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摘要：目的：探究可溶性PD-L1分子在结核性胸腔积液中的表达特性及其生物学意义。方法：选取86例于2016年6月~2017年6月至本院呼吸科诊治的胸腔积液患者，按照积液性质将其分为A组（结核性胸腔积液，30例）、B组（恶性胸腔积液，38例）、C组（非结核、非恶性胸腔积液，18例）。观察并记录三组患者的临床资料与胸腔积液，采用ELISA法检测患者胸腔积液sPD-L1水平，FCM法检测胸腔积液中CD4+T细胞、CD8+T细胞的表达以及PD-1在CD4+T细胞、CD8+T细胞、CD14+单核细胞的表达和PD-L1在CD14+单核细胞的表达。患者ROC曲线分析sPD-L1在结核性胸腔积液中的诊断价值。结果：A组sPD-L1含量以及CD8+细胞比例、PD-L1在CD14+单核细胞表达比例均明显高于B、C两组，比较差异具有统计学意义（P＜0.05）；ROC曲线分析结果表明，单因素分析A组胸腔积液sPD-L1的诊断敏感度为82.6%，特异度为82.9%。结论：不同病因所造成的胸腔积液微环境具有不同的免疫功能状态，sPD-L1分子可对此作出有效反应，因此可被广泛用于结核性胸腔积液的临床诊断。
关键词：可溶性PD-L1分子；结核性胸腔积液；表达特性；生物学意义
现阶段，通过胸腔穿刺获得胸腔积液，并在此基础上分析其细胞学及病原学依据是进行胸腔积液病因诊断的主要方法。对于不明原因的胸腔积液诊断，局部麻醉下给予患者内科胸腔镜直视活检技术显然更优于传统的盲目胸膜活检，但对于因各种原因无法行胸腔镜术的患者而言，为明确诊断仍需探究其他更具敏感性与特异性的生物学指标[1]。研究发现，PD-L1（程序性死亡配体1）在多种免疫细胞表面的表达增高，且与机体的免疫机制密切相关[2]，但目前学术界关于PD-L1的文献并不多。基于此，本文选取了86例至本院就诊的胸腔积液患者，探究可溶性PD-L1分子在结核性胸腔积液中的表达特性及其生物学意义，现将研究过程及结果报告如下。
1 资料与方法
1.1一般资料
本研究选取86例于2016年6月~2017年6月至本院呼吸科诊治的胸腔积液患者，按照积液性质将其分为A组（结核性胸腔积液，30例）、B组（恶性胸腔积液，38例）、C组（非结核、非恶性胸腔积液，18例）。A组中，男性18例女性12例；年龄22~85岁，平均（55.6±8.9）岁。B组中，男性22例女性16例；年龄21~88岁，平均（56.7±9.0）岁。C组中，男性12例女性6例；年龄23~87岁，平均（57.2±8.8）岁。两组在性别、年龄等一般资料上的比较差异不具有统计学意义（P＞0.05），具有可比性。
1.2纳入标准
纳入本次研究的所有患者的抗人免疫缺陷病毒抗体均为阴性，且需排除以下人员：
①胸部有外伤（史）者；②此前接受过抗结核药物、糖皮质激素、免疫抑制剂或非甾体类抗炎药物治疗者。
1.3检测方法
1.3.1标本收集与处理
3组患者入院24h内均经胸腔穿刺抽取50mL胸腔积液，再经肝素抗凝后离心收集上清，置于-80℃环境中冻存。剩余沉淀细胞则经PBS重悬，应用Ficoll密度梯度离心法将其小心叠加于Ficoll液面上，离心30min（20℃，1800rpm）后吸取白膜层，经无菌PBS洗涤3次后得沉淀细胞，分离出胸腔积液单个核细胞。
1.3.2测定胸腔积液sPD-L1的表达水平
应用pH值为9.3的0.01mol/L的碳酸盐缓冲液将2H11单克隆抗体调整为3mg/L，将其置于温度设置为40℃的100μl/孔包被ELISA板中过夜。应用含0.1吐温-20的PBS洗涤3次，再应用2%的小牛血清蛋白，37℃封闭1h。PBS洗涤3次后分别将25.00、12.50、6.25、3.13、1.56、0.78、0.39、0μg/L以及100μl/孔的融合蛋白稀释液加入其中，37℃环境下反应2h，再次应用PBS洗涤3次；分别将1mg/L、100μl/孔的生物素标记的二抗-10D7加入，37℃环境下反应1h，再次应用PBS洗涤3次；加入1：2000、100μl/孔的HRP，37℃环境下反应45~60min，PBS洗涤6~8次。最后再加入100μl/孔的TMB显色剂，室温避光环境下反应10~15min，应用2mmol/L的50μl/孔硫酸终止反应。
2.3流式细胞术检测
本次研究应用流式细胞术（FCM）来检测胸腔积液中PD-1、PD-L1的表达。应用PBS洗涤2~3次胸腔积液单个核细胞，计数后取约5×105个细胞于每一流式管，分别将CD4-FITC、CD8-FITC、CD14-FITC、PD-1-PE以及PD-L1-PE抗体加入，置于4℃避光环境中孵育30min后采用PBS洗涤2次。上机检测前先加入500μl的鞘液。
1.4统计学分析
应用GraphPad Prism5.0以及SPSS22.0来作图、分析数据，采用均数±标准差的方式表示正态分布的数据，两组间比较行t值检验；多组间比较行单因素方差分析，当P＜0.05时视为比较差异具有统计学意义。
2 结果
2.13组胸腔积液中sPD-L1含量的比较
经分析，A组胸腔积液中sPD-L1含量明显高于B、C两组，比较差异具有统计学意义（P＜0.05）。具体数据见表1。
表1 3组胸腔积液中sPD-L1含量的比较
2.3sPD-L1对结核性胸腔积液的诊断价值分析
经ROC曲线分析，单因素分析A组胸腔积液sPD-L1的诊断敏感度为82.6%，特异度为82.9%，曲线下面积为0.834。较之在腺苷脱氨酶＜45U/L几亚组的分析结果（敏感度：70.0%，特异度：84.1%）[3]，比较差异具有统计学意义（P＜0.05）。
3 讨论
在人类自身免疫性疾病、感染性疾病以及肿瘤免疫中，PD-1与PD-L1负性调节信号对于效应性T细胞功能的抑制、T细胞活化和细胞因子的减弱有着重要作用。作为PD-L1的可溶性形式，sPD-L1可与T细胞表面的PD-1受体相结合后发挥负性免疫调节作用[4]。本组实验结果显示，结核性胸腔积液患者的sPD-L1含量以及CD8+细胞比例、PD-L1在CD14+单核细胞表达比例均明显高于恶性胸腔积液与非结核、非恶性胸腔积液者，比较差异均具有统计学意义（P＜0.05）。此外，ROC曲线分析结果显示，sPD-L1在结合性胸腔积液的临床诊断中也具有较好的敏感性与特异性[5]。
总而言之，可溶性PD-L1分子可显著反映不同病因所造成的胸腔积液局部微环境下的免疫功能状态，其在结核性胸腔积液中的异常高表达对于正确的临床诊断有着重要意义。
参考文献：
[1]邬旦蓉，廖于峰，马建波，陈军锋，邹俊勇.细胞游离miR-185、miR-134、miR-22和CEA组合谱对肺癌相关的恶性胸腔积液诊断价值研究[J].中国卫生检验杂志，2018（17）：2053-2056+2063.
[2]张佳，张峰波，赵云娟，李奇凤，张春桃，李凡，丁剑冰.肺结核患者血清中sPD-1和sPD-L1与细胞因子的相关性研究[J].新疆医科大学学报，2017，40（02）：131-135.
[3]李光明，陆小娜，方育霞.胸腔积液腺苷脱氨酶在诊断结核性胸膜炎中的价值[J].实用医学杂志，2012，28（20）：3429-3430.
[4]武晓，徐德祥，刘凤娟.结核性胸腔积液病人危险因素多元回归分析[J].青岛大学医学院学报，2013，49（06）：515-517.
[5]黄小伟，王飞，聂森，沈晓霞，吴洁.结核性渗出性胸膜炎及恶性胸腔积液患者CEA、ADA联合检测及ROC分析[J].安徽医药，2014，18（08）：1475-1477.
论文作者:蒋莎莉
论文发表刊物:《中国误诊学杂志》2018年第29期
论文发表时间:2018/11/28
标签：胸腔论文; 积液论文; 细胞论文; 患者论文; 结核性论文; 统计学论文; 意义论文; 《中国误诊学杂志》2018年第29期论文;