小鼠皮肤切创愈合过程中血清游离DNA的改变
徐冬冬 王 韵 章丽霞 杜 冰
川北医学院法医学系 四川南充 637000
[摘 要] ①目的 检测皮肤切创愈合过程中血清游离DNA(cf-DNA)变化的时间规律性。②方法 将健康小鼠40只随机分为8组：对照组、0.5小时组、1小时组、2小时组、24小时组、48小时组、4天组和16天组，每组5只小鼠。除对照组外，其余各组建立皮肤切创模型。通过内眦静脉采血后提取血清cf-DNA，随机选取3份DNA样本验证性扩增保守基因(β-actin)。采用荧光核酸蛋白测定仪对cf-DNA进行检测与定量，SPSS 13.0统计分析软件对各组结果进行分析处理。③结果 3份DNA样本均检测到清晰条带，且与β-actin阳性样本位置一致。与对照组相比，0.5小时、1小时和16天时相组cf-DNA含量无明显差异(P >0.05)。2小时、24小时、48小时和4天时相组血清cf-DNA含量明显升高(P <0.05)，其中48小时组最高。④结论 在皮肤创伤愈合过程中血清cf-DNA浓度变化具有一定的规律性及时间相关性，有望成为推断创口形成时间的生物学指标。
[关键词] 损伤时间 游离DNA 创口愈合 皮肤切创
凋亡或坏死组织细胞崩解后DNA片段释放入血形成循环DNA[1]，又称游离DNA(cell-free DNA，cf-DNA)。创伤愈合是一个包括损伤组织炎症反应、增生增殖和成熟阶段的复杂生物学反应。此过程中损伤组织细胞坏死引起cf-DNA水平发生变化，并且可能与损伤时间相关。国内目前对cf-DNA研究多集中在临床领域，而在法医学特别是对皮肤机械性损伤修复时间的推断方面报道较少。本研究拟通过建立小鼠皮肤切创损伤模型，运用荧光核酸蛋白测定仪对小鼠血清cf-DNA进行检测，分析在皮肤创伤愈合过程中其浓度的时序性变化规律，探讨其作为推断病理学损伤时间标志物的可行性。
1 材料与方法
1.1 实验动物和分组 使用健康8周龄清洁级昆明系小鼠40只(川北医学院动物中心提供)，雌雄不限，动物证号SYXK(川)2018-076，体质量(36±5)g。先对小鼠顺序编号，利用Microsoft Excel插入随机数和排序功能设计分组表，随机分为空白对照组和实验组。实验组全部为生前造创，根据造创后采血时间不同分为7组：0.5、1、2、24、48小时组及4、16天组，每时相点5只小鼠；空白对照组未造创。
1.2 方法
1.2.1 切创模型的建立及取材 实验组乙醚气体吸入麻醉，背部剪毛处理后，常规手术消毒，在小鼠背部中央做一纵行长约1.5cm皮肤全层切口，深达筋膜，创面自然止血，不做任何处理。造创后每只小鼠分笼饲养，给予消毒饲料及蒸馏水，防止伤口感染；分别按造创后各时间点通过内眦静脉取全血1mL，自然凝固后离心制备血清。空白对照组未造创直接取材。
基线误差通过经验校正后，通过时间积分，从强震记录得出了地面速度和位移时程。一般情况下，由KiK－Net数据反演得到的滑动模型结果与由高速GPS观测所得结果的吻合效果，比由K－NET数据得到的结果吻合效果好。K－NET数据似乎受场地效应影响很大（记录中的强非线性趋势，应该归咎于布设在松软地面上传感器的瞬时较大倾斜），因此在找到有效的方法对这种效应加以校正之前不可使用。由KiK－Net井下记录得到的速度时程几乎不受经过经验基线校正后仍然存在的残余不确定性的影响，并且由于其较高的采样率（100Hz），可以提供比1Hz的GPS数据更多用速度乃至能量表征地震动的信息。
文献表明，在创伤修复早期，多种细胞因子是推断损伤时间的有价值指标。赖红梅[6]应用Western blot法研究小鼠皮肤创伤模型时发现，损伤部位白细胞介素-1α(interleukin-1α，IL-1α)和白细胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)切创后 1小时开始明显升高，12小时达到高峰，48小时后呈下降趋势；单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemotactic protein 1，MCP-1)在切创后1小时、3小时升高不明显，6小时左右开始升高，48小时达到高峰，72小时有所下降，并提出IL-1α、IL-1β在创伤早期(白细胞反应之前)是推断损伤时间的有效指标，而MCP-1为损伤不敏感指标。李静静[7]对小鼠切创愈合过程中的肿瘤坏死因子-α(Tumor Necrosis Factor，TNF-α)和结缔组织增殖因子(connective tissue growth factor，CTGF)检测发现，TNF-α和CTGF在损伤1天起就有明显表达。TNF-α在伤后3天达到高峰，而CTGF在伤后24小时和6天都维持在高水平的表达，提出结合其他细胞因子水平变化可以用于损伤时间的推断。本研究发现，血清cf-DNA含量在切创后2小时开始出现增加，这可能与损伤造成的组织坏死导致DNA释放增加及细胞因子诱导炎症细胞进入损伤区域开始修复过程有关。以上指标含量改变类似，都属于炎症反应创口的早期变化。因此，血清cf-DNA的含量改变一定程度可以反映机体损伤的早期变化。
〔设计意图：谋篇出发，抓住关键，拟题小结，本节作文课训练重点突出，兼顾整体，在具体实践中让学生明白“好作文不但是改出来的，改作文还有一定的方法”〕
皮肤损伤时间的判定是法医实践中的重要课题之一，检测创伤修复过程中产生的多种生物物质(细胞外基质、黏附分子、生长因子和促炎性细胞因子等)是目前判定损伤时间常用指标，但检材消耗量较大、灵敏度低、操作繁琐等缺点很大程度上限制了此类技术在法医实践中的应用[2]，目前多采用免疫组织化学法和 Western印迹法。针对创伤修复过程中的生物物质的mRNA检测的Real-Time PCR具有灵敏度高、定量检测以及良好的重复性，但由于mRNA自然环境下易降解，有学者认为Real-Time PCR法没有法医学实践意义[3]。荧光染色法检测DNA，可检测到pg级DNA，且不易受RNA、盐、去垢剂、蛋白等干扰，可实现DNA精确定量。本实验利用荧光染料检测DNA的技术优势对血清中的微量cf-DNA进行精确定量。正常生理情况下，人的cf-DNA浓度很低，但在炎症、损伤、剧烈运动等情况下，cf-DNA浓度升高[4,5]。在创伤愈合过程中cf-DNA水平发生变化并且与损伤时间密切相关。
与空白对照组相比，0.5小时、1小时和16天组cf-DNA含量无明显差异(P >0.05)；2小时、24小时、48小时和4天组含量明显升高(P <0.05)，48小时组含量最高，见表1。以组别为X轴，小鼠血清cf-DNA平均浓度为Y轴，使用Microsoft Excel制作XY散点图，见图1a。3份小鼠血清cf-DNA样本的β-actin基因扩增产物条带清晰明显，且与阳性对照位置一致，结合 DNA MarkerⅠ条带位置判断为目的条带(154bp)，见图1b。
1.3 统计学方法 采用SPSS 13.0统计软件对数据进行分析，样本cf-DNA浓度采用
表示，组间比较采用单因素方差分析，以P <0.05为差异有统计学意义。
1.2.4 PCR扩增与检测 检索PrimerBank小鼠β-actin(肌动蛋白)引物信息(引物ID:6671509a1；F:5’-GGCTGTATTCCCCTCCATCG-3’；R:5’-CCAGTTGGTAACAATGCCATGT-3’)，由宝生物(大连)生物公司合成。随机选取3份DNA样本(1小时组、24小时组及16天组各1份)及空白对照和阳性对照(小鼠血液基因组DNA)，采用2xPCR Master Mix PCR试剂(北京天根生化科技有限公司)验证扩增小鼠β-actin基因。扩增体系为20μL，模板加入量为2μL，引物终浓度为0.5μM，其余PCR试剂按说明书推荐量加入。扩增循环参数为：95℃，5分钟，循环0次；95℃，30秒，58.5℃，30秒，72℃，40秒，循环30次；72℃，7分钟。所有扩增产物进行2%琼脂糖凝胶电泳后经GeneGreen染色后，采用Gel Doc XR+凝胶成像系统检测。
2 结果
陪同我们参观的巴兹尔先生还讲了一段小掌故，当年蒙古国有关方面提出要赠捐渥巴锡纪念碑雕像给卡尔梅克共和国，希望安置在共和国首府埃里斯塔。几经讨论，最后市府同意安置在首府，但不是在市中心广场，而是选择较为偏僻的市郊一工业区的绿地上。
表 1不同组别血清 cf-DNA含量比较
注：P *：均与对照组比较
图 1a小鼠皮肤切创愈合过程中
不同时相 cf-DNA浓度变化
图 1b三份 DNA样本 PCR产物电泳
注：B：空白对照；1：1h组；2：24h组；3：16d组；P：阳性对照；M： DNA Marker Ⅰ
3 讨论
1.2.3 DNA定量 将20μL纯化的血清cf-DNA与180μL含荧光染料的PicoGreen工作液(Quant-iTTMPicoGreen® dsDNA 试剂盒)混合，避光于室温下孵育5分钟，用BioSpectrometerTM荧光核酸蛋白测定仪测量的DNA浓度，根据标准曲线(按Quant-iTTMPicoGreen® dsDNA 试剂盒提供Lambda DNA标准品倍比稀释，配成20ng/mL、10ng/mL、5.0ng/mL、2.5ng/mL、1.25ng/mL、0.625ng/mL的标准品溶液)算出样品中DNA的含量。
1.2.2 DNA提取与纯化 采用血清/血浆游离DNA提取试剂盒(离心柱型，北京天根生化科技有限公司)提取血清DNA。取血清200μL，按试剂盒中操作说明进行DNA提取。
从自然资源部获悉，截至今年6月底，我国农村土地制度改革33个试点地区已按新办法实施征地共1101宗、16.6万亩；集体经营性建设用地入市地块970宗、2万余亩，总价款约193亿元，收取土地增值收益调节金15亿元。我国农村土地制度改革完成阶段性目标任务。
以往研究中[2]，创口愈合相关性蛋白的表达峰值一般在损伤后1天左右。本研究发现，血清cf-DNA含量变化具有较明显时间依赖性，在损伤后2小时显著增加，伤后48小时达到高峰，并以较高水平维持到伤后4天，之后有所下降一直维持到伤后16天。陈扬等[8]研究发现中性粒细胞伤后6小时可检出，12小时达到高峰；单核细胞伤后1天可检出，3天达到高峰。血液cf-DNA高峰出现时间与白细胞发挥吞噬作用后大量死亡的时间基本一致。同时，创口大量出现的炎症因子具有扩张血管和增加血管通透性作用，使坏死细胞释放的DNA更容易进入血液循环。Haller等[9]研究耐力跑与cf-DNA关系时，发现低、中等强度跑步运动使体内促炎症细胞因子含量增加，后者触发多种细胞释放cf-DNA，引起血浆和/或血清cf-DNA含量增加。郭志成等[4]通过大鼠过度训练模型发现，过度训练导致的无菌性炎症会引起血液cf-DNA含量显著增加。以上研究提示血液cf-DNA可为早期损伤时间(炎症期)的推断提供参考。
本研究也存在一定局限性。首先本实验只研究了0.5小时、1小时、2小时、24小时、48小时、4天、16天的血清cf-DNA含量变化，对其他时相点(如4小时、8小时、6小时、12小时和8天等)未进行检测，可能对实验结果有一定的影响。其次血液cf-DNA含量改变受很多因素影响，如剧烈运动、癌症、结核病和慢性炎症都可引起cf-DNA浓度变化[10]。扩增小鼠β-actin基因得到清晰的目的条带，说明血清cf-DNA片段长度满足PCR需求。选择小鼠保守DNA片段(B1基因)，通过Real-Time PCR对血清cf-DNA更特异和敏感定量，将是本研究的进一步目标。
综上所述，小鼠皮肤损伤后血清cf-DNA浓度发生改变，一定程度上反应了皮肤损伤愈合的过程。皮肤创伤愈合过程中血清cf-DNA浓度的时序性变化有望作为一种检测指标用于皮肤损伤时间的推断。
参考文献
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Changes of cf -DNA during wound healing in mouse skin XU Dongdong ,
WANG Yun ,ZHANG Lixia ,et al
(Department of Forensic Medicine ,North Sichuan Medical College ,Nanchong 637000,China )
[ABSTRACT ]Objective To investigate the cf-DNA in serum and its time-dependent changes during the skin incised wound healing.Methods A total of 40 healthy mice were randomly divided into control group,0.5h group,1h group,2h group,24h group,48h group,4d group and 16d group,5 mice in each group.Except for the control group,the skin incision models of mice were established in the other groups.Serum cf-DNA was extracted from the inner canthus vein after blood collection,three DNA samples were randomly selected to verify the amplification of conservative gene beta-actin.Serum cf-DNA was detected and quantified by fluorescent nucleic acid protein analyzer.The results of each group were analyzed and processed by SPSS statistical analysis software.Results Clear bands were detected in all three DNA samples,and the location was consistent with that of beta-actin positive samples.Compared with the control group,there was no significant difference in cf-DNA concentration between 0.5h,1h and 16d phase groups(P >0.05).Serum cf-DNA concentration increased significantly in 2h,24h,48h and 4d phase groups(P <0.05).The highest cf-DNA concentration was found in 48h phase group.Conclusion The concentration of cf-DNA inserum is time-dependently expressed in skin wound healing,which can be a useful marker for wound age determination.
[KEY WORDS ]Damage time.cf-DNA.Wound healing.Skin incision
[中图分类号] R 795.1
[文献标识码] A
[文章编号] 2095-2694(2019)05-337-04
①【基金项目】四川省教育厅重点项目(编号：17ZA0182)。
【作者简介】 徐冬冬(1982-)，男，讲师，硕士研究生。研究方向：法医学。
【通讯作者】 章丽霞。
(2019-03-11 收稿)
(张爱国 编辑)
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