（湖北省荆门市康复医院 湖北 荆门 448000）
【摘要】 目的：探讨新型多重PCR方法对常见呼吸道病毒的诊断应用。方法：选取2015年3月至2016年2月于我院就诊的呼吸道病毒感染患者62例，从标本中提取病毒核酸 RNA/DNA，通过反转录合成c DNA，对目的基因进行多重PCR扩增，并对扩增产物采取电泳检测。结果：对62例呼吸道感染病人的标本进行多重PCR扩增检测后，发现阳性29例，总阳性率46.8%(29/62)，其中以流感病毒为主，占病毒阳性检出48.3%(14/29)，两种或两种以上病毒混合感染5例。结论：运用多重PCR技术检测呼吸道病毒感染病例的呼吸道标本，检出多种呼吸道病毒和合并感染情况，初步验证了该多重PCR技术能用于快速检测该类病例的呼吸道标本，能够为急性病毒性呼吸道感染的常规监测、应急处理及临床诊断提供快速检测手段和更多的病原学依据。
【关键词】多重PCR方法；呼吸道病毒；诊断；应用
【中图分类号】R446 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2017）02-0159-02
呼吸道病毒的类型有很多种[1]，包含有甲型人流感病毒（Flu A）、乙型人流感病毒（Flu B）、小RNA病毒（Pico RNA）、冠状病毒（CoV）、腺病毒（ADV）等等，其主要是以空气飞沫的形式进行传播[2-3]。由于不同类型呼吸道病毒在感染后的临床表现相近[4]，很难对其具体种类进行鉴别。因此寻找一种能够有效诊断呼吸道病毒的方法显得尤为必要。本次临床研究，我们选取了2015年3月至2016年2月于我院就诊的呼吸道病毒感染患者62例，利用新型多重PCR方法对其进行诊断，对结果作相关分析，结果报告如下：
1.资料与方法
1.1 一般资料
资料来源于2015年3月至2016年2月于我院就诊的呼吸道病毒感染患者62例，年龄0.5～83岁，平均年龄（39.3±2.7）岁。其中，男性31例，年龄在0.5～81岁之间，平均年龄为（37.4±1.9）岁；女性31例，年龄在0.7～83岁之间，平均年龄为（39.9±2.8）岁。在发病初的3天内，对患者进行鼻咽拭子的标本采集，于病毒转运培养液中存放，保持温度在4℃，采用冷链运输在48小时内将其送到实验室。
1.2 标本病毒核酸的提取
取鼻咽拭子标本于EP管中，按照试剂盒说明书所述对样本中的病毒核酸进行抽提，抽提后将其置于零下80摄氏度环境中保存备用。
1.3 模板核酸的反转录
将核酸样本加入到盛有六聚体引物以及水的反应管中，将其放置在PCR仪中进行80℃的保温，时长为3min，于冰上进行2min的冷却之后，于管中加入反应液，进行c DNA合成反应， 37℃进行90min，94℃进行2min，冰上冷却进行2min。将反转录产物放于- 20℃环境中保存备用。
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1.4 多重 PCR 扩增
对合成的每份c DNA样本，分别进行两组多重PCR反应，RV1 A组对间质肺病毒、腺病毒、副流感病毒1/2/3型以及冠状病毒229E进行检测，RV1 B组对呼吸道合胞病毒A/B型、流感病毒甲/乙型、鼻病毒以及冠状病毒OC43进行检测。依次加入3ul的c DNA、4ul的5×RV1A或5×RV1B引物、3ul的8-Mop 溶液、以及10ul的2×Master Mix。多重PCR扩增操作如下：在94℃下进行15min的预变性和30s的变性，在60℃下进行1.5min的退火，在72℃下进行1.5min的延伸，循环40次后，在72℃下进行10min的延长。将扩增产物保存于4℃下，待电泳检测。
1.5 电泳检测扩增产物
取PCR产物5ul以及RV1 A marker或RV1 B marker 5ul，进行电泳检测，检测条件为2.0%琼脂糖凝胶、100V电泳1h左右，观察凝胶成像结果。
2.结果
对62例呼吸道感染病人的标本进行多重PCR扩增检测后，发现阳性29例，总阳性率46.8%(29/62)，其中以流感病毒为主，占病毒阳性检出48.3%(14/29)，其次是腺病毒6例(20.7%)；呼吸道合胞病毒5例(17.3%)；副流感病毒检出4例(13.8%)。两种或两种以上病毒混合感染5例。
3.讨论
实验室检查对呼吸道感染病毒的传统诊断方法包括血清学检测、病毒分离以及抗原分析等[5]，这些方法普遍操作时间较长，且过程复杂，对人冠状病毒、副流感病毒等进行细胞分离培养也非常困难[6]，病毒合并感染现象普遍存在，在细胞培养中一种病毒的复制可能会抑制或掩盖另一种病毒的复制，细胞培养方法难以检出标本中可能存在的病毒合并感染，还常出现临床症状典型且流行病学支持的病例标本检测结果为阴性的情况，对该类疾病的早期诊断以及疫情的应急处理十分不利[7]。因此，迫切需要对呼吸道感染病毒灵敏好、特异强的实验室诊断方法。本次临床研究中，我们对62例呼吸道病毒感染患者进行新型多重PCR方法的检测结果的相关分析，发现阳性29例，总阳性率46.8%，两种或两种以上病毒混合感染5例。采取速度快、特异性强且灵敏度高的多重PCR技术对不同类型的呼吸道病毒、不同亚型的同一类型病毒进行同时检测，可以为快速诊断流感样的病例提供更为确切的病原学证据。本研究所采用的多重PCR检测呼吸道感染病毒的方法，特异性高，能够特异的对多种不同的呼吸道病毒同时作出检测，使具体的操作步骤得到减少，并且使交叉污染出现的可能性得到降低。该种方法还需要进行大量的样本验证，并需使呼吸道病毒检测范围进一步扩大。
综上所述，本次研究中所采取的多重PCR方法对病例的呼吸道感染病毒标本进行检测，发现了多种类型的呼吸道病毒以及不同病毒合并感染的情况，初步对该多重PCR技术在快速检测呼吸道感染病例的呼吸道样本方面进行了验证，将能够为呼吸道急性、病毒性感染的日常监测、紧急情况处理和诊断提供更为方便的检测手段和更加确切的病原学证据。
【参考文献】
[1]翁学军，张甦，杜英等.多重实时荧光定量PCR技术检测儿童呼吸道新发病毒方法的建立与应用[J].中华检验医学杂志， 2013，36(6):538-542.
[2]王乐，赵梦川，石仲仁等.GeXP多重RT-PCR技术在儿童呼吸系统病毒感染病原体检测中的应用[J].中华检验医学杂志，2015， 38(12):852-856.
[3]徐昌平，卢亦愚.DPO引物多重RT-PCR技术检测甲型流感病毒的研究[J].浙江预防医学，2013，25(1):5-7，16.
[4]李爱华，张铁钢，石伟先等.三种呼吸道病毒实验室检测方法比较[J].中华微生物学和免疫学杂志,2013,(7):541-544.
[5]王洁，李利平，王卫萍等.4种常见呼吸道病毒快速分子检测方法的建立[J].东南国防医药，2013，15(6):551-555.
[6]牛培华，张晨，陆柔剑等.同时检测六种人类冠状病毒的单管多重RT-PCR方法的建立[J].中华预防医学杂志，2014，48(5):416-419.
[7]刘艳芳，韩光跃，李岩等.178例5岁以下儿童急性呼吸道感染病毒病原学研究[J].现代预防医学，2013，40(22):4254-4256，4259.
论文作者:陈信良,朱金林
论文发表刊物:《医药前沿》2017年1月第2期
论文发表时间:2017/2/7
标签：病毒论文; 呼吸道论文; 方法论文; 标本论文; 两种论文; 流感论文; 呼吸道感染论文; 《医药前沿》2017年1月第2期论文;