哈药集团三精制药有限公司 150000
【摘 要】目的：使用HPLC方法来针对连翘中连翘苷含量的不确定性进行分析，总结导致不确定因素产生的成因。方法：结合我国官修药典相应的连翘含量测定法来规范测定过程，并且针对测量过程进行分析来找出不确定度产生的成因；结果：使用HPLC这种方法来测定连翘苷含量的不确定度大约为1%，最终确定其含量不确定度的主要源为对照品称量。
【关键词】连翘；连翘苷；含量测定；不确定度；高效液相色谱法
实验室质量控制可以在很大程度上决定实验结果和测量不确定度。通过一系列不确定因素的控制就可以找到一个测量数值的合理区间，进而让一个数值变为一个阈值范围，不免将检验结果错判，保证检测结果的有效性。连翘花是木犀科植物的一种，在民间多作为茶类饮品，对于风热感冒、咽喉肿痛等症状的治疗有奇效。但是目前对于连翘花中的连翘苷测定的相关文献还仍然较少，本文对连翘苷含量的测定方法进行了简要介绍，并且总结了不确定度的影响要素，希望可以给相关工作的开闸能提供一些参考。
1仪器与材料戴安Ultimate3000高效液相色谱仪(CHROMELEON工作站，紫外检测器)；METrLERAX205DR电子天平(瑞士)；RQ一300VDE型双频数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。连翘苷对照品购自中国药品生物制品检定所(批号为110821—200508)，甲醇(色谱纯，MERCK)，水为高纯水。连翘花药材2007年4月采自河南省林州市石板岩乡王相岩桃花谷，经李振国主任药师鉴定为木犀科植物连翘Forsythiasuspense(Thunb．)VaIll的干燥花。
二、连翘花中连翘苷的含量测定
（一）色谱条件
色谱柱为DIONEXC18色谱柱(DIONEXAcclaim，5Ixm，150x4．6am)，乙腈一水(25：75)为流动相，流速1．0ml／min，柱温30℃，检测波长277nm。
（二）对照品溶液制备
精密称取连翘苷对照品5．14mg置25ml容量瓶中，加甲醇使溶解并定容至刻度，摇匀，，备用。
（三）供试品溶液制备
取连翘花粉末(过三号筛)约0．1g，精密称定，置25ml容量瓶中，加甲醇20ml，超声提取(功率300W，频率50kHz)20min，放置至室温，加甲醇稀释至刻度，摇匀，用0．45μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。
（四）系统适用性试验
理论板数按连翘苷峰计，不低于3000；连翘苷与其前峰的分离度R>1．5；拖尾因子T在0．95～1．05之间。
（五）考察线性关系
吸取先前准备的对照品溶液，分别为1ml、2ml、4ml、6ml、8ml、10ml，将其置于10ml的容量瓶当中，摇匀并稀释甲醇，取上述溶液各10μl进行分析，在二维坐标系上横坐标为浓度、纵坐标为峰面积，在绘制标准曲线后进行回归计算，经过计算可得连翘回归方程为y-0.07=10.39x，所以在0.2056ml的值附近，线性关系较为良好。具体色谱图如图1 所示。
图1 HPLC色谱图
A．对照品HPLC色谱图；B．样品HPLC色谱图
1．连翘苷(Forsythin)
（六）精密度实验
结合前文（三）之下所采取的方法制取试品溶液，进行6次进样，每次进样为10μl，计算连翘苷峰面积积分，取得rsd值，相关实验结果可以证明10小时内连翘苷都具有良好的稳定性，rsd大约为2.91%。
（七）稳定性实验
取得上述试品溶液后，每隔2h进行一次10μm进样，之后结合连翘苷峰面积积分来计算rsd，结果证明其在10h内都有良好的稳定性，rsd也为2.91%。
（八）重复性试验
照（三）项下方法制得供试品溶液6份，进样测定，根据 峰面积积分值，计算连翘花中连翘苷的含量为1．50％，RSD为 2．03％。
（九）加样回收率试验
取连翘花粉末约0．05 g，精密称定，加入已知浓度的对照 品溶液(0．428 mg／m1)2 ml，照（三）项下方法制得加样回收 供试品溶液，测定，计算连翘苷的平均回收率为102．33％，RSD 为2．33％(n=6)。
（十）样品测定
按（三）项下方法制得供试品溶液，进样分析并计算连 翘花中的连翘苷含量为1．5%。
表1连翘花中连翘苷的回收率结果
三、不确定度来源分析
从检测过程及数学模型分析连翘中连翘苷含量 测定的不确定度来源主要有以下几个方面：对照品、 供试品的称量对照品和供试品溶液制备 过程中稀释体积、对照品和样品峰面积 (A样、A对)的重复性引入的不确定度。
（一）不确定度分量的量化
（1）对照品纯度引入的相对标准不确定度
连翘 苷对照品由中国食品药品检定研究院提供，仅给出纯 度为96．8％，并未给定其不确定度信息，故在此不对 其进行评定。
（2）对照品称量引入的相对标准不确定度
对照品的称量使用BP211D型电子天平(d= 0．01 mg)，其不确定度来源有2个，即：天平示值误差 和天平的重复性。①天平示值的不确定度分析由天平的检定证书 可知，天平示值的最大允许误差为±0．05 mg。②天平称量重复性的不确定度分析此天平重复 性的最大允许误差为0．15 mg。
三、讨论
在本次实验中，将连翘苷作为主要考察指标，采用了不同的溶剂，分别是水、以及三种不同浓度的甲醇，并且采用了不同的提取方式和不同的超声时间，结合具体的对比来选定了较高提取率、较短提取时间的方法，并且也不需要上硅胶柱。最佳提取方法为使用甲醇超声提取，时间为20分钟。连翘药品在我国入药使用很多，其药用价值也仍然还有待于进一步深入，才能更好地发挥出其价值。根据本文研究结果我们不难看到，使用hplc这种方法来对连翘苷进行称量，其不确定度的主要来源是对照品，应该定期叫准检验hplc色谱仪，来减小不确定度，提高试验可靠性。本文针对上述问题进行了简要分析。
参考文献
[1]马晓静, 崔业波, 高楠楠. HPLC法测定连翘中连翘苷含量的不确定度评价[J]. 中国药物评价, 2017, 34(3):168-170.
[2]孙晓佳, 纪宏宇, 兰恭赞,等. HPLC法测定乳癖消颗粒中连翘苷的含量[J]. 中国药师, 2016, 19(1):184-186.
[3]吕卓红, 梁欣格, 丁荣徐,等. HPLC同时测定连翘中芦丁、连翘酯苷A和连翘苷含量[J]. 亚太传统医药, 2016, 12(6):42-44.
[4]矫云辉. 近红外光谱法测定双黄连口服液中绿原酸和连翘苷的含量[J]. 东方食疗与保健, 2016(5).
[5]李瑞燕, 韩夏, 程林忠,等. 青翘 老翘 连翘叶中连翘苷含量的比较研究[J]. 长治医学院学报, 2016, 30(2):99-101.
[6] 李亨, 王莹, 刘文文,等. 小儿感冒退热颗粒中连翘苷HPLC测定方法的建立及评价[J]. 特产研究, 2017, 39(2):34-37.
[7] 汪玉萍, 李传响. 高效液相色谱法测定银翘解毒颗粒中连翘苷的含量[J]. 中国现代药物应用, 2017, 11(8):196-197.
论文作者:吴静
论文发表刊物:《世界复合医学》2018年第07期
论文发表时间:2018/10/1
标签：连翘论文; 不确定论文; 含量论文; 溶液论文; 色谱论文; 甲醇论文; 天平论文; 《世界复合医学》2018年第07期论文;