（1.陕西师范大学生命科学学院细胞遗传及发育生物学实验室 陕西 西安 710119）
（2.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 北京 100193）
（3.陕西师范大学雁塔区大学医院 陕西 西安 710062）
（4.School of Medicine, Johns Hopkins University, Baltimore, MD 21287, USA）
（5.College of Medicine, Ohio State University, Columbus, OH 43210, USA）
【摘 要】超高分辨率荧光显微技术使生物医学研究进入了“纳米时代”，并因此获得了2014 年的诺贝尔化学奖。随着诺贝尔委员会 “回归”应用的趋势，原子力显微镜术（Atom Force Microscopy, AFM）倍受青睐。基于扫描隧道原理，AFM已渐渐在物理学、化学以及纳米科学的领域里有了突破性贡献。在生物医学领域里，因为原子力显微镜在液相中的不稳定性，而液相又是生物分子的基本特征，所以它的应用一直面临挑战。本文中，我们将首先简单介绍AFM原子力显微镜的基本原理，以生物医学领域中细菌、细胞和病变组织分子水平上研究进展为例介绍了AFM纳米级测量的特征，并就近些年来AFM在活细胞领域中的突破和AFM在医学领域中应用的标准化进行探讨。
【关键词】原子力显微镜；纳米级测量；生物医学领域应用
【中图分类号】R122.1+2 【文献标识码】B 【文章编号】1003-5028（2015）6-0622-02
1 前言
2014 年10月8日诺贝尔化学奖颁发给了美国科学家埃·白兹格（E Betzig）、威·莫纳尔（W Moerner）和德国科学家施·海尔（S Hell），授奖理由是超高分辨率荧光显微技术通过一系列物理原理和化学机理打破了光学成像中长期存在的衍射极限，把光学显微镜的分辨率提高了几十倍，从而使生物医学研究进入了“纳米时代”。随着诺贝尔委员会近些年“回归”应用的现象和趋势，使原子力显微镜很可能是下一个倍受青睐的结构学技术。原子力显微镜及其在生物医学中的应用使得纳米科学在各个领域里都展示出良好的应用前景，特别是在探索人类疾病机理的应用上，它在纳米级测量水平上揭示了各种疾病在分子以及细胞中的变化，使得对人类疾病的研究进入一个全新的阶段。
2 原子力显微镜的工作原理
原子力显微镜原理是在原子级水平检测两个物质之间相互作用，以使我们能直观地看到通常显微镜所看不到的物质结构的一些表面特质，这些特征转化成的图像在理论上往往可以达到纳米级的分辨率[1,2]。近年来，在生物医学领域里AFM除了原理上的可行性也逐渐向应用性上转变，目前原子力显微镜主要有两种工作模式，一种是接触模式（Contact mode），另一种是轻敲模式（Tapping mode）；在接触模式中，探针与物体以恒定的力保持接触，当遇到突然高起或是凹下去的地方时，压电陶瓷会即时伸缩，使两者之间的作用力值保持一定，反馈系统及时将信号记录并呈现在图像上。该模式的一个局限是由于探针与物质是保持接触的，所以如果被测物质表面不够平滑或是粘附力太大，会使得探针受损，或是粘附上其他物质，最终导致图像失真。轻敲模式是探针在恒定的振幅频率下与样品“接触”，在垂直方向上是动态的，这就在一定程度上有效避免了探针在与生物样品如细胞等表面直接接触所造成的损伤（图一）。
图一 原子力显微镜的基本工作原理和模式。上图为力-距曲线（Force-Distance Curve），下图为逼近-退出曲线（Approach-Withdraw Curve）。此图为示意图，探针、探针架、样品等未按比例绘制
生物医学检测的原子力显微镜通常由三部分构成，第一部分是包含微悬臂在内的原子级探针和探针支撑台（Probes and Cantilever Holder）。探针的设计有埃及金字塔式（pyramidal tip）及鼎尖式（conical tip）两种，后一种从原理上讲尖端只有一个原子，可以非常精细地记录物质表面的凹凸变化，但不足之处是容易受损伤，不适宜在液相中工作，特别是表面具有一定黏性的生物材料等；而金字塔式探针相比较就“强壮”许多，不太受表面的影响，即使有突然的接触也不至于受损伤，所以通常用于液相中生物样品的表面测定。同时它存在的缺陷是其最顶尖处不是由一个原子构成的，所以它的分辨率等测得的结果与真实的表面形貌符合度就不是那么高，但是这一技术的开发非常有利于对生物样品进行观测。原子力显微镜的第二部分是其特定的激光校准台（Laser Easy-Align with Head）和电信号截面器（Electronics Interface Box），该部分是用于上样前精确设定及校正探针的位置。为使AFM在原子级上正确工作，探针的位置与校准台必须匹配。
原子力显微镜的第三部分是包括控制台在内的计算机软件控制系统（SPM Control Hardware and Software），它包括对扫描模式的设定，以保证设定模式在程序控制下进行。在生物领域应用里，原子力显微镜还包括了与生物样品相适应的显微镜系统，由于检测的探针是从上部行进至待测物质表面进行扫描的，所以使用的是倒置显微镜，使得物镜对生物医学中细胞等样品的观察和原子力显微镜探针对于样品的扫描可以同时进行，从而保证显微水平的影像与原子级的图形能完美结合。
3AFM在生物医学研究中的优势分析
AFM定量QAM\SPAM检测模式的出现使得AFM在生物医学领域里面的应用有了不可估量的进展 [3]，与电子显微镜包括透射电子显微镜和扫描电子显微镜以及荧光显微镜相比，虽然从理论上来讲，电子显微镜也可以达到AFM同样的分辨率，但是电子显微镜以及上面提到的荧光显微镜都需要对样品进行特殊的前期处理。对于电子显微镜来说，一般的透射电子显微镜需要用锇酸处理，如果是免疫透射电镜的话，样品还需要以金颗粒和抗体进行标记处理。由于不同大小的金颗粒标记抗体，才能检测到蛋白在超微结构上的变化以及其在超微结构上的定位，而且透射电子显微镜不能够做特定蛋白的分布以及细胞内超微结构的分析；对于扫描电子显微镜，样品还需喷碳喷金等处理。同样，荧光显微镜的利用也需要抗体进行标记，需要抗体去识别特定的蛋白，才能够以二抗荧光的状态反映蛋白在细胞内以及组织和病理组织中的分布。并且从另一个角度来讲，电子显微镜和荧光显微镜的结果都是在死细胞的状态下获得的，而原子力显微镜则不同，它可以针对活细胞，在几乎完全接近生理状况的条件下，还能达到电子显微镜和荧光显微镜所揭示的分辨率和放大率水平，并且可以实现定量检测。在理论上，细胞以及生物样品可以不需要经过任何处理就可以直接进行观测。随着条件的改进，AFM甚至可以对细胞生长等过程的的实时观测并达到原子级的分辨水平[3-5]。
4AFM揭示噬菌体穿过细胞外膜的独特结构域
噬菌体是寄生于细菌体内的病毒，这种病毒如果是兼容性的，对细菌本身的结构和生命过程就不会有太大的影响，但是如果该噬菌体是属于爆发性的，就会造成细菌的彻底瓦解。最近利用改良的力矩曲线AFM（Force-distance curve AFM， FD-AFM）详尽追踪了噬菌体从细菌体内释放出来的过程，科研工作者利用原子力显微镜的特点成功捕捉到了上述动态过程，揭示噬菌体在生物体内爆发和从细菌体内释放的过程，并且确定这一动态过程与特定的蛋白相关[6]。这一结果是电子显微镜和荧光显微镜不可能做到的。
上述追踪噬菌体释放过程利用的是噬菌体表面结构的基本特性。实验所用噬菌体表面呈纤维状，顶端处是含有六个组氨酸的多肽结构，当噬菌体穿过细胞外膜被释放出来时，它表面的六个组氨酸的肽结构向外显露。当噬菌体穿过细胞外膜被释放出来的时候，特征修饰的探针就会与六个组氨酸多肽结构专一性地动态结合。镍和组氨酸之间的相互作用反映到力学特征上使得有噬菌体的地方作用力会大大增加，多于没有噬菌体释放至细胞表面的地方，当将这个力学特征呈像时，即可确定出噬菌体在出膜的区域里有个特殊的结构域（domain）。所以，利用生物结构（包括组织结构和细胞结构）表面的氨基酸或其它分子例如多糖等结构的特性，制定相应的探针必将得到相关生物分子相互作用的原子级的崭新信息[6-8]。
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5AFM检测生物医学领域应用的标准化
利用AFM揭示细胞外基质相关疾病的组织构建机理是近些年来该显微镜的重要应用之一 [9-17]。人类许多疾病与细胞外基质有关，细胞外基质变异通常直接造成组织和器官的异常。例如胶原纤维在人类的许多重要疾病如哮喘、肺纤维化、骨骼疾病以及心脏疾病中起重要作用；Fibulin家族蛋白、Integrin家族蛋白、Cadherin家族蛋白和Hemicentin家族蛋白等直接关联到心脏结构包括三尖瓣瓣膜、心肌心血管等的功能，以及小面积损伤后功能的修复等。目前AFM应用最大的一个限制就是还没有规范统一的计算公式，没有行内公认的标准，因而无法规范原子力显微镜下检测所得到的一些反映结构特征的力学特征数据，不同的研究小组各自使用自己的方法，从而使得这个领域略显混乱。
最近科技工作者利用从支气管分离出来的胶原蛋白建立了一个“标准的方法”，从特定意义上来说是建立标准办法去测定胶原蛋白Ⅰ和Ⅱ这两种蛋白在力学上的特征以及它的结构特征[14]，虽然该标准方法是否会被同行认可尚需时间的证实。但显然，这一标准的检测办法或者改进后的检测办法都将是AFM在生物医学领域的一个重要进展。AFM的检测结果发现支气管中分离的胶原蛋白和鼠尾胶原中的胶原蛋白在三维上是有明显区别的，虽然它们都是同一类蛋白，但最终形成组织结构时的宽度是明显不同的。使用这种标准的办法，追踪相关代谢途径上其它蛋白（如糖基化修饰酶等）结构的突变是否会导致功能上的变化就有可能找到细胞外基质相关的发病机理。
6 展望
AFM为胶原蛋白结构应用于揭示相关疾病的分子机理的同时，也为细胞外基质的组织和器官构建分子机理提出了一个更具有挑战性的问题，即“同细胞外基质蛋白不同组织构建”的问题，这也是疾病相关细胞外基质机理研究越来越受重视的原因之一。任何原因导致的疾病不仅仅和细胞生理生化有关，也和细胞与细胞间的功能结构关系、细胞与细胞外基质的构建关系息息相关。而AFM则正是揭示细胞与细胞、细胞与基质的表面纳米级结构的有效工具。随软表面计算方式的完善、生物研究应用中AFM结果“统一标准”的建立、以及细胞表面的半固定处理等都使得这些困难有望得到解决。
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基金项目：
国家重大科学研究计划项目(批准号: 2015CB943100)、国家自然科学基金面上项目（No:31371256）、教育部中央高校团队项目（No:GK201301001）、教育部外事局“海外名师”项目（No:MS2014SXSF038）和秦巴山区持续发展中心项目（No: CIC-QBRSD）资助
* 共同第一作者
**通讯作者：
徐学红博士、特聘教授、博士生导师。Email：xhx0708@snnu.edu.cn
论文作者:周鑫,吕俊才,王荣荣, 郭玲, 牟玉莲,陈娟,
论文发表刊物:《河南中医》2015年6月供稿
论文发表时间:2015/10/19
标签：原子论文; 显微镜论文; 细胞论文; 噬菌体论文; 探针论文; 电子显微镜论文; 结构论文; 《河南中医》2015年6月供稿论文;