（遵义医学院附属医院 贵州 遵义 563000）
【摘要】目的：研究慢性阻塞性肺疾病（COPD）小鼠体内辅助性T细胞17（Th17）、调节性T细胞（Treg）的变化，进一步探讨COPD的发病机制。方法：将SPF级C57BL/6小鼠分为对照组10只和COPD模型组16只。使用烟熏法建立COPD小鼠模型。实验第28天处死两组小鼠，收集肺组织，作石蜡切片及HE染色。流式细胞术检测肺组织中Th17及Treg的变化。结果：（1）COPD模型组小鼠肺组织HE染色可见明显的肺部炎症及肺气肿形成；（2）与对照组相比，COPD模型组小鼠肺组织中Th17的百分比含量增高，而Treg的百分比含量降低；（3）Th17/Treg的比值在COPD模型组小鼠肺组织中高于对照组。结论：香烟烟雾可能导致Th17/Treg失衡，Th17/Treg失衡可能参与COPD的发病机制。
【关键词】慢性阻塞性肺疾病；辅助性T细胞17；调节性T细胞
【中图分类号】R563.9 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2018）26-0082-03
The changes and significance of Th17/Treg cells in mice with chronic obstructive pulmonary disease
【Abstract】Objective To study the changes of Th17 and Treg in mice with chronic obstructive pulmonary disease (COPD), and to further explore the pathogenesis of COPD.Methods The C57BL/6 mice of SPF grade were divided into control group(n=10) and COPD model group(n=16). Exposure to cigarette-smoking was used to establish the mice model of COPD.At 28 daysof the experiment, the mice in two groups were sacrificed and the lung tissue samples were collected. The lung tissue were investigated by HE staining. The changes of Th17 and Treg in lung tissue were detected by flow cytometry.Results (1)The lung tissue in the COPD model group were stained by HE showed significant pulmonary inflammation and formation of emphysema;(2)Compared with the control group, the percentage of Treg was decreased in the lung tissue of COPD model group, and the percentage of Th17 was higher;(3)The ratio of Th17/Treg in the lung tissue of COPD model group was higher than that in the control group.Conclusion Cigarette smoke could lead to the imbalance of Th17/Treg, the imbalance of Th17/Treg may be involved in the pathogenesis of COPD.
【Key words】Chronic obstructive pulmonary disease; T helper 17 cells; Regulatory T cells
慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）是一种常见的可以预防和治疗的呼吸系统疾病，其发病率和死亡率在全球范围内呈逐年上升趋势[1]。COPD的发病与长期吸烟等有害因素引起的异常炎症反应密切相关，但其具体机制至今尚不明了。最新研究表明，CD4+T淋巴细胞介导的免疫炎症可能与COPD的发病有关[2,3]。辅助性T细胞 17（Thelpercells 17，Th17）和调节性T细胞（regulatory T cells，Treg）是重要的CD4+T细胞亚群。Th17细胞可以促进炎症反应的发生[4]，白细胞介素-17（interleukin-17，IL-17）是它分泌的一种关键性活化因子，可以促使多种细胞释放炎性介质，从而介导炎症反应。而Treg细胞具有免疫抑制作用，不仅能抑制炎性介质的产生，还能抑制炎性细胞的分化、增殖，叉头状转录因子3（forkhead box protein 3，Foxp3）可以控制它的生长、分化和功能，是鉴定Treg最可靠的检测指标。在炎症性疾病发病中两种细胞在功能上相互拮抗。正常状态下，Treg细胞和Th17细胞之间的相对平衡在维持免疫稳态中有决定性意义。若这种平衡被破坏，就会导致免疫炎症性疾病发病[5,6]。
因此，本研究拟通过烟熏法建立COPD小鼠模型，流式细胞术检测小鼠肺组织中Th17细胞和Treg细胞的变化，以期为COPD的发病机制提供新的理论依据。
1.材料
1.1 实验动物
SPF级C57BL/6小鼠26只，雌雄不限，6～8周龄，体重20g～25g，由第三军医大学实验中心提供，许可证号为SCXK（渝）2012-0005。
1.2 主要材料
黄果树牌香烟（焦油量：11mg；烟气烟碱量：0.9mg；烟气一氧化碳量：13mg）（贵州中国工业有限责任公司）。Anti-Mouse CD4 FITC、Rat IgG2a K Isotype Control FITC、Anti-Mouse CD25 PE-Cyanine5、Rat IgG1 K Isotype control PE-Cyanine5、Anti-Mouse/Rat Foxp3 APC Rat IgG2a K Isotype control APC、Anti-Mouse/Rat IL-17A PE、Rat IgG2a K Isotype control PE、Flow Cytometry Staining buffer、Fixation/Permeabilization Concentrate Fixation/Permeabilization Diluent（上述试剂均来自eBioscience公司）。
2.方法
2.1 动物模型的制备和分组
将26只C57BL/6小鼠随机分为对照组（n=10）和COPD模型组（n=16）。将16只模型组小鼠置于自制有机玻璃烟熏箱内（大小为90cm×40cm×30cm，箱盖上有9个1.5cm×1.5cm大小的通气孔），每日被动吸烟4次，6支烟/次，1h/次，共28天。10只对照组小鼠则暴露于空气中，正常饲养。
2.2 肺组织病理学检测
取小鼠右肺下叶用4% 的多聚甲醛固定 24 h ，石蜡包埋切片，组织切片进行 HE 染色。使用软件IPWin32采集HE染色切片图像，随机采集多个完整气道图像，最后由我院病理科医师分析图片。
2.3 制备单细胞悬液
在RPMI 1640培养基中加入Ⅳ型胶原酶粉，配制Ⅳ型胶原酶。将肺组织剪碎，放入盛胶原酶的离心管中，置于水浴箱内（37℃），直至肺组织消化，收集消化液，过滤至第二个试管，离心，弃上清；加入2ml PBS，用吸管吹打，离心，弃上清；加入5ml红细胞裂解液，裂解直至溶液透明，离心，弃上清；再用PBS漂洗，离心，弃上清；最后加入1ml含1%FBS的PBS及200ul 1%多聚甲醛，振荡混匀，即为所需悬液。
2.4 流式细胞术检测CD4+IL-17和CD4+CD25+ Foxp3的变化
CD4+IL-17检测：在250ul单细胞悬液中加入250ul RPMI1640培养基，再加入2ul 250×PMA/Ionomycin及2ul 250×Monensin/BFA，置于5%CO2孵箱内培养5h；测定管加入4ul Anti-Mouse CD4 FITC，对照管加入4ul Rat IgG2a?K Isotype?Control?FITC；各加入200ul培养好的单细胞悬液，孵育、固定、漂洗、溶血、破膜，再于测定管中加入2ul Anti-Mouse/Rat IL-17A PE，对照管中加入2ulRat IgG2a K IsotypecontrolPE，然后孵育、漂洗，上机检测。
CD4+CD25+Foxp3检测：测定管加入4ul Anti-Mouse CD4 FITC、2ul Anti-Mouse CD25 PE-Cyanine 5，对照管加入4ul Rat IgG2a K Isotype Control FITC、2ul Rat IgG1 K Isotype control PE-Cyanine 5；各加入200ul单细胞悬液，孵育、漂洗，漩涡震荡细胞沉淀，各管中加入1ml现配制的固定/破膜工作液，再孵育、漂洗；测定管中加入5ul Anti-Mouse Foxp3 APC，对照管中加入5ul Rat IgG2a K Isotype control APC，最后孵育、漂洗，上机检测。
2.5 统计学处理
采用SPSS17.0 统计软件进行分析，实验数据以（x-±s）表示。组间比较采用单因素方差分析进行检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。
3.结果
3.1 两组小鼠的一般情况
对照组：小鼠全身皮毛光泽，精神活动正常自如，呼吸平稳，食欲正常，体重增加，体型饱满，实验期间小鼠无死亡。
COPD模型组：小鼠全身皮毛干枯、灰暗，精神倦怠，双眼微闭，活动减少，呼吸急促，食欲减退，体重下降，且上述症状呈逐渐加重趋势，烟熏期间小鼠无死亡。
3.2 光镜观察小鼠肺组织病理特征
对照组：肺泡结构清晰，肺泡壁完整且连续，肺泡间隔可见少量炎症细胞浸润（见图1A）。
COPD模型组：肺泡结构破坏，多数肺泡相互融合形成较大的肺泡腔，肺泡间隔有明显的炎症细胞浸润（见图1B）。
4.讨论
COPD是一个严重危害公众健康的全球性问题。吸烟被公认为COPD发病最关键的诱发因素，然而，COPD患者戒烟后肺组织及气道炎症仍持续存在，这表明COPD的发病机制可能与自身免疫炎症有关。香烟烟雾可能导致T细胞启动一个“异常”的免疫应答，导致机体免疫失调，使COPD患者易患呼吸道感染[7]。
本研究采用烟熏法建立COPD小鼠模型，烟熏第28天取小鼠肺组织行HE染色，观察肺组织病理形态变化，结果显示：与健康对照组相比，COPD模型组小鼠有明显的肺部炎症及肺气肿改变，符合人类COPD的特征性病理变化，提示COPD小鼠模型建立成功。
迄今为止，在COPD的发病机制中香烟烟雾对初始T细胞的作用尚不明确。因此，本实验观察香烟烟雾诱导的COPD小鼠模型肺组织中Th17细胞和Treg细胞的变化，结果表明COPD模型组小鼠肺组织中Th17的百分比含量高于对照组，而Treg的百分比含量则低于对照组。香烟烟雾是Th17细胞的一种有效佐剂，它能够诱导IL-1β、IL-6等效应性细胞因子的产生[8]，这一类细胞因子又能够抑制Foxp3的表达和Treg细胞的分化，并且使Treg细胞向Th17细胞转化，这可能是COPD中存在Th17/Treg失衡的原因之一。有研究者发现在慢性过敏性气道炎症中Th17细胞可以抑制Treg细胞介导的免疫应答[9]。也有研究发现在肺炎支原体抗原诱导的炎症模型中Treg细胞又可通过减少IL-17的产生抑制Th17细胞介导的免疫激活[10]。Th17/Treg 失衡与 COPD患者的肺功能恶化和疾病进展有关[11]。上述结果均提示Th17细胞和Treg细胞介导的免疫失衡在COPD的发病过程中可能具有重要的作用。
为了评估COPD模型组小鼠体内Th17/Treg失衡的程度，本研究计算每一个实验标本中Th17与Treg的比值，结果显示与对照组相比，COPD模型组小鼠肺组织中Th17与Treg的比值增高，提示香烟烟雾打破Th17/Treg的相对平衡，偏向于Th17细胞介导的免疫炎症反应，同时抑制Treg细胞的免疫调节作用，从而使COPD的炎症反应持续存在且不断放大，因此，有效调节Th17/Treg失衡可能是延缓COPD病情进展的关键关节。
总之，本研究结果提示香烟烟雾可能导致Th17细胞和Treg细胞介导的免疫失衡，提示肺组织中Th17/Treg失衡可能参与COPD的发病机制。为了提供COPD患者更好的临床治疗方案，我们仍需进一步研究如何调节其免疫失衡。
【参考文献】
[1] Vogelmeier CF, Criner GJ, Martinez FJ, et al. Global Strategy for the Diagnosis, Management, and Prevention of Chronic Obstructive Lung Disease 2017 Report.GOLD Executive Summary[J].Am J Respir Crit Care Med.2017.195(5):557-582.
[2] Zhao P,Li J,Tian Y, et al. Restoring?Th17/Treg?balance via modulation of STAT3 and STAT5 activation contributes to the amelioration of?chronic obstructive pulmonary disease?by Bufei Yishen formula.[J]. J Ethnopharm acol.2018.217:152-162.
[3] Forsslund H,Yang M,Mikko M,et al.Gender differences in the T-cell profiles of the airways in COPD patients associated with clinical phenotypes[J].Int J Chron Obstruct Pulmon Dis.2016.12:35-48.
[4] Lee HS, Park HW, Song W J, et al. TNF-α enhance Th2 and Th17 immune responses regulating by IL23 during sensitization in asthma model[J]. Cytokine. 2016. 79:23-30.
[5] Handono K, Firdausi SN, Pratama MZ, et al. Vitamin A improve Th17 and Treg regulation in systemic lupus erythematosus[J].Clin Rheumatol. 2016. 35(3): 631-638.
[6] Lim SM, Kang GD, Jeong JJ, et al. Neomangiferin modulates the Th17/Treg balance and ameliorates colitis in mice[J]. Phytomedicine. 2016. 23(2):131-140.
[7] Liao SX, Ding T, Ou-Yang Y, et al. Cigarette smoke affects dendritic cell maturation in the small airways of patients with chronic obstructive pulmonary disease[J]. Mol Med Rep. 2015. 11(1): 219-225.
[8] Li H, Liu Q, Jiang Y, et al. Disruption of th17/treg balance in the sputum of patients with chronic obstructive pulmonary disease[J]. Am J Med Sci. 2015. 349(5):392-397.
[9] Zhao J, Lloyd CM, Noble A. Th17?responses?in?chronic?allergic?airway?inflammation abrogate regulatory?T-cell-mediated?tolerance?and contribute?to?airway remodeling[J]. Mucosal Immunol. 2013. 6(2):335-346.
[10] Kurata S, Osaki T, Yonezawa H, et al. Role of IL-17A and IL-10 in the antigen induced inflammation model by Mycoplasma pneumoniae[J]. BMC Microbiol. 2014. 14:156.
[11] Imani S,Salimian J,Fu J,etal.Th17/Treg-related cytokine imbalance in sulfur mustard
exposed and stable chronic obstructive pulmonary(COPD) patients:correlation with disease
activity[J].Immunopharmacol Immunotoxicol.2016.38(4):270-280.
课题基金来源：国家自然科学基金（81460008）号.
作者简介；张婧（1989.06-）女，汉族，贵州遵义，硕士研究生，住院医师，COPD的发病机制，单位：遵义医学院附属医院.
通讯作者简介：欧阳瑶（1965.11-） 女,汉族,硕士,主任医师,科主任,COPD的基础与临床,单位：遵义医学院附属医院,邮箱：huangyucheng2018@163.com.
论文作者:张婧,张兰英,欧阳瑶（通讯作者）
论文发表刊物:《医药前沿》2018年9月第26期
论文发表时间:2018/10/15
标签：小鼠论文; 细胞论文; 炎症论文; 模型论文; 组织论文; 肺泡论文; 免疫论文; 《医药前沿》2018年9月第26期论文;