【关键词】个旧；非小细胞肺癌；表皮生长因子受体；扩增阻滞突变系统
Research of epidermal?growth?factor?receptor gene mutation in non-small cell lung cancer in Gejiu area of Yunnan
YANG Chang-shao1, ZHU Shun-hui2, MAO xiao-qin3, WANG Fan3,LI Guang-fen1, FU Si-qi1, HAN Min1, LI Tao1
1. Department of Pathology, First people's hospital of yunnan province New kunhua hospital, Anning, 650106, China
2. Tumor biotherapy center, Honghe prefecture third people's hospital, Honghe, 661000 , China
3. Clinical laboratory, First people's hospital of yunnan province New kunhua hospital, Anning, 650106, China
Abstract:Objective To study the mutation of EGFR gene in non-small cell lung cancer in gejiu, yunnan, and analyze the correlation between EGFR gene and clinic pathological features of patients. Methods Eighty-six NSCLC patients in Gejiu area of ??Yunnan were selected, including 44 paraffin tissue specimens, 42 IIIB~IV peripheral blood specimens and 16 corresponding histological specimens. Amplification refractory mutation system (ARMS) was applied to detect the mutation status of EGFR exon 18, 19, 20 and 21 in paraffin tissues and blood samples, and to analyze the correlation between gene mutation and clinic pathological characteristics .Results The total mutation rate of EGFR gene was 41.9% (36/86) in gejiu area of yunnan. The mutation rate of paraffin tissue specimens was 47.7% (21/44). The mutation rate of blood samples was 35.7% (15/42), and the corresponding histological specimens in 16 cases were 37.5% (6/16), which was consistent with the results of blood samples. In 36 patients with EGFR gene, Exon18 G719X accounted for 2.8%(1/36). Exon19Del accounted for 47.2% (17/36); Exon20 T790M accounted for 2.8%(1/36); Exon21 L858R accounted for 33.3%(12/36), and L861Q accounted for 11.1% (4/36). In addition, 2.8%(1/36) of one sample had Exon18 G719X and Exon20 S768I double mutations.Conclusion The EGFR mutations of NSCLC patients in gejiu region of yunnan were mainly Exon19Del and Exon21 L858R, and the mutation rate of Exon21 L861Q was higher than that of other studies. EGFR mutations in this region were associated with histological types, but not correlation with gender, age, or smoking status. For stage IIIB~IV NSCLC patients who cannot obtain tissue specimens, the results of detecting EGFR gene mutation in peripheral blood by using ARMS technology are reliable, which can provide accurate therapeutic basis for clinical use of EGFR-TKI.
[Keywords] Gejiu; Non-small cell lung cancer; Epidermal?growth?factor?receptor; Amplification refractory mutation system
肺癌是目前常见的恶性肿瘤之一，全球每年因肺癌死亡的人数超过100万，其中NSCLC最常见，约占全部肺癌的80%～90%[1,2]。在我国肺癌已成为恶性肿瘤第一死因，而云南的肺癌发病率与病死率一直在国内位居榜首，表现出独特的区域性点状高发，主要集中在个旧和宣威两个地区[3]。据中国肿瘤防治数据库资料显示，1954年至2001年云南省肺癌患者近100万人，其中云南锡矿工人肺癌年发病率高达380~450/10万，这在全世界也是罕见的[4]。进一步调查发现[5,6]，云锡矿工肺癌发病率异常增高与生产环境中的氡、砷等职业暴露因素有关，认为是与环境中存在放射性氡及其衰变后形成的氡子体及含砷矿尘的复合作用所致。目前手术是NSCLC最佳的治疗方式，但多数患者确诊时已是晚期，病情发展快，没有手术指征。随着肿瘤分子生物学的发展，许多研究发现[7-10]，EGFR基因突变状态是决定EGFR络氨酸激酶抑制剂（EGFR-tyrosine kinase inhibitor，EGFR-TKI）疗效最重要的预测指标，检测EGFR基因突变状态是决定患者是否能够应用EGFR-TKI治疗的先决条件。但由于地区的差异性，可能导致不同地区NSCLC患者EGFR基因突变存在差异[2,11]。本文就云南个旧地区NSCLC患者的EGFR进行检测，并分析EGFR基因突变与患者临床病理特征的相关性，为进一步研究个旧地区NSCLC与相关靶向治疗药物的分子机制提供基础。
1材料与方法
1.1 材料 选取红河州第三人民医院肿瘤生物治疗中心2017年1月至2019年9月期间个旧地区非小细胞肺癌86例，其中石蜡组织标本44例，IIIB~IV期外周血液标本42例及其对应组织学标本16例。荧光定量PCR仪Mx3000P?购自美国Agilent，微量紫外分光光度计（NanoDrop2000）购自美国Thermo，核酸提取试剂FFPE DNA、Circulating DNA Kit（Spin Column）及人类EGFR基因突变检测试剂盒（荧光PCR法）均购于厦门艾德。
1.2 石蜡组织样本处理及DNA提取 用二甲苯及75%乙醇擦拭切片机刀座、镊子，切片时每个蜡块均换新刀片，保证无交叉污染，切8 μm厚切片5~8张放入EP管，按照 FFPE DNA试剂盒提取DNA，所提的DNA保存在-20℃冰箱备用。
1.3 外周血样本处理及DNA提取 用乙二胺四乙酸二钠（简称EDTANa2）抗凝管抽吸10ml外周血，轻柔地将采血管上下颠倒混匀；用4℃离心机将抽吸好的外周血2000g离心10min，取上清再次8000g 4℃离心10min，取上清即为血浆。按Circulating DNA Kit（Spin Column）说明书提取DNA，所提的DNA保存在-20℃冰箱备用。
1.4 ARMS法检测EGFR基因突变 从EGFR检测试剂盒中取出已预分装的八连管，在冰上融化后短暂离心。取42.3μL待测样品DNA及2.7 μLTaq酶混匀，每管5μL加入八联PCR管中，每批实验均设置阳性及阴性对照。PCR反应参数：第一阶段：95℃ 5min，1个循环；第二阶段：95℃ 25s，64℃ 20s，72℃ 20s，15个循环；第三阶段：93℃ 25s，60℃ 35s，72℃ 20s，31个循环；并在第三阶段60℃时收集FAM和HEX（或VIC）信号。检测结果根据说明书判读原则进行判读。
1.5 统计学分析 采用SPSS 24.0软件进行统计学分析EGFR基因突变与患者临床病理特征的相关性， P﹤0.05时表示数据差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 患者基本资料（表1）：云南个旧地区86例NSCLC患者中，石蜡组织标本44例(51.2%)，IIIB~IV期外周血液标本42例(48.8%)及其对应组织学标本16例。其中男性51例(59.3%)，女性35例(40.7%)；中位年龄52岁(29-76岁)，≥52岁的NSCLC患者46例(53.5%)，<52岁的NSCLC患者40例(46.5%)；组织学类型：腺癌患者68例(70.1%)，鳞癌患者18例(20.9%)；曾经或正在吸烟的患者41例(47.7%)，从未有过吸烟史的患者45例(52.3%)。
2.2 EGFR基因突变频率与类型（图1）：EGFR基因在云南个旧地区NSCLC的总突变率为41.9％(36/86)。石蜡组织标本突变率为47.7％(21/44)；血液标本突变率为35.7％(15/42)，16例对应组织学标本突变率为37.5％(6/16)，与血液标本结果一致。在36例EGFR基因突变患者中Exon18 G719X占2.8%(1/36)；Exon19Del占47.2%(17/36)；Exon20 T790M占2.8%(1/36)；Exon21 L858R占33.3%(12/36)，L861Q占11.1％(4/36)；且有1例标本2.8%(1/36)存在Exon18 G719X和Exon20 S768I双突变。.png)
2.3 EGFR基因突变与患者临床病理特征相关性（表1）：EGFR基因在腺癌患者中突变率为50.0％（34/68)，显著高于鳞癌患者突变率11.1％(P=0.003)；而与患者性别、年龄、是否吸烟无明显相关（P＞0.05）。
表1 EGFR基因突变与云南个旧地区NSCLC患者临床病理特征的相关性[（％）]
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3 讨论
个旧地处云贵高原的南端，位于东经102°54′至103°25′、北纬23°01′至23°36′之间，以生产锡为主并产铅、锌、铜等多种有色金属的冶金工业城市，是中外闻名的"锡都"。多项研究表明[5,12]云锡矿工肺癌发病率及死亡率高与生产环境中的氡、砷等职业暴露因素有关，氡来源于地壳中的铀镭系，是天然放射性稀有气体，衰变产物为氡子体，氡子体对人的呼吸系统造成辐射损伤，长期吸入可诱发肺癌；而砷则1979年被IARC列为人类致癌物，是云锡矿工肺癌病因的重要依据。目前肺癌治疗手段及检测方法不断发展，手术是NSCLC最有效的治疗手段，但多数患者确诊时已是晚期，病情进展快，没有手术指征。然而EGFR作为治疗NSCLC的分子靶标受到普遍关注，一代药物吉非替尼(Gefitinib)、厄洛替尼(Erlotinib)、埃克替尼（Icotinib），二代药物阿法替尼（Afatinib），三代药物奥希替尼（Osimertinib）等已广泛应用于临床，但EGFR基因各外显子在治疗中存在一定差异。大量研究表明[7-10]，EGFR基因18、19、21外显子发生突变的NSCLC患者服用EGFR-TKI类药物的疗效较好，而EGFR野生型患者则无法从中获益，T790M突变则是最常见的TKIs耐药突变。因此，准确检测EGFR突变状态，对NSCLC患者是否应用EGFR-TKI类药物意义重大。
EGFR位于人第7号染色体p13-q22区域，全长约20万个碱基，共有28个外显子，分别编码胞外、跨膜及胞内区[10,13]。当EGFR胞外区与相应配体结合后，细胞内的酪氨酸激酶区被激活，导致自身磷酸化，从而为多种下游分子提供停泊位点，启动下游信号转导通路，从而导致肿瘤的发生、发展[13,14]。EGFR-TKIs则是一类作用于细胞内酪氨酸激酶区的小分子药物，通过阻断EGFR信号通路，从而抑制NSCLC的生长、转移和侵袭[14,15]。因此在NSCLC患者治疗中检测EGFR基因突变状态至关重要。目前，常用的EGFR基因突变检测的方法包括测序法、突变扩增阻滞系统（ARMS）、微数字PCR、聚合酶链式反应-单链构象多态性分析（PCR-SSCP）、突变体富集PCR、高分辨率溶解曲线分析技术（HRM）、高效液相色谱法（DHPLC）等[13]。由于ARMS法灵敏度及特异性比较高，且方法简单，可以有效地检测出组织及外周血中DNA的敏感突变。因此，本研究采用ARMS技术对云南个旧地区86例NSCLC患者行EGFR基因突变检测，其中石蜡组织标本44例，IIIB~IV期外周血液标本42例及其对应组织学标本16例。旨在探讨云南个旧地区非小细胞肺癌患者EGFR基因突变状况，并分析EGFR突变与临床病理特征的相关性。
在86例云南个旧地区NSCLC患者中，女性患者EGFR基因突变占45.7％（16/35)，高于男性患者39.2％（20/51)，但无统计学意义(P>0.05)，与其他文献报道[7-9]女性患者高于男性患者存在一定差异。分析组织学类型发现，腺癌患者占79.1％（68/86），其EGFR基因突变率为50.0％（34/68）显著高于鳞癌患者11.1％（2/18)，统计学差异明显（P=0.003），这与其他研究报道[7,8]一致。吸烟被公认为肺癌首要危险因素，本研究吸烟患者占47.7％（41/86），其EGFR基因突变率占34.1％(14/41)，不吸烟患者突变率为48.9％（22/45)，吸烟者与不吸烟者无明显差异(P>0.05)，与其他文献报道[7,9]非吸烟患者高于吸烟患者存在一定差异。本研究中个旧地区女性、非吸烟患者EGFR基因突变率与其他研究[7-9]存在差异，可能与该地区环境中的氡、砷等职业暴露因素有关。
EGFR突变主要见于酪氨酸激酶编码区外显子18-21之间，目前被公认的敏感突变包括Exon19 Del及Exon21 L858R突变，被称为常见突变或经典突变[16-18]。本研究分析发现云南个旧地区NSCLC患者EGFR基因以Exon19 del及Exon21 L858R为主，这两类经典突变占总突变的80.1%（29/36）。除上述突变外，EGFR基因其他位点（如G719X、T790M、S768I、L861Q等）称为罕见突变或不常见突变[16]。位于第18外显子G719X（X代表A/S/C）点突变，约占EGFR总突变的2-4%[16,18]，本研究中G719X突变率为5.6%(2/36)，其中1例存在G719X和S768I双突变，与相关文献报道[15] G719X突变率低，常与S768I、L861Q形成二联甚至三联突变结果接近。大量研究[16,19-21]表明，第一代TKIs治疗G719X突变的NSCLC患者的反应较好但低于经典突变，而第二代TKIs治疗G719X突变的NSCLC患者的敏感性则与经典突变相似。位于第20外显子第790位点上的苏氨酸被蛋氨酸所取代（T790M），原发性T790M约占EGFR总突变的3%[22]。有研究证明[14,16,19]该突变还被认为是第一、二代EGFR-TKIs获得性耐药机制中最常见的突变类型。本研究中原发性T790M突变率为2.8%(1/36)，与相关文献报道[22]一致。S768I突变则是发生在EGFR基因20外显子768号密码子的点突变（G＞T），约占所有EGFR突变的5%以下[16,18]，通常与L858R、G719X及L861Q?等位点发生联合突变。本研究中S768I突变率为2.8%(1/36)，且为G719X和S768I双突变，与相关文献报道[16,18]一致。多项临床研究[16,17,20]表明，S768I点突变相比于第一、三代TKIs，S768I突变对第二代TKIs（阿法替尼）有更高的敏感性。位于第21外显子L861Q突变是由2582位点的T被A取代所致，约占所有EGFR突变的2%[18]。本研究中L861Q突变患者占总突变的11.1％（4/36），明显高于其他文献等报道的2%[16,18]。多项研究[14,16,19,23]表明，L861Q突变对第一代EGFR-TKIs敏感性不如经典突变，但第二代TKIs治疗L861Q突变患者的疗效比第一代TKIs更好，这与文献报道[17,21]G719X、S768I突变具有相似性。
综上所述，对于无法获取组织标本的IIIB~IV期NSCLC患者，使用ARMS技术检测外周血中EGFR基因突变结果可靠。本研究中云南个旧地区NSCLC患者EGFR基因突变与国内存在一定差异，该地区EGFR基因的突变以19外显子缺失及21外显子L858R突变为主，且21外显子L861Q突变率相对其他研究较高。EGFR基因突变与组织学类型相关，而与患者性别、年龄及吸烟情况无相关性。出现不相符合的原因很可能与我们的样本数较少或与该地区除吸烟危险因素外，与生产环境中的氡、砷等职业暴露因素有关，对此尚需要进一步扩大病例数进行深入研究。
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论文作者:杨长绍1；朱顺辉2；毛小琴3；王凡3；李光芬1；付思琪1；韩
论文发表刊物:《健康世界》2020年3期
论文发表时间:2020/4/8
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