广西玉林市第一人民医院 广西玉林 537000
摘要：目的 在肝癌组织切片检查中，使用DNA缺口末端标记（TUNEL）的同时，搭配使用免疫组化DcR3染色方式，分析应用效果。方法 选择2014年4月到2015年4月本院以手术方式切除的12例肝癌组织分别切片4张，1号切片单纯进行TUNEL，2号切片单独进行免疫组化诱捕受体3（DcR3）染色，3号切片先免疫组化DcR3染色随后进行TUNEL，4号切片先TUNEL后行合免疫组化DcR3染色，研究DcR3在病变组织中表达形式和细胞凋亡最适合联系方法。结果 14例肝癌组织切片样本中，1号切片中可判定11例细胞凋亡状况，2号切片当中有10例阳性，3号切片或者4号切片均能观察到11例细胞凋亡情况、10例免疫组化DcR3染色阳性。结论 在同1张肝癌组织切片上使用TUNEL的同时，搭配使用免疫组化DcR3染色的方法，可实现同时判定细胞凋亡与DcR3的表达形式。
关键词：TUNEL；免疫组化DcR3染色；肝癌组织切片
TUNEL技术主要用在原位检测细胞凋亡状况之中，属于分子生物学与细胞形态学相结合的研究方式，对处于无残缺状态的单个凋亡细胞核实施原位染色，可正确判定凋亡特点。DcR3是肿瘤坏死因子受体超家族中的一员，可以阻断细胞凋亡。
1.资料与方法
1.1一般资料
选择2014年4月到2015年4月在本院进行手术切除的12例肝癌组织样本，均通过甲醛固定和石蜡包埋处理。切片厚度均为4um，共4张。
1.2方法
将4张切片进行分号，便于研究。1号切片单纯进行TUNEL，2号切片单独进行免疫组化诱捕受体3（DcR3）染色，3号切片先免疫组化DcR3染色随后进行TUNEL，4号切片先TUNEL后行合免疫组化DcR3染色。在进行TUNEL联合免疫组化DcR3染色操作时，流程均按照说明书进行。
1.3判定标准
1.3.1免疫组化DcR3染色
只要细胞当中发现显著棕红色颗粒，该细胞为阳性，如其在25%分数以下为0，、25%到50%分数为1、51%到75%分数为2、在75%以上分数为3；根据样本中细胞是否存在染色、染色深浅判定分数，无染色分数为0、浅棕红色分数为1、棕红色分数为2、鲜红色分数为3。最后将以上两种评分方式的得分进行相加，分数在2以下的标记为（-）、2到3分标记为（+），4到5分及不少于6分分别标记为（++）和（+++），2分以上的均可判定为阳性。
1.3.2TUNEL判定依据
此方式处理的凋亡细胞颜色定位为蓝黑色，依据其各种特性进行判定，每例视野倍数定位在大于10倍的限度内，DMR+Q550病理分析设备统计的细胞数量在1000以上，统计范围内包含凋亡细胞，判定凋亡指数（AI），可以按照凋亡细胞数量比上1000的方式进行计算。
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1.4统计学处理
全部资料使用SPSS19.0统计学软件进行处理，计量资料使用（）表示，使用t进行分析，计数资料使用检验，P＜0.05表示对比差异有统计学意义。
2.结果
使用TUNEL之后，凋亡细胞被标记成蓝黑色，位置被确定在细胞核，分布形式为散在；对于免疫组化DcR3阳性细胞而言，其细胞质内出现鲜红色颗粒，分布形式为弥散性、小型巢状，也可能散在分布。14例肝癌组织切片样本中，1号切片中可判定11例细胞凋亡状况，2号切片当中有10例阳性，3号切片或者4号切片均能观察到11例细胞凋亡情况、10例免疫组化DcR3染色阳性。在1个切片中使用不同的检测方式，会得到不同结果，在同1细胞之上，没发现凋亡细胞与表达DcR3共存的现象；4号切片中可同时观察到2中阳性物，其凋亡细胞黑蓝信号比3号切片强，而且3号切片的免疫组化阳性信号也被削弱。
3.讨论
真核细胞死亡方式中，细胞凋亡是较为普遍的一种。细胞凋亡之后，细胞核和细胞质会在组成方面出现较强的变化。检测凋亡细胞的方式很多，比如透射电镜检测法、TUNEL等。TUNEL检测速度较快，使用方便，其检查方式让原本的细胞凋亡分析工作出现了新的变化，可在很多类DcR3表达在癌症组织和细胞凋亡试验之中。
此次研究中，同时把TUNEL和免疫组化DcR3然后作为首选染色，研究表明，将TUNEL染色放在开始进行较佳，2种阳性物能够被明显发现，显示此种检测方式对免疫组化没有较大影响。如果将免疫组化放在开始进行，那么TUNEL检测到的凋亡信号就会因受干扰而变小，同时免疫组化阳性信号也同时变小。通过分析，出现此种状况可能是因为：在使用TUNEL方法之前，使用的高浓度蛋白K消化让免疫组化过程中很多生成物受到损坏；在使用双重染色的时候，应用增强剂加强染色效果，增强剂大部分是由酸性溶液组成的。免疫组化过程中会产生抗原抗体复合物，增强剂可以将这些物质洗脱，也会在一定程度破坏这些物质的颜色。
TUNEL药盒说明书当中写明了样本预处理的很多方式，此次研究中应用了蛋白酶K，也应用了柠檬酸盐溶液，然后使用高压锅对其进行蒸煮，两种方式都在检测均有较好表现。但是，蛋白酶K可能会对阳性判定造成阻碍。因此，在使用蛋白酶K时，应严格管控其浓度和应用时间，如果消化所消耗的时间延长，那么细胞膜就可能出现通道过多的现象，能够顺利让TdT酶顺利发挥作用。与此同时，超过限度的蛋白酶K能损毁组织构成，导致假阳性现象出现。此次使用20ug/ml的蛋白酶K，融于PH为7.4到8.0的0.01mol/L Tris-HCL之中，在室温中放置半小时，最终效果较为理想。在高压条件下煮沸可以对氨基酸产生作用，让其肽键断裂，让细胞膜本身的构成得以复原，穿透效果也随之得到加强，提升染色速度。要根据实际情况控制煮沸时长。研究中的Tris-HCL溶液煮沸2min之后为发现掉片，染色状态较好。使用TUNEL时，室温变化会对显色时长产生影响，采取符合条件予以解决。
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论文作者:黄庆文,陈伊,阙丽琳
论文发表刊物:《健康世界》2015年22期
论文发表时间:2016/3/9
标签：切片论文; 细胞论文; 免疫论文; 凋亡论文; 阳性论文; 肝癌论文; 方式论文; 《健康世界》2015年22期论文;