛素和德谷胰岛素等药物的开发奠定了基矗
关键词：根据国际糖尿病联盟的统计，2017年全球糖尿病患者人数达到4.25亿，其中中国糖尿病患者人数达到1.144亿，是全世界糖尿病患者最多的国家[1]。重组人胰岛素、地特胰岛素和德谷胰岛素作为最重要的降血糖药物，在治疗各种胰岛素缺乏的糖尿病患者中具有很好的疗效，有着巨大的市场需求。
人胰岛素原是生产重组人胰岛素、地特胰岛素和德谷胰岛素以及他新型胰岛素类似物的前体蛋白，具有重要的工业应用价值。人胰岛素原已经在不同的系统中得到了表达，如大肠杆菌、酵母等[2-5]。在大肠杆菌表达系统中，人胰岛素原通常以包涵体的形式表达，发酵后需要变性和复性，工艺复杂、生产成本高。酵母拥有完善的蛋白加工、修饰机制，可以使人胰岛素原进行正确的折叠，形成带有正确的二硫化桥的产物，实现可溶性表达，后续制备工艺简单。
毕赤酵母（Pichia Pastoris）是一种非常优秀的外源蛋白表达系统，它不仅具有其他高等真核表达系统的优势，如蛋白加工、蛋白折叠、翻译后修饰等，还具有大肠杆菌等原核表达系统的优势，如生长迅速、培养简单、培养基价格低廉等。此外毕赤酵母还具有功能强大的、甲醇调节的AOX1启动子，表达稳定，分泌能力强，易于高密度细胞生长等优点。目前，已有许多外源蛋白质在毕赤酵母表达系统中实现了从mg/L到g/L的表达水平[6]。
本研究设计了一种新的人胰岛素原分子，其N端含一个由20个氨基酸组成的前导肽，B链和A链之间含有3个氨基酸的微型C肽，将其编码基因导入到毕赤酵母X-33中获得了高效表达的基因工程菌株，为德谷胰岛素等药物的开发奠定了基矗
1 材料与方法
1.1材料
1.1 .1质粒和菌株
质粒pPICZαA购自Invitrogen公司，毕赤酵母X-33购自中国工业微生物保藏中心。
1.1.2 生化试剂
DNAMarker、Taq DNA聚合酶购自Takara公司，限制性内切酶SacI、Xho I和Not I购自NEB公司，抗生素Zeocin购自Invitrogen公司，DNA回收试剂盒购自Tiangen公司。其他试剂为国产分析纯。
1.1.3 培养基
大肠杆菌培养用LB培养基，毕赤酵母培养用YPD培养基（2% Tryptone，1% Yeast Extract，2% 葡萄糖），摇瓶表达量筛选用BMGY培养基（1%酵母提取物，2%蛋白胨，1.34%YNB，4×10-5%生物素，0.1mol/L pH6.0磷酸缓冲液，2%甘油）和BMMY培养基（1%酵母提取物，2%蛋白胨，1.34%YNB，4×10-5%生物素，0.1mol/L pH6.0磷酸缓冲液，0.5%甲醇）。固体培养基为在液体培养基中加入1.5%琼脂粉。
发酵种子液制备用YPG培养基（2% Tryptone，1% Yeast Extract，2% 甘油）。高密度发酵用BSM培养基（40g/L甘油，0.93g/L 硫酸钙，14.9 g/L七水硫酸镁 ，18.2g/L硫酸钾，26.7ml/L磷酸（85%），4.13g/L KOH ，4ml/L微量元素PTM1）。
微量元素PTM1（1L）：6.0 g五水硫酸铜，0.02g硼酸，35.6g七水硫酸锌，65g七水硫酸亚铁，0.5g六水氯化钴，0.08g碘化钾，3g一水硫酸锰，0.2g二水钼酸钠，0.2g生物素，5ml浓硫酸，余量为水。
1.2 方法
1.2.1 人胰岛素原基因工程菌X-33/pPICZαA-INS的构建
1.2.1.1 重组表达质粒pPICZαA-INS的构建
在胰岛素B链和A链之间添加连接肽（AAK），并在B链的N端添加前导肽（EEAEAEAEAEAEAEAEAEPK），得到人胰岛素原分子。根据人胰岛素原的氨基酸序列设计相应的cDNA序列，再从密码子偏好性、GC含量、密码子适应指数CAI、发夹结构和顺式作用元件等方面对序列进行优化，然后在序列C末端添加终止密码子TAA，5'末端添加限制酶Xho I序列CTCGAG，3'末端添加限制酶NotⅠ序列GCGGCCGC，得到人胰岛素原编码基因。委托南京金斯瑞生物技术有限公司进行全基因合成。将合成的基因插入经限制酶EcoRⅤ消化的pUC57质粒得到克隆质粒pUC57-INS。
用限制酶Xho I和Not I酶切克隆质粒pUC57-INS，回收基因片段，连接至经Xho I和Not I酶切的质粒pPICZαA，转化子大肠杆菌TOP10，将耐受氨苄青霉素的转化子，用测序引物5'gactggttccaattgacaagc进行测序，选取未发生基因突变且读码框正确的转化子，即得到重组表达质粒pPICZαA-INS。
1.2.1.2基因工程菌X-33/pPICZαA-INS的构建
用限制酶SacⅠ消化重组表达质粒pPICZαA-INS，回收10~20μg线性化质粒片段，电转化至毕赤酵母X-33感受态细胞，涂布于含0.1mg/ml Zeocin的YPD平板，28℃倒置培养3~5天直到出现转化子。
1.2.1.3 高产基因工程菌X-33/pPICZαA-INS的筛选
收集YPD平板上的转化子，用无菌水稀释至酵母细胞数为5×103个/ml后取0.2ml涂布至含0.25mg/ml Zeocin的YPG平板；稀释至酵母细胞数为5×104个/ml后取0.2ml涂布含0.5mg/ml Zeocin的YPG平板；稀释至酵母细胞数为5×105个/ml后取0.2ml涂布含0.75mg/ml；稀释至酵母细胞数为5×106个/ml后取0.2ml涂布含1.0mg/ml Zeocin的YPD平板；稀释至酵母细胞数为5×107个/ml后取0.2ml涂布含2.0mg/ml和3.0mg/ml Zeocin的YPG平板。28℃倒置培养培养3~5天直到出现抗性菌落。
挑取单菌落接种至25ml BMGY培养基中，28℃，220rpm振荡培养至OD600=2-6， 3000rpm室温离心5min收集细胞，用BMMY培养基重悬细胞至OD600=1.0，28℃，220rpm继续培养进行诱导表达(大约100-200ml) ，每24小时，加甲醇至终浓度为0.5%继续诱导。诱导72h，取1ml培养基至1-5ml离心管，1200rpm室温离心5min，收集上清液用HPLC检测人胰岛素原含量。
1.2 .2 人胰岛素原基因工程菌X-33/pPICZαA-INS的发酵培养与表达
取0.3ml人胰岛素原基因工程菌菌液接种至50ml YPG培养基，28℃，220rpm培养24h，得到一级种子液。取30ml一级种子液接种至400ml YPG培养基，28℃，220rpm培养24h，得到二级种子液。
将400ml二级种子液接种至含8LBSM培养基的20L发酵罐。以搅拌转速100rpm，通气量4L/min，温度30℃，pH5.6的初始条件开始培养，通过调整转速和通气量维持DO（溶解氧）高于40%，当发酵培养基中的甘油完全消耗后，开始补加含8ml/L微量元素的50%甘油继续培养。当发酵液浓度OD600达到250时停止加甘油，同时开始补加含8ml/L微量元素的100%甲醇，温度降低为28℃，通过调整转速和通气量维持DO高于10%。补加甲醇120h时停止培养，收集发酵上清液用RP-HPLC检测人胰岛素原含量。
1.2.3人胰岛素原的分析
使用5μm，4.6*150mm的C18色谱柱，控制柱温40℃；波长214nm；流速为1.0ml/min，以水：TFA（1000：1）为流动相A，乙腈：TFA（1000：1）为流动相B ，流动相B从25%到40%梯度洗脱，检测样品中人胰岛素原的含量。
2 结果与分析
2.1 人胰岛素原基因工程菌X-33/pPICZαA-INS的构建
2.1.1 重组表达质粒pPICZαA-INS的构建
经生物软件Vector NTI Suite11 分析，使用 5'AOX1 和 3'AOX1为引物进行菌液PCR扩增， 正确的片段 756bp ，空质粒扩增出的片段为 589bp 。因此，片段大小约为 760bp 的大肠杆菌 转化子为阳性菌株。从图1可知，转化子5、7、8、9、12、14为含有空质粒的菌株，而其他转化子均为阳性菌株。取5个阳性菌株菌液送Invitrogen公司测序，发现基因序列与设计一致。
注：M: DL2000 DNA Marker ， 1~5:转化子1~5对应的PCR产物
2.1.2 基因工程菌X-33/pPICZαA-INS的构建
将线性化的pPICZαA-INS质粒电击转到到毕赤酵母X-33，28℃倒置培养约42小时，可见平板上出现菌落，菌落呈圆形，白色，表面较湿润、光滑，为典型的毕赤酵母集落形态，见图2。
2.1.3 高产基因工程菌X-33/pPICZαA-INS的筛选
分别在0.25mg/ml 、0.5mg/ml、0.75mg/ml、1.0mg/ml 、2.0mg/ml和3.0mg/ml Zeocin抗性下筛选转化子，并分别选取5个菌落较大的单菌落进行摇瓶发酵，诱导72h时收集上清液，用RP-HPLC检测人胰岛素原表达量，结果见图3。从图中可知，随着抗性增加，重组菌的表达量也逐渐增加，其中3.0mg/ml Zeocin抗性下的工程菌表达量最高。
2 .2 人胰岛素原基因工程菌X-33/pPICZαA-INS的发酵培养与表达
工程菌X-33/pPICZαA-INS在20L罐进行发酵培养时，细胞生长正常，人胰岛素原的含量不断累积，在培养120h放罐时达到最高，取发酵上清液用RP-HPLC检测人胰岛素原含量为5.9g/L，实现了高密度发酵（见图4）。从图中可知，人胰岛素原的峰面积占比在90%以上，说明在发酵上清液中人胰岛素原占总蛋白的90%以上，宿主蛋白或其他杂蛋白占比在10%以下。
注：图中液相峰12为人胰岛素原目标峰。
3 讨论
N端前导肽是添加到胰岛素B链N末端的多肽，尽管在重组人胰岛素、地特胰岛素和德谷胰岛素的制备过程中，前导肽会被酶切去除，但其对蛋白质的正确表达、蛋白表达量着重要意义。无N端前导肽的人胰岛素原可以在毕赤酵母中进行分泌性表达，但是表达量不高，Nestor Annibali等人[7]在毕赤酵母中表达无前导肽的人胰岛素原，高密度发酵时人胰岛素原的表达量为0.2-0.4g/L。添加了N端前导肽的人胰岛素原在毕赤酵母中的表达量可以显著提高。T. Xie等人[8]将含有前导肽的人胰岛素原编码基因转化到毕赤酵母GS115中进行表达，并将基因工程菌于16L发酵罐进行高密度发酵，人胰岛素原的产量达到3.6g/L。Chandrasekhar Gurramkonda等人[9]设计了一种N端含10个氨基酸前导肽的人胰岛素原分子，将其编码基因转化到毕赤酵母X-33中构建基因工程菌，经高密度发酵后人胰岛素原的表达量达到4g/L。本研究设计了一种新的人胰岛素原分子，其N端含一个由20个氨基酸组成的前导肽，该前导肽是一种具有亲水性的短肽，可以使人胰岛素原的结构更加稳定，还可以保护胰岛素核心序列免受宿主菌蛋白酶的破坏。我们将该新型的人胰岛素原编码基因转化到毕赤酵母X-33，然后经过抗性筛选和摇瓶筛选获得了高水平表达的人胰岛素原基因工程菌X-33/pPICZαA-INS。我们将人胰岛素原基因工程菌接种到20L发酵罐中，用BSM培养基进行高密度发酵，诱导120h时人胰岛素原的表达量达到5.9g/L。此外，在发酵上清液中人胰岛素原的纯度达到60%以上，极大减轻了后续纯化的压力。
本研究开发的人胰岛素基因工程菌具有表达量高、菌种稳定性高、纯化工艺简单等特点，为开发质优价廉的重组人胰岛素、地特胰岛素和德谷胰岛素等仿制药物奠定了良好的基矗
参考文献
1. IDF Diabetes Atlas Eighth Edition 2017.
2. Kjeldsen, T.; Pettersson, A.F.; Hach, M. Secretory expression and characterizationof insulin in Pichia pastoris. Biotechnol. Appl. Biochem. 1999, 29,79-86.
3. 产人胰岛素毕赤酵母工程菌的构建.王隆飞, 方园园,陈功等.南开大学学报（自然科学版）, 2006,39（5）:69-73.
4. 长效重组人胰岛素原类似物的高密度细胞培养的研究.何勇智,高强,杜天飞,王明蓉. 2009,34(12):717-721.
5. 重组人胰岛素在毕赤氏酵母中的分泌表达. 何尧声,沈文涛,陈春宝,王明钦,周鹏.药物生物技术,2009,16(2):108～112.
6. Cregg, J.M.; Vedvick, T.S.; Raschke, W.C. Recent advances in the expressionof foreign genes in Pichia pastoris. Bio=Technol. 1993, 11, 905-910
7. Nestor Annibali et al.US20030104607A1.
8.Secretory Expression of Insulin Precursor inPichia pastoris and Simple Procedure forProducing Recombinant Human Insulin.T. Xie et al..Preparative Biochemistry & Biotechnology, 38: 308-317, 2008.
9. Application of simple fed-batch technique to high-level secretory production of insulin precursor usingPichia pastoriswith subsequent purification and conversion to human insulin.Chandrasekhar Gurramkondaet al..Microbial Cell Factories 2010, 9:31.
论文作者:赖红星
论文发表刊物:《中国西部科技》2019年第22期
论文发表时间:2019/11/26
标签：胰岛素论文; 酵母论文; 培养基论文; 基因工程论文; 质粒论文; 的人论文; 前导论文; 《中国西部科技》2019年第22期论文;