周镜然[1]2001年在《补体攻膜复合物内皮细胞刺激效应及其活化机制的研究》文中研究表明已有的研究资料向人们清楚地显示，亚溶破MAC可活化多种细胞生物学效应，是体内补体过度活化病理效应的重要介导者之一。虽然已经发现MAC沉积后可活化细胞内多种胞内信号分子，但MAC插入膜上后通过何种机制介导胞内信号途径的活化目前仍不清楚。已知MAC插入质膜不需任何受体，除了与已知的两种终末补体调控蛋白C8bp和CD59结合外，目前尚未证实沉积于细胞表面MAC与其它的分子有直接的相互作用。那么，MAC的跨膜信号转导机制究竟是什么？作为一个高度亲脂性蛋白，插入膜上的MAC引起细胞信号传导入脑究竟有什么特殊之处？ 近年研究发现，哺乳动物细胞质膜表面存在主要由糖鞘脂（GSL）、鞘磷脂（SM）及胆固醇聚集形成的膜微区结构，GPI锚固蛋白及其他一些膜分子，特别是一些重要的信号转导分子如Src家族PTK、异叁聚体G蛋白等，相对特异性聚集于其中。Caveolae是多种细胞表面的膜微区形式，因具有特征性的烧瓶样质膜内陷和特征性的结构蛋白caveolin而可与其它的膜微区相区别。大量的研究显示，质膜上的这些膜局限性结构域中聚集着许多重要跨膜信号转导分子，在细胞跨膜信号转导中发挥重要作用。此外，越来越多的细胞生物学行为包括内吞、物质的跨膜转运、膜蛋白的定向分选等均被发现与膜微区的功能相联系。对生理状态下膜微区结构和功能的认识是一个目前研究非常活跃的领域。、在思索MAC的跨膜信号转导的可能机制中，我们发现了以下有意义的线索：第一，已经证实的多种参与MAC活化细胞的信号途径几乎无一例外地被证实与质膜微区相联系，提示MAC可能与caveolae有功能上的联系。第二，MAC在膜上的天然受体C8bP和CD59均为GPI－锚固型蛋白，近年的研究证实W－锚固蛋白成簇分布于膜微区之中。而这些调控蛋白在细胞表面高表达，可迅速地与沉积在膜上的MAC相结合。那么，特异性地定位于特殊的膜微区之中的 CD59儿8bP对 MAC的分布有何影响？是否可介导 MAC定位于膜微区之中？第叁，MAC作为高度亲脂性的复合物，沉积于膜上后可与脂质分子结合，形成胶束区并引起膜脂质重排。那么，MAC是否可与质膜上大量散在分布的膜微区相互作用？ 基于以上的分析，我们大胆设想，MAC沉积至细胞膜上后，可通过与脂质的相互作用而与膜微区产生物理上和功能上的联系。为探明沉积于细胞表面的MAC与膜微区的关系，我们以人血管内皮细胞为模型，建立MAC亚溶破体系并检测其刺激效应：纯化内皮细胞表面的caveolae结构，检测MAC与caved 富集的膜区段之间的关系以及特异性破坏caveolae对MAC介导的内皮细胞活化效应的影响。我们期望通过这一研究，更多地了解MAC与膜上脂质分子的相互作用情况，并从一个新的角度认识eC可能的跨膜信号转导机制。本文的主要研究内容及结果包括： 1．以纯化的补体终末成分体外组装MAC，并以之建立内皮细胞亚溶破模型。其中CS的活化通过蛋氨酸氧化的方法在不裂解CS的条件下获得。这种体外组装策略保证了体系中的刺激因素是真正功能纯的MAC，为进一步深入研究MAC的病理效应及其信号转导机制奠定了良好的基础。 2．在MAC的内皮细胞亚溶破模型中，多角度地检测了亚溶破剂量的MAC对内皮细胞的两种不同途径的分泌－－－－P小体分泌反应和需基因转录的新蛋白合成分泌途径的活化效应，并以激光共聚焦显微镜动态观察MAC沉积引起胞浆＊a‘”j i的变化。结果发现，eC可刺激内皮细胞 W干 ’J’体分泌反应，引起 VWF因子快速释放出胞：亚溶破剂量 MAC可诱导 IL士趋化因子的蛋白合成及分泌；激光共聚焦显微镜下观测到MAC沉积后引起 ·Vlll·的胞浆＊a’”j i增高和钙振荡，并发现不同的细胞在 MAC沉积后＊a‘”j i变化模式存在异质性。 3．低温条件下以非离子型去污剂Trtion《 100纯化内皮细胞表面的caveolae结构，检测沉积于细胞表面的MAC在蔗糖密度梯度离心场中的位置。结果显示，沉积于膜上的MAC特征性地浓聚于低密度去污剂不溶性膜区段中，该区段同时有caveolin的富集，提示MAC与caveolae存在直接的物理联系。以甘露糖胺抑制内皮细胞GPI－锚固蛋白的表达，补体终末成分的分布无明显改变，说明MAC的caveolae分布特性不依赖GPI－锚固蛋白CD59。这是首次报道沉积于质膜表面的MAC与caveolae存在直接的物理联系。 4．在证实MAC与cave01ae徽区结构有直接的物理联系的基础上，以胆固醇结合剂Fn 和Nystatin特异性地破坏细胞表面册veolae结构和功能，观测其对MAC介导的内皮细胞刺激效应的可能影响。结果显示，特异性地破坏caveolae的结构与功能使MAC刺激内皮细胞分泌几E的效应明显减低，但对VWF的分泌没有影响，提示MAC对胞内信号活化依赖caveolae微区结构。此外，特异性抑伟聚集于caveolae 中的Src家族PTK活性后，MAC刺激内皮细胞分泌几干的效应也显着地受到抑制。这一结果提示，eC沉积于细胞表面后，可活化聚集于caveolae中的非
罗娜[2]2006年在《亚溶破补体攻膜复合物对小胶质细胞刺激效应的研究》文中研究指明背景:中枢神经系统(central nervous system,CNS)由于免疫抑制微环境和血脑屏障(blood-brain barrier,BBB)[1]这两道天然屏障的的存在,成为机体组织中的免疫赦免区,但事实上CNS内环境的稳定仍需依靠天然免疫系统的长期监视和保护;其中,CNS内免疫活性最强的小胶质细胞和脑组织自身局部产生的补体系统,作为天然免疫的重要成分,是CNS内重要的防御力量,若它们的的代谢及功能出现紊乱则会导致内环境失衡,炎症爆发,大量炎细胞激活、炎症因子释放等,对自身正常组织产生“旁观杀伤效应”[2, 3]。大量研究显示:阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)是一种临床表现为进行性记忆和后天获得性知识不可逆性损失的渐进性神经退行性疾病,其发病的始动因素是细胞外大量的淀粉样蛋白Aβ(β-amyloid)的沉积,从而促发了小胶质细胞和补体系统的活化失控及功能异常,炎症因子大量释放,最终导致神经纤维缠结、胆碱能神经元丧失,自身神经组织受到损害。AD是一种自身毒性改变而非自身免疫性损伤,炎症反应在其中起到了关键的作用[4]。目前认为,小胶质细胞是CNS内最主要的免疫活性细胞,它既可表现为骨髓源单核细胞系统的吞噬活性,又可表现出活化后的致炎效应。研究证实,AD病变早期,活化小胶质细胞可对Aβ产生吞噬作用,但随着炎症的发展,大量沉积的Aβ不断刺激小胶质细胞活化,使其功能紊乱代谢失衡,对Aβ的吞噬减少,同时分泌大量炎性介质和氧自由基,上调表达多种免疫分子,对神经组织造成损伤并促进炎症的进一步加深[5]。补体系统是CNS内重要的天然免疫防御系统,当病原微生物或炎性介质存在时可被激活最终通过末端成分组装成C5b-9_((n))膜攻击复合物(membrane attack complex, MAC)。C5b-9_((n))是CNS炎症过程中一种多效免疫因子,在补体大量活化后,可插入细胞膜导致细胞溶解死亡,而近年来新的研究发现,非致死剂量的MAC可沉积于中
杨承英[3]2007年在《补体攻膜复合物C5b-9对人外周血单核细胞来源树突状细胞分化成熟及免疫学功能的影响》文中研究指明补体(complement)系统作为天然免疫(innate immunity)中的一类重要和保守的体系,当病原微生物或炎症介质存在时可被激活最终通过末端成分组装成C5b-9膜攻击复合物(membrane attack complex,MAC),为机体提供了快速和高效的清除入侵微生物的途径。MAC是一种多效免疫因子,在补体大量活化后,可插入细胞膜导致细胞溶破死亡,而近年来通过对MAC与有核细胞相互作用的研究,这一观点已发生改变。实验证明:有核细胞能通过囊泡化或内吞作用,清除沉积于细胞膜上的MAC,保护自身免遭补体溶破,此时的MAC称为亚溶破MAC ( sublytic MAC, sMAC )。体外的研究也证实,亚溶破剂量的MAC对多种有核细胞具有刺激和活化作用。近来新的研究发现,非致死剂量的MAC可沉积于中性粒细胞,单核细胞等多种有核细胞,刺激细胞发生多种代谢改变,包括分泌氧自由基、类脂质等炎症介质,并诱导细胞因子、黏附分子以及其他功能蛋白的表达等。补体系统除了补体的直接杀伤机制外,在补体活化过程中释放的多种小片断分子具有广泛的生物学效应,包括趋化中性粒细胞和淋巴细胞、调理吞噬、参与调节细胞和体液免疫应答等等。因此,补体是连接机体天然免疫和获得性免疫(adaptive immunity)的“桥梁”。树突状细胞(dendritic cell,DC)是体内功能最强的专职抗原递呈细胞(antigen-presenting cells,APC),能高效的摄取、加工处理和提呈抗原,具有较强的迁移能力,并能显着地激活初始型T细胞以启动T细胞免疫应答反应,在免疫应答中处于中心调控地位。此外,DC与B细胞以及NK细胞等也存在着相互作用,可见,DC在连接天然免疫和获得性免疫之间起着非常重要的作用。DC是一类异质性的细胞群体,不同的亚群,不同的成熟状态,其免疫学功能特点不同,在免疫应答与免疫耐受、抗肿瘤、抗感染免疫中发挥不同的作用。多种外源或内源因素均可调节DC的分化发育,刺激其成熟以及免疫学功能。但到目前为止,还未见补体攻膜复合物C5b-9与树突状细胞相互作用,特别是补体C5b-9是否影响树突状细胞分化发育成熟已经免疫学功能的相关报道。有研究显示,血液中树突状细胞表面有补体攻膜复合物C5b-9沉积,甚至在培养几天后还能检测到,且树突状细胞的活力也未受影响,在人的滤泡树突状细胞所处的淋巴细胞生发中心也发现了补体攻膜复合物。既然补体和DC均能够连接天然免疫和获得性免疫,且在DC的表面又有C5b-9的沉积,因此我们推测,补体有可能通过调节DC分化发育成熟以及免疫学功能调节机体的免疫应答。为证实这一设想,我们设计并进行了本研究。本研究的完成有助于在免疫应答的调控机制方面获得新的认识,并对补体和DC之间在连接天然免疫和获得性免疫之间的作用及相互关系能有更全面的了解,为进一步从新的角度和思路深入研究DC在抗原特异性免疫应答与免疫耐受中的作用及机制奠定基础。为明确亚溶破C5b-9(sublytic C5b-9, sC5b-9)对树突状细胞分化发育影响,本研究共分叁部分:第一部分,外周血单核来源树突状细胞的诱导。选取38例健康志愿者外周血白膜,Ficoll密度梯度离心获得外周血单个核细胞( peripheral blood mononuclear cell,PBMC),贴壁法分离纯化获得较纯的单核细胞(monocyte),在GM-CSF(50ng/ml)和IL-4(25ng/ml)联合作用下诱导分化为未成熟树突状细胞(immaure dendritic cell, imDC),于诱导的第5d,通过镜下观察细胞形态以及流式检测表面标志,结果显示,贴壁后CD14+单核细胞百分率达87%以上,rhGM-CSF+rhIL-4诱导后,细胞CD1a表达上调,CD14表达下降,说明诱导所获细胞未典型imDC,建立了稳定的体外DC培养体系。第二部分,建立体外DC亚溶破模型。利用C5b6、C7、C8、C9补体蛋白纯品,imDC膜表面组装C5b-9,观察细胞的状态,激光共聚焦检测C5b-9在imDC膜上的组装情况,流式检测组装C5b-9后DC的凋亡情况,LDH释放检测C5b-9对DC的溶破效应。结果显示,C5b-9在imDC膜上组装成功,当C5b6浓度小于0.8μg/ml时,C5b-9对DC膜的完整性没有影响,但当大于0.8μg/ml时,膜完整性随着C5b6浓度的增加破坏加剧,因此确定了C5b-9对DC的体外亚溶破剂量为用小于0.8μg/ml C5b6,10μg/ml C7,10μg/ml C8,10μg/ml C9组装的C5b-9,成功建立体外DC亚溶破模型。第叁部分,sC5b-9对imDC成熟以及免疫学功能的影响。imDC膜上组装sC5b-9,刺激3d后,流式检测细胞表面的成熟分化标志,HLA相关抗原以及共刺激分子的表达;流式分析抗原捕获能力以及抗原捕获相关分子;ELISA检测sC5b-9处理DC细胞因子分泌情况;与同种异体CD4~+T、CD8~+T或CD4~+CD45RA~+T细胞共培养,通过流式分析DC刺激的CD4+T、CD8~+T等表面活化标志、ELISA检测CD4~+T、CD8~+T或CD4~+CD45RA~+T细胞因子分泌情况,明确DC激活T细胞的能力。在各个实验时LPS(1μg/ml)、C5b-8,C5b-7,C5b6,C7,C8,C9同时用于实验。结果显示:与未刺激组相比,sC5b-9处理DC表面分化标志CD14及CD1a变化不显着,成熟标志CD83、HLA相关抗原、共刺激分子CD80、CD86、B7-H1、B7-H3、B7-H4、BTLA等表达上调;sC5b-9处理DC分泌IL-12及TNF-α上调,抗原捕获能力及抗原捕获相关分子降低;sC5b-9处理DC刺激CD4~+T活化及分泌IFN-γ、IL-2能力增强,IL-10变化不显着,但sC5b-9处理DC刺激CD8~+T活化及分泌IFN-γ、IL-2、IL-10均不显着;sC5b-9处理DC与CD4~+CD45RA~+T共培养后检测细胞因子分泌,发现CD4~+CD45RA~+T分泌IL-4降低而IFN-γ增加。以上结果表明,sC5b-9促进的DC成熟,诱导了Th1极化。通过以上叁部分的研究,我们得出如下结论:直接贴壁法能获得相对较纯的单核细胞,利用rhGM-CSF联合rhIL-4贴壁的单核细胞,隔日半量补充细胞因子,在第5d能获得典型的imDC。利用补体蛋白纯品C5b6、C7、C8、C9在合适条件下能体外于imDC膜表面组装C5b-9,当补体纯品C5b6浓度小于0.8ug/mL时,组装的C5b-9为亚溶破型。sC5b-9能促进imDC向成熟DC转变,同时抗原捕获能力降低,IL-12和TNF-α分泌上调;sC5b-9处理DC同种异体混合淋巴细胞反应能力增加,激活CD4~+T细胞能力提高并诱导初始T细胞Th1极化。综上所述,作为天然免疫重要组成部分的补体系统,除了能够直接杀伤入侵的病原微生物外,还可以通过在活化形成的攻膜复合物C5b-9调控机体内最重要的抗原提呈细胞—DC的成熟以及免疫学功能,从而发挥免疫调控作用。上述研究结果对于深入认识天然免疫和获得性免疫之间的作用以及相互关系,探讨获得性免疫的启动以及维持自身免疫耐受的机制等提供了实验线索。
周镜然, 白云, 朱锡华[4]2000年在《补体攻膜复合物细胞非致死性效应及其信号转导机制》文中研究指明有核细胞能通过自身机制抵抗同源补体溶破 ,同时亚溶破 MAC在细胞膜上沉积后 ,能刺激多种细胞的多种生物学活性改变 ,包括产生活性氧、释放花生四烯酸及其代谢产物、产生多种细胞因子、诱导膜蛋白表达和诱导细胞进入细胞周期等 ,此称 MAC的细胞非致死效应。这些效应是由 MAC活化细胞跨膜信号转导机制介导的。
罗娜, 白云, 周静然[5]2006年在《人补体杀伤小鼠N9小胶质细胞及亚溶破模型的建立》文中研究说明目的:探讨正常人血清(norm al hum an serum,NHS)补体杀伤小鼠N9小胶质细胞的机制,建立人补体攻膜复合物(sub lytic m embrane attack comp lex,sMAC)N9细胞亚溶破刺激模型。方法:用阻断补体活化途径的方法探讨N9细胞活化人补体系统的机制;采用微量补体反应性溶破法,以酵母多糖(Zymosan,Z)活化急性期病人血清制备补体优球蛋白C56,EDTA-NHS作为C7-C9的来源,组装N9细胞sMAC亚溶破模型;CCK-8比色实验确定sMAC亚溶破剂量;激光共聚焦鉴定sMAC沉积;脱落细胞计数及台盼蓝拒染法分别判定细胞黏附力变化及脱落细胞活力。结果:未致敏N9细胞可通过旁路途径直接活化人血清补体系统;当C56稀释度在1∶500以上,NHS(含1 mmol/L EDTA)稀释度为1∶20时,膜攻击复合物(m embrane attack comp lex,MAC)活性逐渐降低,细胞溶破减少,确定C56 1∶500,NHS 1∶20为N9细胞亚溶破补体量;激光共聚焦鉴定sMAC沉积于N9细胞表面;亚溶破剂量MAC刺激N9细胞后与对照组相比细胞脱落增加(P<0.05),而细胞活力正常。结论:探讨了小鼠N9细胞活化人补体的机制;通过建立N9细胞人补体sMAC亚溶破模型,证实sMAC刺激N9细胞后可降低细胞黏附力但不影响细胞活力;为sMAC对中枢神经系统小胶质细胞亚溶破刺激效应的深入研究提供了理论与实验基础。
参考文献：
[1]. 补体攻膜复合物内皮细胞刺激效应及其活化机制的研究[D]. 周镜然. 第叁军医大学. 2001
[2]. 亚溶破补体攻膜复合物对小胶质细胞刺激效应的研究[D]. 罗娜. 第叁军医大学. 2006
[3]. 补体攻膜复合物C5b-9对人外周血单核细胞来源树突状细胞分化成熟及免疫学功能的影响[D]. 杨承英. 第叁军医大学. 2007
[4]. 补体攻膜复合物细胞非致死性效应及其信号转导机制[J]. 周镜然, 白云, 朱锡华. 免疫学杂志. 2000
[5]. 人补体杀伤小鼠N9小胶质细胞及亚溶破模型的建立[J]. 罗娜, 白云, 周静然. 贵阳医学院学报. 2006
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